第9章 多克隆抗体技术
多克隆抗体制备ppt课件
鸡的IgG常称IgY,其特点是不会激活哺乳动物的补体 成分C1,也不会与细菌蛋白A或蛋白质G、哺乳动物 的Fc受体或类风湿因子等发生反应。在极端条件下, 鸡IgY的稳定性不如家兔IgG,不过,鸡的IgY在鸡蛋内 可保持稳定达数月之久,纯品IgY在中性缓冲液和冷藏 条件下则可保存数年之久。用鸡IgY已经制备出Fc和 单价的Fab或Fab′等片段。
(三) 效应阶段(effective stage) 此阶段是由活化的效应细胞(CTL 与 TD 或 TDTH)和效应分子(抗体与细胞因子)发挥细胞免疫效应和体液免疫效应的 过程。这些效应细胞和效应分子共同作用清除抗原异物。
多克隆抗体制备
多克隆抗体制备
初次应答(primary response)
机体初次接受适量的抗原刺激后，引起体内抗体产生的过程 称为初次应答，主要特点为： ①机体初次接触抗原后，需经一定的潜伏期血清中才能出现 抗体，潜伏期的长短取决于抗原的性质、抗原进入机体的途 径、所用的佐剂类型、受体情况等，潜伏期之后为抗体的对 数上升期，抗体含量直线上升，然后为持续期，抗体产生和 排出相对平衡，最后为下降期； ②初次应答最早产生的抗体为 IgM，可在几天内达到高峰， 然后开始下降，接着才产生 IgG，IgG 抗体产生的潜伏期比 IgM 长，如果抗原剂量少，可能仅产生 IgM，IgA 产生最迟， 而且含量少； ③初次应答产生的抗体总量较低，维持时间也短，通常以 IgM 为主，且抗体的平均亲和力较低。
多克隆抗体制备
再次应答(secondary response)
机体再次接触相同的抗原时，体内产生抗体的过程 称为再次应答或回忆应答(anamnestic response)，主 要特点为：
多克隆抗体的原理及制作方法
多克隆抗体的原理及制作方法一、原理多克隆抗体是由针对多种不同抗原表位的抗体组成的混合物。
外源性抗原初次进入动物体内后，可引发机体初次免疫应答，即在抗原呈递细胞（antigenpresenting cell，APC）和T细胞的作用下，未成熟B细胞被激活分化为产生抗体的浆细胞，对于大多数可溶性蛋白抗原而言，动物注射后5～7天，血清中开始出现抗体，并在12天左右达到顶峰，然后逐渐下降。
初次免疫应答产生的抗体持续时间较短，亲和力也较低。
但是受抗原刺激的B细胞除了分化为抗体产生细胞外，还增殖形成大量记忆性B细胞，它们在实施加强免疫时被快速激活，加强免疫后抗体滴度迅速上升，并持续更长时间，抗体合成率也比初次反应增加几倍到几十倍，加强免疫后7～14天出现抗体的峰值。
由于记忆B细胞的存在，需要更少的抗原刺激即可引起再次免疫应答。
记忆B细胞是长寿细胞，因此，特异性抗体应答在最后一次加强免疫之后6个月到一年都会存在。
本节介绍用佐剂乳化的抗原免疫动物获得多克隆抗血清的方法。
该法可用于免疫家兔，小鼠、大鼠或地鼠，也可用于更大的动物如绵羊、山羊或马。
二、材料（一）动物选择根据需要可选择适当品系的家兔，小鼠，大鼠或地鼠等动物进行免疫获得抗体。
动物的选择取决于所需的抗血清量以及特异性抗原的物种来源和免疫动物物种之间进化上的差异。
家兔常被选作免疫动物，因为兔与人、兔与小鼠之间的遗传学差异大，而人和小鼠来源的蛋白是最经常被研究的对象。
每次获取25ml血清的采血量，对兔本身没有明显的损伤。
（二）抗原制备优质抗血清很大程度上取决于抗原的质量、纯度和数量。
常用纯化的抗原或部分纯化的抗原免疫动物，所用抗原往往是蛋白质或肽。
一般而言，细菌或病毒蛋白如血凝素或细菌包膜蛋白有很强的免疫原性，而哺乳动物蛋白如多肽类激素或细胞膜受体则免疫原性较弱。
有时也会用到与适当的蛋白质载体、细胞或细胞与组织提取物相交联的半抗原（多糖、核酸、脂类和小分子化学物质等）以增强半抗原的免疫原性，通过化学方法将半抗原连接到已知的免疫原性强的载体蛋白上，常用的载体蛋白有匙孔戚血蓝素（KLH）、牛血清白蛋白（BSA）、鸡卵清蛋白（OVA）等。
多克隆抗体
多克隆抗体多克隆抗体: 原理、应用和优势摘要：多克隆抗体是一种可以广泛应用于生物医学研究、临床诊断和治疗的重要工具。
本文将介绍多克隆抗体的原理、应用和优势，帮助读者更好地了解和使用多克隆抗体。
1. 引言多克隆抗体是由多个不同的B细胞克隆所产生的抗体群体。
相比于单克隆抗体，多克隆抗体具有多种来源细胞、多样性抗体特异性和高抗原亲和力的优势。
2. 多克隆抗体的原理多克隆抗体的制备需要经历免疫原注射、免疫细胞制备、抗体筛选和克隆扩增等步骤。
通过注射抗原刺激机体免疫系统，激发B细胞产生特异性抗体。
然后通过细胞融合技术或酶消化法获得抗体产生的细胞系，最后经过筛选和扩增获得多克隆抗体。
3. 多克隆抗体的应用多克隆抗体在生物医学研究、生物工程和医学诊断等领域具有重要应用价值。
在科研中，多克隆抗体可用于蛋白质表达分析、免疫组化染色、免疫印迹、酶联免疫吸附测定等实验技术。
在临床诊断中，多克隆抗体可用于检测病原体感染、肿瘤标志物和药物浓度。
此外，多克隆抗体还可应用于治疗，如癌症免疫治疗和抗体药物研发。
4. 多克隆抗体的优势相比于单克隆抗体，多克隆抗体具有以下几个优势：4.1 多源性：多克隆抗体通过多个细胞克隆产生，能够识别抗原上的多个不同部位，从而提高抗体的特异性和亲和力。
4.2 可灵敏性：多克隆抗体可以通过融合多个细胞系来增加抗体的生产量，提高实验的灵敏性和可靠性。
