第二章 分光光度技术
分光光度分析技术
第三节 分光光度分析技术有色溶液对光线有选择性的吸收作用，不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力也不同。
因此，每种物质都具有其特异的吸收光谱。
有些无色溶液，虽对可见光无吸收作用，但所含物质可以吸收特定波长的紫外线或红外线。
分光光度技术(分光光度法) 主要是指利用物质特有的吸收光谱来鉴定物质性质及含量的技术，其理论依据是Lambert 和Beer 定律。
分光光度法是比色法的发展，比色法只限于在可见光区，分光光度法则可以扩展到紫外光区和红外光区。
比色法用的单色光通过滤光片产生，谱带宽度为40-120nm ，精度不高，而分光光度法则要求近于真正单色光，其光谱带宽最大不超过3-5nm ，在紫外光区可到1nm 以下。
单色光通过棱镜或光栅产生，具有较高的精度。
一、基本原理分光分析法常被用来测定溶液中存在的光吸收物质的浓度，其理论依据是Lambert 和Beer 定律。
1、Lambert 定律：一束单色光在通过一溶液时，由于溶液吸收一部分光能，使光的强度减弱，若溶液的浓度不变，则溶液的厚度愈大，光线强度的减弱也愈显著。
2、Beer 定律：当一束单色光通过一溶液时，若溶液的厚度不变，则溶液浓度愈高，光线强度的减弱也愈显著。
3、Lambert--Beer 定律及其应用kcl I I -=0lg如果将通过溶液后的光线强度(I)和入射光(I0)的比值称为透光度(T)，将0lg I I-用光密度(OD 或D)表示该溶液对光线吸收的情况(有的也用吸光度A 表示)；则它们之间的关系如下：kcl T I I OD =-=-=lg lg 0其中：k 为常数，称为消光系数(E)，表示物质对光线吸收的本领，其值因物质种类和光线波长而异。
OD(或A)=ECL (1)从公式(1)可知，对于相同物质和相同波长的单色光(消光系数不变)来说，溶液的光密度和溶液的浓度呈正比。
22112121C OD OD C C C OD OD ⨯=⇔= (2)如果C2为标准溶液的浓度，则可根据测得的光密度值，按公式(2)求得待测溶液的浓度。
分光光度技术
• 721 可见分光光度计
• 722系列 可见分光光度计
• SP-756P紫外可见分光光度计
• TENSOR系列红外光谱仪
一、紫外-可见分光光度计的基本结构和工作原理
0.208
光源
单统
它包括5个基本部件：光源、单色器、吸收池、 检测器和测量仪表
紫外-可见分光光度计的基本结构示意图
• 分子对各个波长的光吸收程度不同，这是分子的 结构特性所决定的。
物质所发射的光是具有波粒二象性：
微粒性 波动性
E h hc
E 为光子的能量；ν为光波的频率（Hz）；h为普朗克常数（6.626）； c为光速（2.9977×108m／s）；λ为光波的波长
• 光波具有一定的频率。不同单色光的颜色不同，即因其频率不 同所致。
• 多光路吸收池（Multipie-path absorption cell）：在吸收池壁上装有反射镜，使光线在 溶液中经多次反射后才离开吸收池，大大增加 了有效光程，提高了测定的灵敏度。
检测器：把光信号转换为电信号的装置。 • 对检测器的要求：
1、产生的电信号与照射到它上面的光强有恒 定的函数关系； 2、波长响应范围大； 3、灵敏度高；
分光光度技术
• 分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质 或测定其含量的技术。
第一节 光学原理
把电磁波按频率大小，从频率最小的无线电波 到频率最大的γ射线排列，既为电磁波的波谱
电磁波谱
• 当光线通过某种物质的溶液时，透过 光的强度会减弱。因为它分成了三部 分：
