酶联免疫法测定食品中黄曲霉毒素

的产物，加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色，在 450nm 处测量，吸收光强度与
样品中黄曲霉毒素 B1 的浓度呈负相关。
三、实验器材
1、ELISA 试剂盒
其组成如下：
1.1 包被抗体的反应板
48 孔
1.2 A 试剂：样品稀释液
l瓶
1.3 B 试剂：AFB1 标准溶液
l 套(0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2 ng/mL)
1.2.2 取适量 E 试剂(浓缩洗涤液)用超纯水稀释 20 倍待用。例如：取 3mL E 试剂(浓缩
洗涤液)，加 57mL ຫໍສະໝຸດ Baidu纯水，混匀后制成实验用洗涤液，足够 24 孔使用。
2、 操 作 步 骤
2.1 试剂平衡：将测试盒于室温中放置 15min 以上，平衡至室温。
2.2 小孔编号：根据实验需要截取相应孔数放置反应板框架上。设定 l 号孔为仪器调
零孔，2-7 号孔为 AFB1 标准对照孔，其余孔为样品孔。 2.3 洗涤：每孔加入 250µL 左右洗涤液，洗涤液不得溢出，放置 1min 后，甩掉洗涤液，
在吸水纸上拍干，重复洗板一次。
2.4 反应组成：按下列步骤所示（见表 1），依次加入配制好的溶液及待测样液。
第一步：l 号孔加入 50µL A 试剂(样品稀释液)，2-7 号孔分别加入系列的 B 试剂
将系列 AFB1 标准溶液(0，0.1，0.25，0.5，1，2ng/mL)测得的吸光度 A 值，绘制 成标准曲线(见示意图)。横坐标为标准液浓度的常用对数值(1gC)，纵坐标为各标准液 孔 A 值与 0ng/mL 标准液孔的 A 值的比值(A（标准液）／A（0ng/mL））（若同时有平行实验数据，
(AFB1 标准溶液：0，0.1，0.25，0.5，1，2ng/mL) 50µL，其余孔加入相应的待测样液。
第二步：l 号孔加入 50µL D 试剂(酶标抗原稀释液)，其余各孔均加入 50µL C 试
剂（酶标抗原溶液）。
第三步：轻轻地振摇，使各孔中的反应物混合均匀。
操作次序 加入量 1
1
50 µL
A
AFB 1含量（ng
/
g）=
V C
D
m
式中：
C：待测样液中 AFB1 含量(ng/mL) V：样品提取液体积(mL)
m：样品质量(g)
D：样品稀释倍数
则 A 及 A0 分别取其平均值，下同）。
黄曲霉毒素 B 1 标准曲线示意图(注：仅供参考)
计算待测样品孔 A 值与 A(0ng/mL)的比值(A 样品/A（0ng/mL）)，查标准曲线，可得到相应
待测样液浓度(C)的常用对数值 lgC，对其求反对数，可求得待测样液的 AFB1 浓度 C。
按下列公式计算出样品中 AFB1 的含量：
样品去皮粉碎(刀切或剪切)，称取 5.0g 于 100mL 具塞三角瓶中。加入 25.0mL 甲 醇水(1+1)溶液和 20mL 正已烷(或石油醚)，于振荡器上剧烈震荡 l0min，过滤于分液漏 斗中，静置分层，放出下层甲醇水提取液，此液为样品提取液，根据样品的国家允许 量标准，用 A 试剂(样品稀释液)将提取液进行适当稀释（如 100µL 样品提取液+300µL 样品稀释液，总稀释 20 倍），即为待测样液。 1.1.3 一般饲料及原料
称取 5.0g 样品(已粉碎)于 100mL 具塞三角瓶中，准确加入 25.00mL 甲醇水(1+1) 溶液，于振荡器上剧烈震荡 15min，过滤，弃去 l/4 初滤液，收集试样滤液，此液为样 品提取液。根据样品的国家允许量标准，用 A 试剂(样品稀释液)将样品提取液进行适 当稀释（如 100µL 样品提取液+100µL 样品稀释液，总稀释 10 倍），即为待测样液。 1.1.2 花生
