第8章_第1节_基因诊断(3_LMJ)共58页文档

(1) DNA的微量分析
PCR法灵敏度高，对模板DNA纯度要求不高， 且样品用量极微(如一滴血、一根头发等)。
(2) RT-PCR(reverse transcriptional-PCR)
总RNA(或mRNA)
ss-cDNA
ds-cDNA PCR扩增
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(3)巢式-PCR(nested PCR)
适用于遗传性疾病、感染性疾病、肿瘤等多
种疾病的诊断，以及个体识别和亲子鉴定等法病 学领域。
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一 、基因诊断的概念和特点
（二）特点--以已知基因作为检测对象
（l）特异性强：直接检测导致疾病发生的基因变化； （2）灵敏度高：所采用的分子杂交和聚合酶链反应
等技术都具有信号放大作用； （3）取样便利：一般不受组织或时相的限制；
第一节 基因诊断 (gene diagnosis)
一、基因诊断的概念和特点 二、基因诊断的主要技术方法 三、常见的基因异常及其检测 四、疾病的基因诊断(自习) 五、基因诊断在法医学上的应用
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一 、基因诊断的概念和特点
（一）概念
基因诊断通常是指利用分子生物学的方法技 术，直接检测体内DNA的结构变异或RNA的水平变 化，从而对疾病作出诊断的方法。
样品做适当处理(如固定剂固定、蛋白酶消化)，使 其通透性增大，标记探针进入细胞内与核酸杂交。
应用： 被检测基因或mRNA在细胞内的检测及定位。
1986创建的荧光原位杂交(FISH) 用于特定基因 的定位及其缺失、扩增或重排的检测。
特点： 不需提取被检核酸，可确定被检核酸细胞内定位。
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DNA微阵列 (DNA microarray)——通过计 算机控制点样和图像扫描的高密度集成探 针的杂交技术。
应用： 单核苷酸多态性(SNP)、基因表达谱和遗传 性疾病的分析；病原微生物的大规模检测。
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二、基因诊断的主要技术方法
(二)PCR 技术 (第七/七章)
1. PCR技术的原理
以DNA分子为模板，加入与拟扩增DNA片段两 端分别互补的一对寡核苷酸链作为引物，在 DNA 聚合酶的催化下，按照半保留复制的形式分别合 成两股新的DNA互补链，可使两引物间的DNA片段 拷贝数增加一倍。
多次重复这一过程，可使这段 DNA拷贝数随 复制次数以指数形式扩增。
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2. 基因诊断中常用的PCR及其衍生技术
量，与对照品比较确定所测核酸量的高低。
应用： 主要用于检测细胞基因拷贝数的变化或者 mRNA含量的变化。
特点： 便于大规模检测和筛选；容易出现假阳性。
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2.组织原位杂交(tissure in situ hybridization )
方法： 组织或细胞 (新鲜组织切片、细胞涂片或石蜡切片)
用2对引物(外引物、内引物)扩增，大大提高 了扩增的特异性
(4) 不对称PCR(asymmetric PCR )
2个引物浓度不等，一般采用50:1或100:1 的摩尔比，主要获取单链DNA作构象分析或用作 探针。
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(5)多重PCR(multiplex PCR)
在同反应体系中加入多对引物，同时扩增同 一 DNA样品中的多个不同序列区域，且每对引物 所扩增的产物长度都不同，可根据电泳结果判断 是否存在某些基因片段的缺失或长度改变。
(allele-specific oligonucleotide hybridization, ASOH)
4.DNA 芯片(DNA chip)技术
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1.斑点印迹(dot blotting)杂交
方法： 将核酸(DNA或RNA)样品点在NC膜上，变性 后与标记探针结合，显影或显色，密度测
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原癌基因ERBB-2(Her-2)，基因扩增荧光原位杂交检测
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3.等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASOH)
方法： 根据已知基因突变位点的碱基序列，设计 和制备与野生型或突变型基因序列片段互 补的两种探针，分别与被检DNA进行杂交， 确定基因突变存在与否，分辨纯/杂合子。
(6)等位基因特异性PCR(AS-PCR)
针对等位基因的序列差异区域设计引物，使 引物的 3’端与等位基因序列的差异碱基对应， 仅能与突变型或野生型互补。
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(7)原位PCR (in situ PCR,IS-PCR) 技术
1)细胞和组织经固定剂固定、蛋白酶消化，使 细胞获得适度的通透性，既利于 PCR反应试剂到 达靶位，又可防止扩增产物从细胞内漏出；
（4）早期诊断：易在疾病尚无临床表现时作出诊断； （5）应用广泛：可检测自体基因和外源基因。
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二、基因诊断的主要技术方法
(一)核酸分子杂交（NA hybridization）
(二)聚合酶链式反应（PCR）技术
(三)单链构象多态性分析（SSCP）
(四)DNA分子多态性（DNA polymorphism）分析 (五)限制性片段长度多态性（RFLP）分析 (六)显微切割（microdissection）技术 (七)DNA序列测定（DNA sequencing）
2)把载玻片的靶DNA进行常规PCR(病毒RNA的扩 增用RT-PCR);
应用： 基因结构变异所致疾病的诊断。
特点： 杂交条件要求严格，以避免出现假阳性或 假阴性。
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ASOH示意图
ASO1 ASO2
N
H
M
N：正常基因；H：杂合子基因；M：突变基因
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4. DNA 芯片(DNA chip)技术
方法： DNA点阵 (DNA array)——把多种已知序 列的DNA片段排列在固体支持物上，同时 对样品中的多种核酸进行检测和分析。
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二、基因诊断的主要技术方法
(一)核酸分子杂交
Southern/DNA印迹、Northern/RNA印迹 (第七/六章) 和Western/蛋白质印迹(第九/二章)
其他杂交方法:
1.斑点印迹(dot blotting)与狭缝杂交
2. 组织原位杂交(tissure in situ hybridization ) 3. 等位基因特异性寡核苷酸杂交