• 一部分光在溶液的表面反射或分散， 一部分被组成此溶液的物质所吸收， 其余便是透过光的强度。即： 入射光=反射光+分散光+吸收光+透过 光
分光光度法
第二节分光光度法(一)基础知识分类号：P2-O一、填空题1．分光光度法测定样品的基本原理是利用朗伯—比尔定律，根据不同浓度样品溶液对光信号具有不同的，对待测组分进行定量测定。
答案：吸光度(或吸光性，或吸收)2．应用分光光度法测定样品时，校正波长是为了检验波长刻度与实际波长的，并通过适当方法进行修正，以消除因波长刻度的误差引起的光度测定误差。
答案：符合程度3．分光光度法测定样品时，比色皿表面不清洁是造成测量误差的常见原因之一，每当测定有色溶液后，一定要充分洗涤。
可用涮洗，或用浸泡。
注意浸泡时间不宜过长，以防比色皿脱胶损坏。
答案：相应的溶剂(1+3)HNO3二、判断题1．分光光度计可根据使用的波长范围、光路的构造、单色器的结构、扫描的机构分为不同类型的光度计。
( )答案：正确2．应用分光光度法进行试样测定时，由于不同浓度下的测定误差不同，因此选择最适宜的测定浓度可减少测定误差。
一般来说，透光度在20％～65％或吸光值在0.2～0.7之间时，测定误差相对较小。
( )答案：正确3．分光光度法主要应用于测定样品中的常量组分含量。
( )答案：错误正确答案为：分光光度法主要应用于测定样品中的微量组分。
4．应用分光光度法进行样品测定时，同一组比色皿之间的差值应小于测定误差。
( ) 答案：错误正确答案为：测定同一溶液时，同组比色皿之间吸光度相差应小于0.005，否则需进行校正。
5．应用分光光度法进行样品测定时，摩尔吸光系数随比色皿厚度的变化而变化。
( ) 答案：错误正确答案为：摩尔吸光系数与比色皿厚度无关。
三、选择题1．利用分光光度法测定样品时，下列因素中不是产生偏离朗伯—比尔定律的主要原因。
( )A．所用试剂的纯度不够的影响B．非吸收光的影响C．非单色光的影响D．被测组分发生解离、缔合等化学因素答案：A2．分光光度计波长准确度是指单色光最大强度的波长值与波长指示值。
( )A．之和B．之差C．乘积答案：B3．分光光度计吸光度的准确性是反映仪器性能的重要指标，一般常用标准溶液进行吸光度校正。
分光光度技术
3.吸收池
用于盛装试液的装置。吸收材料必须能够透过所测 光谱范围的光。一般可见光区使用玻璃吸收池，紫外光 区使用石英吸收池。 规格有0.5、1.0、2.0、5.0cm 等。
在高精度的分析测定中（紫外区尤其重要）吸收池 要挑选配对，因为吸收池材料的本身吸光特性以及吸收 池的光程长度的精度等对分析结果都有影响。
第六节 常见分光光度计
四、日本日立U2000紫外/可见分光光度计
吸收曲线图
0.300 0.200 0.100
400
500
600
第二节 光吸收的基本定律 Ir
Ia Io
It
设入射光，吸收光，透射光和反射光的强度依次为I o，I a，
I t，I r，则他们之间的关系为:
Io = Ia + It + Ir
T It Io
或 T % It 100% Io
T为透光度（transmittance）或透光率
一般情况，单独依靠紫外光吸收光谱不能决定一个未知
物质的结构，往往需要与红外、质谱等其它方法相配合。
第四节 分光光度计的基本构造
基本构造主要由光源、单色器、吸收池、检测器和显 示器五大部分组成。
光源 单色器 样品池 检测器
显示器
1.光源
在整个紫外光区或可见光区可以发射连 续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定 性、较长的使用寿命。
生物技术实验常用研究技术
——分光光度技术
➢比色分析法：利用比较溶液颜色深浅的 方法来确定溶液中有色物质的含量。
➢用分光光度计进行比色分析的方法称为分 光光度法。