4.3 高特异性：多克隆抗体可识别抗原上多个不同的表位，在检测复杂样本中具有更高的特异性。
4.4 宽适应性：多克隆抗体对于不同类型的抗原具有较强的适应性，可以应用于多种研究领域和技术平台。
5. 多克隆抗体的挑战与优势相对应的是多克隆抗体也存在一些挑战。
制备多克隆抗体需要免疫动物，然后通过脾细胞和骨髓细胞等制备免疫细胞，这个过程较为复杂且不易实施。
此外，多克隆抗体的批次间差异性较大，因此需要进行一定的筛选和验证工作。
6. 结论多克隆抗体作为一种重要的实验工具，在生物医学研究、生物工程和医学诊断等领域发挥着重要作用。
多克隆抗体技术在疾病诊断中的应用
多克隆抗体技术在疾病诊断中的应用多克隆抗体技术是一种广泛应用于生命科学和医学领域的核心技术之一。
随着现代医学研究的日益深入，多克隆抗体技术的应用越来越广泛，不仅可以用于诊断疾病，还可以用于治疗疾病、研究细胞分子、药物研究等领域。
本文将重点介绍多克隆抗体技术在疾病诊断中的应用。
一、多克隆抗体技术的基本原理多克隆抗体技术是利用多个淋巴细胞发生克隆扩增所得到的抗体种类和数量的方法。
这种方法需要一定的免疫学和细胞生物学基础知识，包括对抗原、抗体、淋巴细胞等知识的掌握。
多克隆抗体技术的基本流程包括：制备抗原、免疫动物、提取淋巴细胞、融合淋巴细胞和细胞瘤、筛选杂交瘤细胞、扩增多克隆细胞、鉴定抗体种类和活性、应用。
二、1.肿瘤标志物检测肿瘤标志物是指在肿瘤病人血清中表现异常的生物标志物。
多克隆抗体技术可以制备出多种抗体，可以用来检测不同种类的肿瘤标志物，通过肿瘤标志物的检测来诊断肿瘤。
例如，多克隆抗体可以用于检测前列腺癌标志物PSA，乳腺癌标志物CEA和CA15-3，肺癌标志物NMP-22和CYFRA 21-1等。
这些肿瘤标志物的检测可以提高肿瘤早期诊断的准确性和敏感性。
2.感染性疾病检测多克隆抗体技术可以用于检测各种感染性疾病的标志物，通过检测病原体相关的抗体来确定感染的类型和病情等信息，例如乙肝、丙肝、艾滋病等病毒感染的检测，结核菌感染的检测等。
3.自身免疫疾病诊断多克隆抗体技术也可以用于自身免疫性疾病的诊断。
自身免疫性疾病是一类由机体免疫系统攻击自身组织所导致的多种疾病，例如风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等。
通过检测血清中的自身抗体，可以确定是否存在自身免疫性疾病。
多克隆抗体技术制备的抗体可以用来检测不同种类的自身抗体，从而帮助诊断自身免疫疾病。
4.药物检测多克隆抗体技术还可以用于药物的检测。
例如，多克隆抗体可以用来检测阿司匹林在血液中的浓度，从而帮助调整阿司匹林的用量。
此外，多克隆抗体技术还可以用来研究药物的副作用、药物分布情况、药物代谢路径等问题。
多克隆抗体的制备
多克隆抗体的制备9.1 制备多克隆抗体(1) 采购新西兰大白兔，在免疫前取兔免疫前血清。
(2) 取2 ml的弗氏完全佐剂（Frund’s Adiuvant, complete，GIBCOBRL Cat. No1076471）加到含0.5 mg纯化抗原溶液（溶于2 ml的PBS中），搅拌使之充分乳化。
用5 ml注射器抽取此乳化液，接上22G注射针头，排出注射器中的气泡。
(3) 将兔子固定在操作台上，用70%乙醇对所要注射的区域进行清洁消毒，多点皮下注射乳化液。
(4) 四周后，用溶于弗氏不完全佐剂的1 mg抗原乳化液（1:1）对兔进行肌肉和皮下内加强免疫注射，操作步骤同1和2。
初次加强免疫后2周再次进行加强免疫注射。
(5) 第二次加强免疫注射14天后，从兔的耳缘静脉处放血。
使兔血顺管壁下落，以避免发生溶血。
(6) 将兔血在室温下静置数小时后置4℃过夜，用一木质的拨棒将血凝块轻轻的挑松并使之由离心管的侧壁脱落，将血清移到合适的离心管中，5000 g离心10分钟，去除残留的红细胞及其他碎片。
每两星期进行进一步的加强免疫。
每次加强免疫后10天，可采集一次兔血，兔的两只耳朵可轮流交替进行采血。
(7) 最后一次加强后一周到10天内，禁食一天取血检测滴度，达到一定滴度后，距离最后一次加强免疫2周内颈总动脉取血，室温放置2个小时或4℃过夜，4℃ 5000 rpm，离心20分钟收获血清。
9.2抗体的滴度检测及纯化9.2.1 ELISA检测抗体滴度(1) 包板: ELISA检测板中加入100μl用0.1M碳酸盐缓冲液(pH9.6)配制的抗原(10μg/ml) 4℃包埋过夜。
(2) 抗原抗体反应：弃去板里的液体，用PBS-Tween(0.2%)洗一次，然后加入梯度稀释的抗体, 37℃反应1个小时。
用PBS-Tween洗3次，加入羊抗兔辣根过氧化物酶抗体，37℃反应15-30分钟。
用PBS-Tween洗6次。
(3) 显色：加入配制好的底物TMB显色。
多克隆抗体ppt课件
多克隆抗体
二、概述
• 抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并 分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白，这就是免 疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就 是抗体。
