禽流感的实验室诊断.ppt
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(发病群不足5只则全部采样)。样品应包括：泄殖腔(新 鲜粪尿样)棉拭子和气管棉拭子(置于缓冲液中)；气管和 肺的混样；肠管及内容物的混样；肝、脾、肾和脑等其 他组织样品(不能混样)。
• 组织样品、气管棉拭子单独放人容器，容器中盛放
含有抗生素(pH值为7．0～7．4)的PBS液。抗生素的选 择应视当地情况而定，组织和气管拭子悬液中加入青霉 素(20001U／ml)、链霉素(2mg／ml)或庆大霉素(50t~g ／m1)。肠管及内容物、粪便样品和泄殖腔棉拭子所用 的抗生素浓度应提高5倍(加入抗生素后PBS液的pH值应 调至7．0-7．4)。
• 2)血样 分别采集至少10个病禽的(急性发
病期血清，如发病群不足10只则全部采样)， 并要求单独存放，不能混合。
2．病毒的分离鉴定
• 以无菌拭子采集气管或泄殖腔病料或病变组织，研磨制
成10％悬液，经处理后接种9-11日龄SPF鸡胚，收获尿囊 液测定血凝活性，若为阴性则应继续盲传2～3代。对具有 血凝活性的尿囊液需先用ND抗血清做HI试验，以排除新 城疫的可能，即使ND阳性也应采用中和法继续传代，看 是否为ND与AIV混合感染。然后用免疫扩散等方法来检测 特异性核心抗原NP或MP，然后用血凝抑制试验和神经氨 酸酶抑制试验鉴定A型流感病毒亚型。分离鉴定的同时， 进行致病力试验，确定毒力的强弱。
• 对于禽流感传统的病原学诊断方法是用鸡
胚或者狗肾细胞(MDCK)、鸡胚成纤维细胞 (CEF)等进行病毒分离，采用血凝和血凝抑 制进行鉴定，血清学的诊断方法则包括中
和试验和琼脂扩散试验等。
• 近年来，随着免疫学和分子生物学技术的
飞速发展，禽流感的诊断技术也越来越完
善，现在已经有免疫印迹、免疫荧光、 ELISA、墓因芯片、RT-PCR技术、荧光RTPCR技术、NASBA技术等。
禽流感的实验室诊断
第八组
什么是禽流感?
禽流感是禽流行性感冒的简称，它是一 种甲型流感病毒的一种亚型（也称禽流感 病毒） 引起的传染性疾病，被国际兽疫局 定为甲类传染病.
• 高致病性禽流感H5N1:最严重，发病率高，
死亡率高.
• 低致病性禽流感H9N2/H7N7 ：呼吸道症
状轻，食量减少，产蛋量下降,零星死亡.
1．样品采集
• 样品采集的质量是进行禽流感检测的关
键。应从死禽和处于急性发病期的病禽采 集样品，样品要具有典型性。采样过程要 注意无菌操作，同时避免污染环境。采样 人员要按NY／丁7(38要求加强个人防护。 样品的保存和运输也要按照有关的规定和 要求进行。
• (1)病料样品 至少从5只病禽和病死禽中采集病料样品
定的效果。免疫荧光用于禽流感的诊断具有快速 (2h之内)、特异和敏感性高的特点，但是其不能 鉴别HA和NA亚型，而且需要特殊的设备(荧光显 微镜)，且工作人员需具有一定的经验，所以在基 层检测单位推广应用具有一定的局限性。
• ②如果致死l一5只易感鸡，而且又不是H5或H7亚型，则将
其接种鸡胚成纤维细胞(CEF)或MDCK细胞，在没有胰酶的 情况下观察是否产生细胞病理变化，如不产生病理变化， 该流感病毒就不是HPAIV；
• ③对于所有的低致病性H5和H7亚型病毒和其他流感病毒，
如果在没有胰酶的条件下在细胞培养能生长，则必须测定 血凝素裂解部位的氨基酸顺序，如果相似于其他的HPAIV， 存在多个碱性氨基酸序列，则该受检病毒被视为高致病性。
• 非致病性禽流感 ：无症状， 仅使染病
的禽鸟体内产生病毒抗体。
禽流感病毒图解
• 由A型流感病毒引起的禽流感，其临床症状因感染
禽的年龄、种类、饲养管理水平、并发感染情况 及新感染毒株的毒力等不同而表现不一致。其病 理变化因感染病毒株毒力的高低、病程的长短及 种类不同也不尽相同。因此，禽流感的诊断一直 依赖于病原的分离鉴定，OIE也一直采取的是进行 病毒分离鉴定这个黄金标准。随着血清学实验技 术和生物工程技术的飞速发展，禽流感诊断技术 的研究也取得了新的进展。