物质对光的选择性吸收
溶液为什么有颜色，其实质是什么？
实验证明，溶液的颜色是由于均匀分布在溶液中 的有色化合物的质点选择性的吸收了某种颜色的光所 造成的。
第二章 分光光度法
2.2.2 能产生UV-VIS光谱的电子类型 A、 形成单键的电子—原子中的S、Px B、 形成双键的电子—原子中的Py、Pz
电子 C、 未成键的n电子—原子中的孤对电子
•• • •C
• •
o
O o
o o
•= =
o= n
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2.2.3 主要讨论的跃迁类型
A、 n
中可以扣除空白。
曲线A(吸光值)=xC(浓度)+z(截距), 此 空白值z 已经经过工作曲线的修正。
如果是单点测定，一般不宜扣除空白。 除非测定20次，且偏差在允许范围内。
Excel“趋势线格式”中选择截距不为零。
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空白有化学意义，用于检验试告数据时必须报告空白值。
*
** *** ** *
*
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偏差
工作曲线是否可以过原点？
试剂在工作曲线的其他点的溶液中同样存 在，量也一样，因此空白是工作曲线上被 测物为零时的一个点。空白所在的点不等 于原点。没有理由要求工作曲线通过每一 个点。
由于玻璃可吸收紫外光，所以玻璃棱镜只能用 于350-3200nm的波长范围，即只能用于可见光 域内。
石英棱镜可使用的波长范围较宽，可从185 -
4000nm，即可用于紫外、可见和近红外三个光域。
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示差分光光度法 具体做法：以浓度为cs的标准溶液调T=100% 或 A=0 (调零)，所测得的试样吸光度实际就是上
式中的A，然后求出c，则试样中该组份的 浓度为(cs+c)。
现代光学分析：第2章 双(三)波长分光光度法
∆A= A2 –(-A1)= A2 + A1
②.双波长法可以提高分析校准曲线斜率
提高灵敏度原因:
以二甲苯胺蓝Ⅱ测定镁为例, ①.1线和3线斜率相同,仅参比溶液不 同,当1线减去固定试剂空白的吸光度 值得3线. ②.2线是以相应过剩显色剂作参比测 定结果,既1线减4可得2线. ③.2线与3线相比,2线的斜率大大高 于3线.
双组分的测定-（1）等吸收法
对于双组分体系中某一组分的测定,实质上在测定任一组分 时,要选择两个合适的波长,使另一组分在这两个波长处具有 相等的吸光度,以达到消除干扰的效果.
对于含有吸收光谱相互重叠的 A,B组分来说,选择波长必须考 虑两个条件:
①.B组分在 两个波长处 具有相同的 吸光度,即
ΔAB=0
如果选择合适的波长使As`A s``，通过吸收池的两道光束的 光信号差：
-log I2 = A2 -A1=A I1
A=( a2 -a1)bc
双波长测定方法-（1）等吸收点法
等吸收点:指在某一波长上的吸光度 不随浓度的变化而发生改变.
如果吸光物质在不同浓度的吸收曲线 有若干个等吸收点,可以选择其中一 个等吸收点处的波长作为参比波长 （1），与吸收物质的吸收峰波长 （2 ）组合。
三波长法中三个波长的选择——等吸收点法和计算法
等吸收点法
如果在干扰组分的吸收光谱上能找到三个 等吸收点,而且在此三波长处测得的待测组 分ΔA值较大.
如选择的三个波长相应于干扰物吸收曲线上三点处于 一条直线上,则测得干扰物的ΔA为0.
当干扰组分的吸收曲线 为一直线(如浑浊产生的 干扰, 右图),则在任选的 三个波长处测定,测得的 ΔA与干扰物浓度无关.