• 抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇 刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之 为单克隆抗体（Monclone antibody）。由多种抗原决定簇 刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单 克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗 体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样 一类抗原决定簇，也可刺激机体产生IgG、IgM、IgA、IgE 和IgD等五类抗体。
细胞免疫二级学科多克隆抗体抗原刺激机体产生免疫学反应由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白这就是免疫球蛋白这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体
多克隆抗体
简述多克隆抗体的定义、制备及鉴定等 相关知识
多克隆抗体
一、定义
• 中文名称：多克隆抗体 • 英文名称：polyclonal antibody • 定义1：由多个B细胞克隆所产生的抗体，可与不
多克隆抗体
（三）操作方法 1、免疫方法 • 可以采用以下各种方法之一进行免疫。 （1）淋巴结注射法： A、在兔的两后足跖部皮下（或皮内）注射活卡介苗 50mg（每
侧约0.30ml） 。7～10 天后，兔跖及腘肌淋巴结肿大； B、于肿大的两侧淋巴结内各注射加有完全佐剂的IgG 乳化抗原
0.50ml(含 IgG 5mg/ml、青霉素 1 000U/ml、链霉素 1 000μg/ml)； C、必要时，14 天后，重复步骤B一次； D、再过 7 天后，于两侧淋巴结内各注射加有完全佐剂的 IgG 乳化抗原0.50ml（含IgG5mg/ml、青霉素 1 000U/ml、链霉素 1 000μg/ml） ； E、5～7天后，耳静脉采血。测定血清效价。
9、多克隆抗体的制备
（二）血清的分离
采血时一般不加抗凝剂，全血在室温中自然凝固， 在灭菌容器中使之与空气有较大的接触面。 先置于37℃ 1～2h，然后置于4℃冰箱过夜，次 日离心收集血清。 采血量大时，用自然凝固加压法 无菌的血清，组批分装，保存于之-15℃半成品 库，待抽检合格后交成品库保存。
多克隆抗体 （高免血清）制备技术
一般是指利用微生物及其代谢产物等作为免疫原，
经反复多次注射同一动物体，所生产的一类高效
价抗体，主要包括高度免疫血清、卵黄抗体和牛 奶抗体等
高度免疫血清简称高免血清（hyperimmune serum），又称免疫血清（immune serum）或抗 血清（antiserum） 分为抗病血清和抗毒素
产蛋鸡（鸭和鹅）感染某些病原后，其血清和蛋 黄内均可产生相应的抗体。
蛋黄中提取相应的抗体，并可用于相应疾病的预 防和治疗，称为卵黄抗体（yak antibody）。 卵黄抗体可以在一定程度上克服血清抗体成本较 高、生产周期较长的弱点，并且具有用同批动物 连续生产的优点。 有潜伏野毒的危险，对生产用鸡应严格检疫。
七、血液采集与血清提取
按照免疫程序完成免疫的动物，经采血检验 （试血），血清效价达到合格标准时，即可 采血。
不合格者，再度免疫，多次免疫仍不合格者 淘汰。
（一）采血次数和方法
效价高峰在最后一次免疫后的7～10d。
采血可以全放血或部分采血。
放血前，动物应禁食24h，但需饮水以防止血 脂过高。
多克隆抗体
传统的抗体制备方法是将一种天然抗原经不同途径免疫动物，由于抗原性物质具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌抗各种决定簇的抗体，故在其血清中实际上是含多种抗体的混合物，所以称这种免疫法所获得的免疫血清为多克隆抗体（polyclonal antibody ，PcAb）。
多克隆抗体的亲和力较一般单克隆抗体高。
多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为制备高效价和高特异性的多克隆抗体，必须要有理想的免疫原、适宜的动物及切实可行的免疫方法。
本章主要介绍多克隆抗体的制备及相关技术。
第一节动物选择实验动物是生物医学中的重要组成部分。
目前常用于生物医学科学研究的实验动物种类很多，主要包括有两栖纲的青蛙、蟾蜍，鸟纲的鸡、鸭、鸽等，哺乳纲啮齿目的小鼠、大鼠、豚鼠等，兔形目的家兔，食肉目的猫、狗，有蹄目的羊、猪和灵长目的恒河猴、猩猩、绒猴等。
其中最常用和用量最大的是哺乳纲啮齿目动物，其次是兔形目和食肉目等。
一、实验动物的生物学特性实验动物选择得当与否是实验研究成败关键之一。
掌握实验动物的生物学特性，则能以最佳的设计选择实验动物，进行科学实验，从而获得预期的实验结果。
1. 小鼠小鼠是啮齿目中体型较小的动物。
新生小鼠 1.5g 左右，21 天断乳时12～15g，至 2 月龄体重达20g 以上，可供实验使用。
成年雌小鼠体重18~35g，成年雄鼠体重20~40g。
小鼠性情温顺，易于捕捉，对外来刺激敏感，喜群居于阴暗环境。
2 ．兔草食性动物，性情温顺，胆小易惊，喜居安静、清洁、干燥、凉爽、空气新鲜的环境，耐冷不耐热，耐于不耐湿。
兔耳大，表面分布有清晰的血管。
有特殊的血清型和唾液型，血清型分为α ' 、β ' 、α'β'和O型四种。