• 对一株杂交瘤细胞分泌的流感病毒的单克隆抗体
进行检测时，发现间接固相免疫荧光技术的敏感 性比HI高40～150倍。间接免疫荧光技术也可以 用来检测核蛋白(N尸)和基质蛋白(M1)抗原与抗体 的反应，其敏感性很高。该反应对抗原制备要求 较高，需用非离子型去污剂对纯化的病毒粒进行 裂解。
• 由于单克隆抗体的问世，大大提高了免疫荧光测
• 如果要检验是否是高致病性禽流感病毒，
在进行HA亚பைடு நூலகம்鉴定之后，还需要进行细胞 培养、动物试验或进行裂解位点的序列分
析等进行判断。
OIE判断HPAIV的标准是：
• ①含流感病毒尿囊液，做l：10稀释，静脉内接种8只4～8
周龄易感鸡，每只0．2ml，如在10天内死亡6只以上，则 该流感病毒为HPAIV~
• 鸡胚培养法的优点 鸡胚的组织分化程度低，
可选择适当途径接种，病毒易复制，感染 病毒的膜和液体含大量病毒；鸡胚是个整 体，有神经血管的分布及脏器的构造；来 源充足，操作简单，通常是无菌的，对接 种的病毒不产生抗体。3天可报告结果。病 毒分离鉴定对AI的诊断比较确实，但操作 程序繁杂，费用高，耗时费力。
免疫荧光技术(IFT)诊断禽流感
• 免疫荧光技术就是荧光抗体技术(FAT)。IFT
最早用于病毒的鉴定和定位病毒感染细胞 中特异性抗原，主要是核内荧光。用M1抗 原的荧光抗体主要出现胞质荧光，核内也 有部分荧光。
• IFT早在1961年就开始用于人类流感的快速诊断，1984年
宾夕法尼亚州暴发禽流感时Skeeles将IFT首次用于AIV的 检测。用于禽流感病毒的诊断常用直接荧光抗体法，即在 组织触片上直接染色、以荧光显微镜检查荧光。一种AIV 的荧光抗体可用来检测不同亚型的其他病毒。IFT用于禽 流感的诊断具有快速、简便和敏感性好的特点，而且检测 成本费用相对较低，其敏感度与病毒的分离鉴定相当，有 时高于用鸡胚进行的病毒分离。但是需要注意的是如何避 免和降低标本中出现的假阳性(即非特异性荧光)问题。
• 组织样品、气管棉拭子单独放人容器，容器中盛放
含有抗生素(pH值为7．0～7．4)的PBS液。抗生素的选 择应视当地情况而定，组织和气管拭子悬液中加入青霉 素(20001U／ml)、链霉素(2mg／ml)或庆大霉素(50t~g ／m1)。肠管及内容物、粪便样品和泄殖腔棉拭子所用 的抗生素浓度应提高5倍(加入抗生素后PBS液的pH值应 调至7．0-7．4)。
• 2)血样 分别采集至少10个病禽的(急性发
病期血清，如发病群不足10只则全部采样)， 并要求单独存放，不能混合。
2．病毒的分离鉴定
• 以无菌拭子采集气管或泄殖腔病料或病变组织，研磨制
成10％悬液，经处理后接种9-11日龄SPF鸡胚，收获尿囊 液测定血凝活性，若为阴性则应继续盲传2～3代。对具有 血凝活性的尿囊液需先用ND抗血清做HI试验，以排除新 城疫的可能，即使ND阳性也应采用中和法继续传代，看 是否为ND与AIV混合感染。然后用免疫扩散等方法来检测 特异性核心抗原NP或MP，然后用血凝抑制试验和神经氨 酸酶抑制试验鉴定A型流感病毒亚型。分离鉴定的同时， 进行致病力试验，确定毒力的强弱。
• 对于禽流感传统的病原学诊断方法是用鸡
胚或者狗肾细胞(MDCK)、鸡胚成纤维细胞 (CEF)等进行病毒分离，采用血凝和血凝抑 制进行鉴定，血清学的诊断方法则包括中
和试验和琼脂扩散试验等。
• 近年来，随着免疫学和分子生物学技术的
飞速发展，禽流感的诊断技术也越来越完
善，现在已经有免疫印迹、免疫荧光、 ELISA、墓因芯片、RT-PCR技术、荧光RTPCR技术、NASBA技术等。
禽流感的实验室诊断
第八组
什么是禽流感?
禽流感是禽流行性感冒的简称，它是一 种甲型流感病毒的一种亚型（也称禽流感 病毒） 引起的传染性疾病，被国际兽疫局 定为甲类传染病.