2 分光光度技术
分光光度技术一．概念分光光度法（Spectrophotography），又称为比色法，它是利用物质特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术。
有色溶液对光线有选择性的吸收作用，不同物质由于其分子结构不同，对不同波长的光的吸收能力不同，因此，每种物质都具有其特异的吸收光谱。
比色法只限于可见光区，分光光度法可扩展到紫外光区和红外光区。
使用的光谱范围200－1000nm紫外光区：200－400nm可见光区：400－760nm红外光区：760－1000nm二．基本原理物质的吸收光谱与它们的本身的分子结构有关，不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力也不同。
每种物质都具有特定的吸收光谱，在一定条件下，其吸收程度与该物质浓度成正比，因此可利用各种物质不同的吸收光谱及其强度，对不同物质进行定性和定量分析。
分光光度法根据的原理是Lambert－Beer定律，该定律阐明了溶液对单色光吸收程度与溶液浓度及溶液厚度之间的关系。
1. 朗伯（Lambert）定律：当单色光通过一吸收光的介质时，其光强度随吸收光介质的厚度增加而成指数减少，即I / I0 = e－K1LI0：入射光强度，I：出射光强度，L：介质的厚度e: 自然对数的底，即2.718 K1: 溶液的吸光率ln（I0/I）= K1l换算成常用对数式，即log（I0/I）= 0.4343·K1l令K = 0.4343·K1则log（I0/I）= Kl此处以K为吸光率也就是说：在溶液浓度不变时，溶液对光的吸收随溶液厚度的增大而增大。
2. 比尔（Beer）定律：单色光通过一光吸收介质时，光强度随介质浓度增长而成指数减少，即I / I0 = e－K2LC：溶液浓度log（I0/I）= KC也就是说：溶液厚度不变时，溶液对光的吸收随溶液浓度的增大而增大。
3. Lambert－Beer定律如果同时考虑吸收溶液的浓度和厚度对光吸收的影响，将以上两式结合，则得出log（I0/I）= KCl令T =（I/I0） A = log（I0/I）则A = KCl=-—logTA为吸光度，T为透光度K（L·mol－1·cm－1）是一常数，即削光系数，也叫摩尔吸光度；三．计算1.标准管法（标准比较法）用一已知浓度的测定物按测定管同样处理显色，读出吸光度，在根据公式计算。
第二章 紫外-可见分光光度法-1
nm时，显色反应对比度为中等；
nm时，显色反应具有较高的对比度。
一般要求显色剂与有色化合物的对比度 在60 nm以上。
2. 对比度在实际分析测定中的意义
对比度实质上表示了显色反应颜色变化 的程度；反映了过量显色剂对测定体系的影 响。 如果显色反应的对比度大，则过量试剂 对测定的影响较小；反之，对比度小，则过 量试剂对测定的影响就比较大。
第二章 紫外-可见分光光度法 (Ultraviolet-Visible Spectrophotometry) 又称: 紫外-可见分子吸收光谱法 （Ultraviolet-Visible Molecular Absorption Spectrometry）
2.1 紫外－可见分光光度法发展简史 1729年，Bouguer首先发现溶液对光的 吸收与液层厚度之间的关系。 1760年 ，Lambert就此基本定律进行了 数学运算，确定了相应的关系式。 1833年，Brewster在提取叶绿素及胡萝 卜素的研究中，注意到有机化合物的吸收光 谱。
2.4 光吸收定律—朗伯-比耳定律 1. 朗伯-比耳定律(Lambert-Beer Law) （1）定义1： A= lg I/I为吸光度(Absorbance)。 其中：I和I分别为试样入射光强度和出 射光强度。
（2）朗伯-比尔定律的数学表达式为： n A= i ci l i=1 其中：i表示某一吸光质点。c为浓度， 单位mol/L；l为液层厚度，单位为cm；为 摩尔吸光系数，单位L/(mol▪cm)。
机理：过渡金属络合物中，由于配位体的 影响，中心离子的d轨道或f轨道能级发生分 裂。当过渡金属络合物吸收了可见或紫外光 区的某部分波长的光时，d电子或f电子就可 以从较低的能级跃迁到较高的能级，称为d -d跃迁或f -f跃迁。
紫外可见分光光度法课件
1
紫外-可见分光光度法
第一节 基本原理
一、紫外-可见吸收光谱（UV-VIS光谱）
• 起源：价电子能级跃迁 由于分子吸收紫外-可见光区的电磁辐射，分
子中价电子（或外层电子）的能级跃迁而产生。 紫外光谱—又称为电子光谱—分子吸收光谱
问题1：为何UV-Vis光谱吸收带都比较宽??