α ' 、α' β'型易产生人A型抗体，β ' 、O型易产生人B型抗体。
唾液型分两种：排出型与非排出型。
排出型易获得人血细胞 A 型物质，非排出型不易获得，这种A型物质与A型抗体产生能力有关。
多克隆抗体
传统的抗体制备方法是将一种天然抗原经不同途径免疫动物，由于抗原性物质具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌抗各种决定簇的抗体，故在其血清中实际上是含多种抗体的混合物，所以称这种免疫法所获得的免疫血清为多克隆抗体(polyclonal antibody，PcAb)。
多克隆抗体的亲和力较一般单克隆抗体高。
多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为制备高效价和高特异性的多克隆抗体，必须要有理想的免疫原、适宜的动物及切实可行的免疫方法。
本章主要介绍多克隆抗体的制备及相关技术。
第一节动物选择实验动物是生物医学中的重要组成部分。
目前常用于生物医学科学研究的实验动物种类很多，主要包括有两栖纲的青蛙、蟾蜍，鸟纲的鸡、鸭、鸽等，哺乳纲啮齿目的小鼠、大鼠、豚鼠等，兔形目的家兔，食肉目的猫、狗，有蹄目的羊、猪和灵长目的恒河猴、猩猩、绒猴等。
其中最常用和用量最大的是哺乳纲啮齿目动物，其次是兔形目和食肉目等。
一、实验动物的生物学特性实验动物选择得当与否是实验研究成败关键之一。
掌握实验动物的生物学特性，则能以最佳的设计选择实验动物，进行科学实验，从而获得预期的实验结果。
1. 小鼠小鼠是啮齿目中体型较小的动物。
新生小鼠1.5g左右，21天断乳时12～15g，至2月龄体重达20g以上，可供实验使用。
成年雌小鼠体重18~35g，成年雄鼠体重20~40g。
小鼠性情温顺，易于捕捉，对外来刺激敏感，喜群居于阴暗环境。
2．兔草食性动物，性情温顺，胆小易惊，喜居安静、清洁、干燥、凉爽、空气新鲜的环境，耐冷不耐热，耐于不耐湿。
兔耳大，表面分布有清晰的血管。
有特殊的血清型和唾液型，血清型分为α'、β'、α'β'和O型四种。
α'、α'β'型易产生人A型抗体，β'、O型易产生人B型抗体。
唾液型分两种：排出型与非排出型。
排出型易获得人血细胞A型物质，非排出型不易获得，这种A型物质与A型抗体产生能力有关。
多克隆抗体的制备,纯化及检测
实验九 多克隆抗体的制备，纯化及免疫电泳【实验目的】⒈ 加深对抗体基本知识的了解。
⒉ 了解多克隆抗体的制备及纯化的基本方法。
⒊ 了解免疫电泳的基本过程和实验依据。
一、多克隆抗体的制备【实验原理】当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。
多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗原决定簇相结合。
将抗原导入敏感动物体内后，可刺激网状内皮细胞系统，尤其是淋巴结和脾脏中的淋巴细胞大量增殖。
如图所示，实验动物对初次免疫和二次免疫的应答有明显的不同。
通常初次免疫应答往往比较弱，尤其是针对于易代谢，可溶性的抗原。
首次注射后大约7天，在血清中可以观察到抗体但抗体的浓度维持在一个较低的水平，在大约10天左右抗体的滴度会达到最大值。
但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同，和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。
免疫应答的动力学结果取决于抗原和免疫动物的种类，但初次和二次免疫应答之间的关系是免疫应答的一个重要特点。
三次或以后的抗原注射所产生的应答和二次应答结果相似：抗体的滴度明显增加并且血清中抗体的种类和性质发生了改变，这种改变被称为免疫应答的成熟，具有重要的实际意义。
通常在抗原注射4-6周后会产生具有高亲和力的抗体。
【实验材料】⒈ 实验动物初次抗原注射后的周次0 1 2 3 4 5 6 7初次免疫 二次免疫血清中抗体的水平成年兔。
⒉实验器材特制兔盒；刀片；25G针头；1ml注射器；20 ml 血液收集管；药铲；离心机以及塑料离心管；加样器及加样管；烧杯。
⒊实验试剂⑴抗原；乙醇；20mM 磷酸缓冲溶液pH7.2。
⑵福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂：【实验方法】⒈抗原的制备抗原制备的主要目的在于在免疫动物体内产生最强、最适当的抗体。
由于纯化的抗原适合产生抗体，因此在注射前通常采用一些经典的方法，比如柱层析、分级萃取、亚细胞分离等进行抗原的分离和纯化。
多克隆抗体的制备
第一节抗原的制备除完整的细胞可作为抗原外，各种不同的细胞内存在的各种分子量不同的物质，也都具有全抗原或半抗原的性质，某种抗原物质可能是某一类细胞所特有的，可作为这种细胞的一个标志。
由于细胞存在着许多性质不同的抗原物质，有时要从这众多的物质中提取、纯化某种抗原物质，以供科学研究之用。
一、抗原的提取抗原的制备是一件十分细致的工作，要制备一个高纯度的抗原，需要付出艰巨的努力，制备工作涉及物理学、化学和生理学等许多领域的知识。
根据物理或化学特性建立起来的分离、纯化方法的主要原理不外乎科二个方面：①利用混合物中几个组分分配率的差别将他们分配到可用机械方法分离的两或几个物相中，如盐析、有机溶剂抽提、层析和结晶等；②把混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同的区域而达到分离的目的，如电泳、超速离心和超滤等。