• 高致病性禽流感H5N1:最严重，发病率高，
死亡率高.
• 低致病性禽流感H9N2/H7N7 ：呼吸道症
状轻，食量减少，产蛋量下降,零星死亡.
1．样品采集
• 样品采集的质量是进行禽流感检测的关
键。应从死禽和处于急性发病期的病禽采 集样品，样品要具有典型性。采样过程要 注意无菌操作，同时避免污染环境。采样 人员要按NY／丁7(38要求加强个人防护。 样品的保存和运输也要按照有关的规定和 要求进行。
• (1)病料样品 至少从5只病禽和病死禽中采集病料样品
定的效果。免疫荧光用于禽流感的诊断具有快速 (2h之内)、特异和敏感性高的特点，但是其不能 鉴别HA和NA亚型，而且需要特殊的设备(荧光显 微镜)，且工作人员需具有一定的经验，所以在基 层检测单位推广应用具有一定的局限性。
• ②如果致死l一5只易感鸡，而且又不是H5或H7亚型，则将
其接种鸡胚成纤维细胞(CEF)或MDCK细胞，在没有胰酶的 情况下观察是否产生细胞病理变化，如不产生病理变化， 该流感病毒就不是HPAIV；
• ③对于所有的低致病性H5和H7亚型病毒和其他流感病毒，
如果在没有胰酶的条件下在细胞培养能生长，则必须测定 血凝素裂解部位的氨基酸顺序，如果相似于其他的HPAIV， 存在多个碱性氨基酸序列，则该受检病毒被视为高致病性。
• 非致病性禽流感 ：无症状， 仅使染病
的禽鸟体内产生病毒抗体。
禽流感病毒图解
• 由A型流感病毒引起的禽流感，其临床症状因感染
禽的年龄、种类、饲养管理水平、并发感染情况 及新感染毒株的毒力等不同而表现不一致。其病 理变化因感染病毒株毒力的高低、病程的长短及 种类不同也不尽相同。因此，禽流感的诊断一直 依赖于病原的分离鉴定，OIE也一直采取的是进行 病毒分离鉴定这个黄金标准。随着血清学实验技 术和生物工程技术的飞速发展，禽流感诊断技术 的研究也取得了新的进展。
• 对一株杂交瘤细胞分泌的流感病毒的单克隆抗体
进行检测时，发现间接固相免疫荧光技术的敏感 性比HI高40～150倍。间接免疫荧光技术也可以 用来检测核蛋白(N尸)和基质蛋白(M1)抗原与抗体 的反应，其敏感性很高。该反应对抗原制备要求 较高，需用非离子型去污剂对纯化的病毒粒进行 裂解。
• 由于单克隆抗体的问世，大大提高了免疫荧光测
• 如果要检验是否是高致病性禽流感病毒，
在进行HA亚பைடு நூலகம்鉴定之后，还需要进行细胞 培养、动物试验或进行裂解位点的序列分
析等进行判断。
OIE判断HPAIV的标准是：
• ①含流感病毒尿囊液，做l：10稀释，静脉内接种8只4～8
周龄易感鸡，每只0．2ml，如在10天内死亡6只以上，则 该流感病毒为HPAIV~
• 鸡胚培养法的优点 鸡胚的组织分化程度低，
可选择适当途径接种，病毒易复制，感染 病毒的膜和液体含大量病毒；鸡胚是个整 体，有神经血管的分布及脏器的构造；来 源充足，操作简单，通常是无菌的，对接 种的病毒不产生抗体。3天可报告结果。病 毒分离鉴定对AI的诊断比较确实，但操作 程序繁杂，费用高，耗时费力。
免疫荧光技术(IFT)诊断禽流感
• 免疫荧光技术就是荧光抗体技术(FAT)。IFT
最早用于病毒的鉴定和定位病毒感染细胞 中特异性抗原，主要是核内荧光。用M1抗 原的荧光抗体主要出现胞质荧光，核内也 有部分荧光。
• IFT早在1961年就开始用于人类流感的快速诊断，1984年
宾夕法尼亚州暴发禽流感时Skeeles将IFT首次用于AIV的 检测。用于禽流感病毒的诊断常用直接荧光抗体法，即在 组织触片上直接染色、以荧光显微镜检查荧光。一种AIV 的荧光抗体可用来检测不同亚型的其他病毒。IFT用于禽 流感的诊断具有快速、简便和敏感性好的特点，而且检测 成本费用相对较低，其敏感度与病毒的分离鉴定相当，有 时高于用鸡胚进行的病毒分离。但是需要注意的是如何避 免和降低标本中出现的假阳性(即非特异性荧光)问题。