pH值降低（加酸）→ E2、B带蓝移，ε减
pH值增大（加碱）→E2、B带红移，ε增大
6
第二节 紫外可见分光光度计
• 仪器校正
1、波长校正
• 苯的吸收峰校正波长（紫外光区）。在25ml容量瓶内，滴入一滴苯(A.R.)， 用无水乙醇稀释至刻度，摇匀后，以无水乙醇为空白，在200～280nm间用 lcm石英池测定吸收度。 如下： 229.2 233.5 238.9 243.2 248.5 254.5 260.6 268.4
图8-4 (+)和(-)丁醇-2的ORD谱线
2）发色团(如羰基) R带：270 nm 。ORD曲线在此处越过零点，进入另一个相
区。形成的一个峰和一个谷组成的ORD谱线—Cotton效应谱线 正的Cotton效应：当波长由长波一端向短波一端移动时， ORD谱线由峰向谷变化 负的Cotton效应： ORD谱线由谷向峰变化 ORD谱线与零线相交点的波长称为λK
2.3.1 蛋白质的圆二色性
在蛋白质或多肽中，主要的光活性基团是肽链骨架中的肽键， 芳香氨基酸残基及二硫桥键。当平面圆偏振光通过这些光活性的 生色基团时，光活性中心对平面圆偏振光中的左、右圆偏振光的 吸收不相同，产生吸收差值。由于这种吸收差的存在， 造成了偏 振光矢量的振幅差，圆偏振光变成了椭圆偏振光，这就是蛋白质 的圆二色性。
紫外-可见分光光度法-N讲解
CH3
σ*
s键 s、s*轨道 孤对电子 n轨道
p键 p、p*轨道 π*
En
σ~σ*跃迁 > n~σ*跃迁 >
π
π~π*跃迁 > n~π*跃迁
σ
第一节 基本原理
一、紫外-可见吸收光谱与紫外-可见吸收光谱法 E h
二、紫外-可见吸收光谱的产生 吸收紫外-可见光产生分子能级跃迁
三、有机化合物的紫外-可见吸收
将光源发出 的复合光分 解为单色光
光源
连续光源 氘灯 卤钨灯 紫外光 可见光
单色器
棱镜 光栅
αθ
β
光
栅
d
公
衍射
式 d(sin sin ) nl
光栅单色器
凹面镜
匀 排 光 谱
反射 入射狭缝 光栅 出射狭缝
第二节 紫外-可见分光光度计
一、紫外可见分光光度计的组成 光源、单色器、吸收池、检测器
二、紫外可见分光光度计的主要部件
1.生色团与助色团 2.红移与蓝(紫)移 3.增色效应与减色效应
化合物结构改变或其他原因，使其吸收强度增强的现象 化合物结构改变或其他原因，使其吸收强度减弱的现象 4.紫外-可见吸收光谱与最大吸收波长
第一节 基本原理
一、紫外-可见吸收光谱与紫外-可见吸收光谱法 E h
二、紫外-可见吸收光谱的产生 吸收紫外-可见光产生分子能级跃迁
一、紫外-可见吸收光谱与紫外-可见吸收光谱法 甲苯E h
二、紫外-可见吸收光谱的产生 吸收紫外-可见光产生分子能级跃迁
苯
三、有机化合物的紫外-可见吸收 共轭体系，含杂原子 四、无机化合物的紫外-可见吸收 配合物 五、紫外-可见吸收光谱中的常见术语
1.生色团与助色团 能在紫外-可见光范围内产生吸收的基团 与生色团连接，能使生色团的吸收峰向长波方向移动的基团
第二章 紫外-可见分光光度法-2
（3）温度的影响 在分光光度法测定中，通常都选用室温 显色反应。当温度对显色反应速度可能有较 大的影响时，需要考虑温度的影响。 合适的温度可用单因素实验来确定。
（4）显色时间 这里包括两种时间：一种是由于显色反 应速度不同，达到反应完全所需的时间；另 一种是有色化合物维持稳定的时间。 这两种时间均可用单因素实验来考察。
c. 快速扫描分光光度计陆续问世 利用光分析可以跟踪化学反应历程，一 般分光光度计只适于历程为20~30 min以上的 反应，要研究速度较快的反应，就需要设计 出快速扫描分光光度计，如：多道分光光度 计（采用：多道光子检测器，整个光谱扫描 时间不到1 s）。
4. 仪器的最新进展 (1) 仪器的自动化程度大大提高；