由于组织细胞内存着许多分子结构和理化性质不同的抗原物质，其分离方法也不一样，就是同一类大分子物质，因选材不同，所使用的方法也很大差别。
因此很难有一个通用的标准方法供提取任何生物活性物质使用，所以在提取前必须针对所欲提取的物质，充分查阅文献资料，选用合适的方法。
如果要提取一个结构及性质未知的抗原物质，更需要经过各种方法的比较探索，才能找到一些工作规律和获得预期的效果。
抗原物质的制备，大概要经过如下过程：①材料的选择和预处理；②细胞的粉碎（细胞器的分离）。
③提取；④纯化；⑤浓缩或干燥，保存。
现分别简述如下。
（一）材料的选择及预处理选择什么材料主要根据实验目的而定。
通常选含量高、工艺简便、成本低的材料。
材料选定后，通常要进行预处理，剔除结缔组织、脂肪组织等，把组织块剪碎。
若取材后不立即进行提取，则应冷冻保存，动物组织更要深低温保存。
某些容易失活的物质，一般宜采用新鲜材料。
（二）细胞的粉碎除了提取体液、组织间液内的多肽、蛋白质、酶不需粉碎细胞外，凡要提取组织内、细胞膜上及胞内的生物活性物质，都必须把组织和细胞粉碎，使活性物质充分释放到溶液内。
多克隆抗体的制备ppt课件
多克隆抗体的制备
动物免疫
免疫动物的选择：
抗原来源与动物种属的关系：抗原的来源与免疫动物种 属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而同种系 或亲缘关系越近，免疫效果越差。
人工合成佐剂：如双链多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）、 双链多聚腺苷酸：尿苷酸（poly A：U）；油剂：如弗氏完全 佐剂、花生油乳剂等；
纳米佐剂
多克隆抗体的制备
弗氏佐剂（Freund’s adjuvant）
分为弗氏不完全佐剂和完全佐剂两种： 前者是由油剂（矿物油或花生油）和乳化剂（羊 毛脂或吐温-80）按1：1～1：5比例混合而成；
选择性沉淀：
选择某抗原理化特性，采用相应沉淀剂或溶液环境， 如：
核酸去除 盐析沉淀法 有机溶剂沉淀法 高分子聚合物沉淀法
多克隆抗体的制备 50%饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出血清球蛋白；
超滤法： 利用孔径大小不同的特制薄膜对不同分子大小
的抗原物质进行滤筛。 电泳
多克隆抗体的制备
精分离
层析法： 凝胶过滤层析 离子交换层析 亲和层析 疏水层析 反相层析
多克隆抗体的制备及 抗体活性测定
张江中试平台
多克隆抗体的制备
主要内容
• 多克隆抗体制备的基本原理 • 多克隆抗体制备的操作步骤 • 抗体活性的实验原理、操作流程和结果判断
多克隆抗体的制备
原理
1、克隆(clone)： 是指无性繁殖细胞系，由单一个祖先细胞 分裂繁殖而形成的一簇细胞系。在这个家族的所有成员中， 如无发生突变其基因是完全相同的。
多克隆抗体的制备
多克隆抗体
多克隆抗体传统的抗体制备方法是将一种天然抗原经不同途径免疫动物，由于抗原性物质具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌抗各种决定簇的抗体，故在其血清中实际上是含多种抗体的混合物，所以称这种免疫法所获得的免疫血清为多克隆抗体（polyclonal antibody ，PcAb）。
多克隆抗体的亲和力较一般单克隆抗体高。
多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为制备高效价和高特异性的多克隆抗体，必须要有理想的免疫原、适宜的动物及切实可行的免疫方法。
本章主要介绍多克隆抗体的制备及相关技术。
第一节动物选择实验动物是生物医学中的重要组成部分。
目前常用于生物医学科学研究的实验动物种类很多，主要包括有两栖纲的青蛙、蟾蜍，鸟纲的鸡、鸭、鸽等，哺乳纲啮齿目的小鼠、大鼠、豚鼠等，兔形目的家兔，食肉目的猫、狗，有蹄目的羊、猪和灵长目的恒河猴、猩猩、绒猴等。
其中最常用和用量最大的是哺乳纲啮齿目动物，其次是兔形目和食肉目等。
一、实验动物的生物学特性实验动物选择得当与否是实验研究成败关键之一。
掌握实验动物的生物学特性，则能以最佳的设计选择实验动物，进行科学实验，从而获得预期的实验结果。
1. 小鼠小鼠是啮齿目中体型较小的动物。
新生小鼠 1.5g 左右，21 天断乳时12～15g，至 2 月龄体重达20g 以上，可供实验使用。
成年雌小鼠体重18~35g，成年雄鼠体重20~40g。
小鼠性情温顺，易于捕捉，对外来刺激敏感，喜群居于阴暗环境。
2 ．兔草食性动物，性情温顺，胆小易惊，喜居安静、清洁、干燥、凉爽、空气新鲜的环境，耐冷不耐热，耐于不耐湿。
兔耳大，表面分布有清晰的血管。
有特殊的血清型和唾液型，血清型分为α ' 、β ' 、α'β'和O型四种。
α ' 、α' β'型易产生人A型抗体，β ' 、O型易产生人B型抗体。
唾液型分两种：排出型与非排出型。
多克隆抗体的制备技术
多克隆抗体的制备技术
多克隆抗体的制备技术是一种利用多个B细胞克隆的方法，用于生产特定抗原的抗体。
具体步骤如下：
1. 抗原制备：首先，需要制备抗原。
抗原可以是蛋白质、病原体、多肽或其他分子，可以通过基因工程技术在大肠杆菌等表达系统中表达、纯化或合成。