酶联免疫法测定食品中黄曲霉毒素
一、实验目的
了解 ELISA 的基本原理，及其优缺点； 掌握间接 ELISA 法的试验操作过程。
二、实验原理
酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，简称 ELISA）是免疫酶
技术的一种。本方法测定的基础是抗原抗体反应，微孔板包被有针对黄曲霉毒素 B1
2
50 µL D
3
表 1 反应物组成
孔号 234567
0 0.1 0.25 0.5 1
2
C
C
C
C
C
C
混匀
8 9 10 11 12
……待测样液……
C
C
C
C
C
2.5 反应：将反应板放入 37℃恒温培养箱中孵育 30min。 2.6 洗涤：取出反应板，用力甩掉反应液，拍干。每孔加入 250µL 左右洗涤液，洗涤 液不得溢出，放置 2min 后，甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板 4 次。 2.7 显色：每孔分别加入 F 试剂(显色底物液 a)和 G 试剂(显色底物液 b)各 50µL，摇匀， 将反应板放入 37℃恒温培养箱中显色 15min。 2.8 终止与仪器测定：每孔分别加入 H 试剂（终止液)50µL，摇匀后用酶标测定仪在 450nm 波长处测定各孔的吸光度 A 值。 3、 试 样 测 定 与 结 果 计 算
1.4 C 试剂：酶标抗原
l瓶
1.5 D 试剂：酶标抗原稀释液 l 瓶
1.6 E 试剂：浓缩洗涤液
l瓶
1.7 F 试剂：显色底物液 a
l瓶
1.8 G 试剂：显色底物液 b
l瓶
1.9 H 试剂：终止液
l瓶
1.10 反应板框架
l块
2、 仪 器
1.1 酶标仪(内置 450nm 滤光片)
1.2 50µL 微量移液器及配套吸头
称取 5.0g 样品于 100mL 具塞三角瓶中，准确加入 25.0mL 甲醇水(1+1)溶液，于振 荡器上剧烈震荡 15min，过滤，弃去 1/4 初滤液后收集滤液，此液为样品提取液。根据 样品的国家允许量标准，用 A 试剂(样品稀释液)将样品提取液进行适当稀释（如 100µL 样品提取液+900µL 样品稀释液，总稀释 50 倍），即为待测样液。 1.2 试剂的配制 1.2.1 每瓶 C 试剂（酶标抗原）中准确加入 1.5mL D 试剂(酶标抗原稀释液)，充分溶解， 配成实验用酶标抗原溶液，2～8℃保存。
1.3 恒温培养箱(0℃-50℃)
1.4 冰箱(4℃-8℃)
1.5 感量 0.0lg 的天平 1.6 调速振荡器或超声波清洗器 1.7 离心机 5000r/min 1.7 玻璃器皿：具塞锥形瓶，烧杯，分液漏斗，普通漏斗，量筒，具塞试管，滴管，移 液管等 1.8 小型粉碎机或碾钵 1.9 其它：滤纸，吸水纸等 四、实验步骤 1、 实 验 准 备 1.1 样品处理：详见试剂盒说明书所列“样品处理方法”及“黄曲霉毒素国家允许量标 准及样品稀释表” 1.1.1 脂肪含量小的固体样品(如大米、玉米、小米等)
（Aflatoxin B1，AFB1）的特异性单克隆抗体，加入黄曲霉毒素标准品（或样品溶液）
及黄曲霉毒素 B1 酶标记物，标准品（或样品溶液）中的游离黄曲霉毒素 B1 与黄曲霉
毒素 B1 酶标记物竞争黄曲霉毒素 B1 抗体，没有连接抗体的酶标记物在洗涤步骤中被
除去。将基质/发色剂加入到孔中并且孵育，结合的酶标记物将基质/发色剂转化为蓝色