精确求取摩尔吸收系数的方法是：在 不同带通宽度时测定表观摩尔吸收系数， 绘制表观摩尔吸收系数对带通宽度的曲线 关系图，将曲线外推到带通宽度为零处， 这时相应的摩尔吸收系构造、类型及 发展趋势 1. 构造 通常由以下5个部分组成— （1） 一个或多个辐射源； （2）波长选择器； （3）试样容器 (吸收池) ； （4）辐射换能器； （5）信号处理器和读出装置。
对吸收池的要求：主要是能透过所研究的 光谱区辐射线。
吸收池的两个光学面必须平整光洁，使用 时不能用手触摸。
按材料可分为：玻璃吸收池和石英吸收池 两种。
吸收池有多种尺寸和不同结构，吸收池 的光径可在0.1 cm~10 cm之间变化，其中以 1 cm光径吸收池最为常用，根据使用要求 选用。 在用于高浓度或低浓度测定时，可相 应地采用光径较小或较大的吸收池。
(3) 蓝移 由于取代基或溶剂极性的影响，使吸收 谱带的最大吸收波长向短波方向移动的现象 称为短移、紫移或蓝移。
分光光度法
吸收 外观有颜色的药物在可见光区有特征吸收 都可用紫外-可见分光光度法进行分析。
仪器
可见分光光度计
721型分光光度计
仪器
紫外-可见分光光度计
一、基本组成
光源
单色器
样品室
检测器
显示器
1. 光源
在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光
把分子吸收能量随波长变化的情况记录下来所得 的图谱为吸收光谱。
利用物质的吸收光谱进行定性、定量及结构分析 的方法称为吸收光谱法, 简称光谱法。
三、光的吸收定律
（一）百分透光率（T）和吸收度（A） 入射光 I0 → 吸收Ia → 透射It
I0 = Ia + It 透光率（描述入射光透过溶液的程度）
一、光的性质与波长范围
光的性质
光是一种电磁波，具有波粒二象性，即波动性和 粒子性。
光在传播时表现了光的波动性
一定的光波具有一定的波长 、频率 、光速c等 参数来描述:
c=
续前:
波长: 相邻两波峰或波谷之间的距离，波长的单位 可用纳米（nm），微米（um）表示:
1nm=10-3um=10-6mm=10-7cm=10-9m 频率（ ）: 是每秒内光波的振动次数，单位是
A=－lgT=ECL 朗伯-比尔定律适用于无色溶液、有色溶液及气
体和固体的非散射均匀体系。
（三）吸收系数
吸光物质在单位浓度、单位液层厚度时的吸收度。 A
E= CL
当溶液的浓度C的单位不同时，吸收系数的意义和表 示方法也不同，常用的表示方法有两种：
1、摩尔吸收系数：是指在一定波长下，溶液浓度为 1mol/L，液层厚度为1cm时的吸收度，用ε表示。
第二章 紫外-可见分光光度法-答案
第二章 紫外－可见分光光度法一、选择题1 物质的紫外 – 可见吸收光谱的产生是由于 ( B )A. 原子核内层电子的跃迁B. 原子核外层电子的跃迁C. 分子的振动D. 分子的转动2 紫外–可见吸收光谱主要决定于 ( C )A. 原子核外层电子能级间的跃迁B. 分子的振动、转动能级的跃迁C. 分子的电子结构D. 原子的电子结构3 分子运动包括有电子相对原子核的运动（E 电子）、核间相对位移的振动（E 振动）和转动（E 转动）这三种运动的能量大小顺序为 （ A ）A. E 电子>E 振动>E 转动B. E 电子>E 转动>E 振动C. E 转动>E 电子>E 振动D. E 振动>E 转动>E 电子4 符合朗伯-比尔定律的一有色溶液，当有色物质的浓度增加时，最大吸收波长和吸光度分别是 ( C )A. 增加、不变B. 减少、不变C. 不变、增加D. 