2. 免疫小动物：将制备好的抗原注射到小动物体内（如小鼠、兔子或大鼠）作为免疫原。
这样做可以激发动物的免疫系统产生抗原特异性的抗体。
3. 收集抗体：收集免疫小动物产生的抗原特异性抗体。
一般情况下，可以通过静脉采血或收集腹水来获得抗体。
4. 抗体纯化：对采集到的抗体进行纯化，可以使用亲和层析或离子交换层析等技术进行精确的纯化。
5. 克隆：将纯化的抗体进行多次稀释，然后分别稀释至单个细胞级别。
接下来，将单个细胞分别种植在含有培养液的孔中，使其形成克隆。
6. 验证：对每个克隆进行酶联免疫吸附测定（ELISA）或其他检测方法验证抗体的特异性和亲和力。
7. 扩大培养：对验证合格的克隆进行扩大培养，使其产生大量的抗体。
通过以上步骤，可以制备出多个来自不同克隆的抗体，这些抗体可以与同一抗原结合，用于生物学研究、诊断和治疗等领域。
多克隆抗体简介
多克隆抗体技术简介一、技术说明由多种抗原决定簇刺激机体。
一系列抗体生成细胞会不同程度地与抗原结合，在血液中相应地产生不同类型的单克隆抗体，这种由一种抗原刺激产生的混杂在一起的单克隆抗体称为多克隆抗体。
通过免疫动物、血清效价检测、采集血清、纯化抗体等过程制备针对同一抗原不同表位的抗体的技术称之为多克隆抗体制备技术。
二、技术原理当抗原注射入实验动物体内时，刺激网状内皮细胞系统，使淋巴结和脾脏的淋巴细胞大量增殖。
首次注射后大约7d，在血清中可以观察到抗体，但抗体的浓度维持在一个较低的水平，大约10d抗体的滴度会达到最大值。
但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同，和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。
进而通过收集动物血清，借助亲和纯化方法将抗体从血清中纯化出来以得到多克隆抗体。
三、技术流程四、研究进展（一）抗原获得方法制备多克隆抗体所用的抗原一般来源有两种，即原核表达和合成多肽。
原核表达可以在较短的时间内获得基因表达产物，所需成本较低，但是也有些外源基因无法进行原核表达。
多肽合成是将分析好的多肽抗原进行固相或液相合成，抗原性高，但成本也高。
因此在实际实验过程中应该把原核表达和多肽合成有效结合起来完成多克隆抗体的制备。
（二）所用动物的选择获得多克隆抗体的最终步骤是动物免疫。
其中选择合适的免疫动物尤为重要。
一般来讲，所选择的蛋白抗原供体与免疫动物种系不可太接近，亲缘太近不易产生良好抗体，甚至不产生抗体(如兔和大鼠、鸡和鸭)。
免疫动物包括家兔、啮齿类、鸡等小型实验动物以及绵羊、马、山羊等大型家畜。
其中家兔是最适合制备抗体的动物；小鼠一般用于单克隆抗体制备，在需要大量抗血清时，主要用大型家畜。
在动物性别、年龄以及数量上的选择一般选用雌性、青壮年期1只以上的个体。
患病或处于感染、饥饿状态均会影响免疫效果，因此应选用健康壮实的动物。
在实际免疫过程中还需要根据不同性质的免疫原选择使用动物进行免疫。
多克隆抗体的制备方法
多克隆抗体的制备方法摘要：一、引言二、多克隆抗体的概念与作用三、多克隆抗体的制备方法1.动物免疫2.融合细胞培养3.筛选与克隆4.抗体检测与纯化四、制备过程中的注意事项五、应用领域与发展前景六、总结正文：一、引言多克隆抗体，作为一种具有广泛应用前景的生物制品，其在科学研究、医学诊断、生物制药等领域具有重要价值。
本文将详细介绍多克隆抗体的制备方法，以期为相关领域的研究者提供参考。
二、多克隆抗体的概念与作用多克隆抗体是指由多个B细胞克隆产生的具有相同抗原结合能力的抗体。
它们可以识别并结合抗原的不同表位，从而提高抗体的针对性和广泛性。
多克隆抗体在免疫检测、疾病诊断、治疗肿瘤和病毒感染等方面具有显著作用。
三、多克隆抗体的制备方法1.动物免疫：选用适合的动物（如小鼠、兔子等）进行免疫，通常采用皮下注射或静脉注射的方式，使动物产生针对特定抗原的免疫应答。
免疫周期一般为2-3周，期间需要多次注射抗原。
2.融合细胞培养：收集免疫动物的脾细胞和骨髓瘤细胞，进行细胞融合。
融合后的细胞能够在体外培养条件下生长繁殖，并分泌针对抗原的抗体。
3.筛选与克隆：筛选出具有特定抗原结合能力的杂交瘤细胞，对其进行克隆化培养。
克隆化培养有助于获得具有相同抗原结合能力的抗体细胞株。
4.抗体检测与纯化：对筛选出的抗体细胞株进行抗体检测，筛选出具有较高抗体滴度的细胞株进行体外培养。
培养后的抗体需进行纯化，以获得高纯度的多克隆抗体。
纯化方法包括柱层析、凝胶过滤等。
四、制备过程中的注意事项1.抗原的选择：选用具有良好免疫原性的抗原，以提高抗体的免疫应答效果。
2.动物免疫方案：根据动物种类和抗原性质制定合适的免疫方案，包括抗原剂量、免疫途径和免疫周期。
3.细胞融合与培养：确保细胞融合充分，避免未融合的细胞或融合细胞的自融合。
培养过程中注意观察细胞生长状态，以保证抗体产量和质量。
4.抗体检测与纯化：采用可靠的抗体检测方法，如ELISA、免疫组化等。
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第九章多克隆抗体技术（Polyclone antibodies preparation technique）一、概述（一）多克隆抗体的概念抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白，这就是免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。
抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B 淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体（Monclone antibody）。
由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一类抗原决定簇，也可刺激机体产生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD 等五类抗体。
（二）免疫动物供免疫用的动物主要是哺乳动物和禽类，常选择家兔、绵羊、山羊、马、骡和豚鼠及小鼠等。
动物的选择常根据抗体的用途和量来决定，也与抗原的性质有关。
如要获得大量的抗体，多采用大动物；如要是获得直接标记诊断的抗体，则直接采用本动物；如要获得间接的标记诊断用抗体，则必须用异源动物制备抗体；如果难以获得的抗原，且抗体的需要量少，则可以采用纯系小鼠制备；一般实验室采用的抗体，多用兔和羊制备。
免疫用的动物最好选择适龄的健康雄性动物，雌性动物特别是妊娠动物用于制备免疫抗体则非常不合适，有时甚至不产生抗体。
由于对免疫应答的个别差异，免疫时应同时选用数只动物进行免疫。
抗原是多种多样的，而且千差万别。
就其化学成分而言，有蛋白质抗原、类脂抗原、多糖类抗原和核酸抗原等。
就抗原性而言，有完全抗原和不完全抗原。
为了• 1 •获得较好的抗血清，最好是选用蛋白质抗原，如要制备用于筛选细菌表达的cDNA 文库或免疫印迹的抗血清，最好选用可降解的蛋白质抗原。
不同的抗原，其免疫原性的强弱均不相同，这种免疫原性的强弱取决于抗原的分子量、化学活性基团、立体结构、物理形状和弥散速度等。
抗原的免疫剂量是依照给予动物的种类、免疫周期以及所要求的抗体特性等不同而不同。
剂量过低，不能引起足够强的免疫刺激，免疫剂量过多，有可能引起免疫耐受。
在一定的范围内，抗体的效价是随注射剂量的增加而增高。
蛋白质抗原的免疫剂量比多糖类抗原宽。
一般而言，小鼠的首次免疫剂量为50μg～400μg/次，大鼠为100μg～1 000μg／次，兔为200μg～1 000μg/次。
加强计量为首次剂量的1／5～2／5。
免疫剂量与注射途径有关，一般而言，静脉注射剂量大于皮下注射，而皮下注射又比掌内和跖内皮下注射剂量大，也可采用淋巴结内注射法。
加佐剂比不加佐剂的注射剂量要小，对家兔而言，采用弗氏完全佐剂，则需注射0.5mg～1mg/kg./次，如采用弗氏不完全佐剂则注射剂量应大10倍以上。
如要制备高度特异性的抗血清,可选用低剂量抗原短程免疫法。
如需要获得高效价的抗血清，宜采用大剂量长程免疫法。
免疫周期长者，可少量多次。
免疫周期短者，应大量少次。
两次注射的间隔时间应长短适宜,太短起不到再次反应的效果，太长则失去了前一次激发的敏感作用。
一般间隔时间应为5~7天，加佐剂者应为2周左右。
注射的Ig纯度高，则一般不易引起过敏反应，如注射血清，即使是少量，在再次免疫时，极易引起过敏反应，所以一定要采取措施。
（四）佐剂的应用对可溶性抗原而言，为了增强其免疫原性或改变免疫反应的类型、节约抗原等目的，常采用加佐剂的方法以刺激机体产生较强的免疫应答。
1．佐剂的类型目前实践中常应用的佐剂有氢氧化铝胶、明矾、弗氏佐剂、脂质体和石蜡油等。
也有采用结合杆菌等分枝杆菌、白喉杆菌以及细小棒状杆菌等。
⑴弗氏不完全佐剂（incomplete Freund's adjuvant,IFA）羊毛脂 1 份石蜡油 5 份混合，高压灭菌后保存。
用时加热融化，冷却至50℃左右，加抗原进行乳化处理。
⑵弗氏完全佐剂（complete Freund's adjuvant,CFA）弗氏不完全佐剂10ml卡介苗10mg～200mg卡介苗可100℃10min灭活处理。
• 2 •初次免疫时，最好用弗氏完全佐剂，以刺激机体产生较强的免疫反应。
再次免疫时，一般不用完全佐剂，而采用弗氏不完全佐剂。
但在研究分枝杆菌及相关抗原时，一般不用弗氏完全佐剂，以免卡介苗的干扰。
⑶脂质体：是人工制备的类脂质的小球体，由一个或多个酷似细胞膜的类脂双分子层组成，这种结构使其能够携带各种亲水的、疏水的和两性物质，他们被包裹在脂质体内部的水相中，或插入类脂双分子层或吸附、联接在脂质体的表面，起到明显的免疫增强作用。
⑷油佐剂：采用植物油和矿物油均可，包括豆油、花生油、油菜油等。
目前应用最广的矿物油。
10号白油(石蜡油) 100ml硬脂酸铝2g司本80 6ml混合加热融化，分装。
用时按下列配方进行乳化。
油相3份水相（加4%吐温－80）1份先把油相搅拌起来，然后缓慢加入水相乳化。
司本是油分散剂，吐温是水分散剂，均有利于乳化。
2．乳化将抗原与佐剂混合的过程称为乳化。
乳化的方法很多，可采用研钵乳化；可直接在旋涡振荡器上乳化；可用组织捣碎器乳化。
少量时，特别是弗氏佐剂与抗原乳化时，常采用注射器乳化，用两个注射器，一个吸入抗原液，一个吸入佐剂，两注射器头以胶管连接，注意一定扎紧，然后来回抽吸。
当大量乳化时，可采用胶体磨进行。
乳化好的标志是取一滴乳化剂滴入水中呈现球形而不分散。
如出现平展扩散即为未乳化好。
乳化过的物质放置一段时间（在保存期内）出现油水分层也是未乳化好的表现。
根据抗原的性质、免疫原性和动物的免疫反应性来决定免疫途径、免疫次数和间隔时间等。
免疫途径包括皮下注射、皮内注射、肌肉注射、静脉注射、腹腔注射以及淋巴结内注射等。
抗原量少，则一般多采用加佐剂，淋巴结内或淋巴结周围、或足掌、或皮内、皮下多点注射，如抗原量多，则可采用皮下、肌肉、以至静脉注射。
注射间隔时间带佐剂的皮内、皮下注射，一般为间隔2～4周免疫一次。
不带佐剂的皮下或肌肉注射，一般为1～2周间隔时间；肌肉或静脉免疫的，可5天左右的间隔时间。
可以把各种注射途径联合起来应用，最终以达到效价要求为目的。
• 3 •（六）抗体的鉴定1.抗体的效价鉴定不管是用于诊断还是用于治疗，制备抗体的目的都是要求较高效价。
不同的抗原制备的抗体，要求的效价不一。
鉴定效价的方法很多，包括有试管凝集反应、琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验等。
常用的抗原所制备的抗体一般都有约成的鉴定效价的方法，以资比较。
如制备抗抗体的效价，一般就采用琼脂扩散试验来鉴定。
2.抗体的特异性鉴定抗体的特异性是指与相应抗原或近似抗原物质的识别能力。
抗体的特异性高，它的识别能力就强。
衡量特异性通常以交叉反应率来表示。
交叉反应率可用竞争抑制试验测定。
以不同浓度抗原和近似抗原分别做竞争抑制曲线，计算各自的结合率，求出各自在IC50时的浓度，并按下列公式计算交叉反应率。
如果所用抗原浓度IC50浓度为pg/管，而一些近似抗原物质的IC50浓度几乎是无穷大时，表示这一抗血清与其他抗原物质的交叉反应率近似为0，即该血清的特异性较好。
3.抗体的亲和力是指抗体和抗原结合的牢固程度。
亲和力的高低是由抗原分子的大小、抗体分子的结合位点与抗原决定簇之间立体构型的合适度决定的。
有助于维持抗原抗体复合物稳定的分子间力有氢键、疏水键、侧链相反电荷基因的库仑力、范德华力和空间斥力。
亲和力常以亲和常数K表示，K的单位是L/mol，通常K 的范围在108～1010/mol，也有多达1014/mol。
抗体亲和力的测定对抗体的筛选，确定抗体的用途，验证抗体的均一性等均有重要意义。
（七）抗血清的冻存抗血清收获后，加1/万硫柳汞或1/万的叠氮钠防腐，或加入等量的中性甘油，分装小瓶，置-20℃以下的低温保存，数月至数年内抗体效价无明显变化。
注意避免反复冻融。
也可将抗血清冷冻干燥后保存。
二、抗Ig抗体的制备（一）抗原制备Ig是免疫球蛋白，对异种动物而言，是良好的抗原物质。
可以刺激异种动物产• 4 •生抗Ig血清，经适当提取后，产生抗Ig抗体，又叫第二抗体或抗抗体。
在多数的间接标记反应中，均需制备抗Ig抗体。
（二）材料与试剂1．提取的动物Ig2．弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂3．青霉素和链霉素4．实验动物兔5．其它材料及试剂（三）操作方法1．免疫方法可以采用以下各种方法之一进行免疫。
（1）淋巴结注射法：①在兔的两后足跖部皮下（或皮内）注射活卡介苗50mg （每侧约0.30ml）。
7～10天后，兔跖及腘肌淋巴结肿大；②于肿大的两侧淋巴结内各注射加有完全佐剂的IgG乳化抗原0.50ml(含IgG 5mg/ml、青霉素1 000U/ml、链霉素1 000μg/ml)；③必要时，14天后，重复步骤②一次；④再过7天后，于两侧淋巴结内各注射加有完全佐剂的IgG乳化抗原0.50ml（含IgG5mg/ml、青霉素 1 000U/ml、链霉素1 000μg/ml）；⑤5～7天后，耳静脉采血。
测定血清效价。
（2）皮下多点注射法：①家兔两侧掌（跖内各注射含有完全佐剂抗原0.10ml （IgG含量5mg/ml）；②7～10天后，脊柱两侧多点（颈、胸、腰椎各两点、共6点）皮下注射含不完全佐剂的抗原，每点0.50ml；③7～10天后，脊柱两侧重复注射一次；④7～10天后试血。
不合格者重复步骤③。
（3）多途径联合注射法：①两侧掌（跖）内侧皮下注射含完全佐剂抗原0.50ml （IgG量为5mg/ml）；②14天后，多点皮下注射含有不完全佐剂抗原；③7天后，耳静脉注射不含佐剂的抗原2ml；④测定血清抗体效价，不合格者重复步骤③，并适当递增IgG量。
2．效价测定采用琼脂扩散法。
⑴将血清倍比稀释，加入外周孔。
⑵中间孔加动物Ig。
⑶37℃湿盒琼扩24小时，观察结果。
（四）结果判定1．抗Ig的效价测定琼脂扩散效价达1﹕16或1﹕32者为合格。
2．纯度鉴定采用琼扩法。
中间孔加抗Ig血清，外周孔加Ig和标准品Ig。
在抗Ig与Ig以及标准品Ig均出现一条沉淀线，且这两条沉淀线相互融合者，说明提取的Ig是纯的。
• 5 •三、猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联血清的制备（一）材料及试剂1．猪瘟疫苗2．猪丹毒菌苗3．猪肺疫疫苗4．肥猪（二）操作方法1．基础免疫选健康的育肥猪数头，进行猪瘟、猪丹毒和猪肺疫三种疫苗的基础免疫。
猪瘟疫苗采取肌肉注射法，猪丹毒和猪肺疫采用口服法进行。
2．加强免疫基础免疫后7~10天，进行加强免疫。
猪瘟疫苗、猪丹毒和猪肺疫菌苗分别为200头份、100头份和100头份，肌肉或皮下注射。
3．7天后，进行第二次强化注射，剂量同前。
4．10～12天后，无菌放血和收集血液。
放血前一天晚上停食，可饮水。
5．血液自然凝固、分离血清。