不变、减少5 吸光度与透射比的关系是 ( B ) A. T A 1=B. TA 1lg = C. A = lg T D. A T 1lg = 6 一有色溶液符合比尔定律，当浓度为c 时，透射比为T 0，若浓度增大一倍时，透光率的对数为 ( D )A. 2T OB. 021TC. 0lg 21T D. 2lg T 07 相同质量的Fe 3+和Cd 2+ 各用一种显色剂在相同体积溶液中显色，用分光光度法测定，前者用2cm 比色皿，后者用1cm 比色皿，测得的吸光度值相同，则两者配合物的摩尔吸光系数为 ( C )已知：A r(Fe) = 55.85，A r(Cd) =112.4A. Cd Fe 2εε≈B. e d F C 2εε≈C. e d F C 4εε≈D. Cd Fe 4εε≈8 用实验方法测定某金属配合物的摩尔吸收系数ε，测定值的大小决定于 ( C )A. 入射光强度B. 比色皿厚度C. 配合物的稳定性D. 配合物的浓度9 以下说法正确的是 ( A )A. 吸光度A 随浓度增大而增大B. 摩尔吸光系数ε随浓度增大而增大C. 透光率T 随浓度增大而增大D. 透光率T 随比色皿加厚而增大10 下列表述中的错误是 ( A )A. 比色法又称分光光度法B. 透射光与吸收光互为补色光，黄色和蓝色互为补色光C. 公式bc II A ε==0lg 中，ε称为摩尔吸光系数，其数值愈大，反应愈灵敏 D. 吸收峰随浓度增加而增大，但最大吸收波长不变11 吸光光度分析中比较适宜的吸光度范围是 ( C )A. 0.1～0.5B. 0.1～1.2C. 0.2～0.8D. 0.2～1.512 若显色剂无色，而被测溶液中存在其它有色离子干扰，在分光光度法分析中，应采用的参比溶液是 ( D )A. 蒸馏水B. 显色剂C. 试剂空白溶液D. 不加显色剂的被测溶液13 采用差示吸光光度法测定高含量组分时，选用的参比溶液的浓度c s 与待测溶液浓度c x 的关系是 ( D )A. c s =0B. c s = c xC. c s > c xD. c s 稍低于c x14 桑德尔灵敏度S 与摩尔吸光系数ε的关系是 ( A ) A. εMS = B. 610⨯=εM S C. ε610⨯=M S D. M S ε= 15下列因素对朗伯-比尔定律不产生偏差的是 ( A )A. 改变吸收光程长度B. 溶质的离解作用C. 溶液的折射指数增加D. 杂散光进入检测器二、填空题1吸光光度法进行定量分析的依据是__朗伯-比耳定律，用公式表示为___A= εbc，式中各项符号各表示：A为吸光度，b为吸收介质厚度，ε为摩尔吸光系数，c为吸光物质的浓度。
2分光光度-仪器分析
七、操作方法
1.接通电源，打开仪器开关，掀开样品室暗箱盖， 预热10分钟。
2.将灵敏度开关调至“1”档（若零点调节器调不到 “0”时，需选用较高档。）
3.根据所需波长转动波长选择钮。 4.将空白液及测定液分别倒入比色杯3/4处，用擦镜
纸擦清外壁，放入样品室内，使空白管对准光路。 5.在暗箱盖开启状态下调节零点调节器，使读数盘
环境监测仪器分析技术 －分光光度法
一、分光光度计
分光光度计，又称光谱仪 (spectrometer)，是将成分复杂的光， 分解为光谱线的科学仪器。测量范围 一般包括波长范围为380~780 nm的可 见光区和波长范围为200～380 nm的 紫外光区。不同的光源都有其特有的 发射光谱,因此可采用不同的发光体作 为仪器的光源。
入射光 = 吸收光 十 透过光
六、原理
分光光度计采用一个可以产生多个波长的 光源，通过系列分光装置，从而产生特定 波长的光源，光线透过测试的样品后，部 分光线被吸收，计算样品的吸光值，从而 转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品 的浓度成正比。
单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物 质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度 （光路长度）成正比，其关系如下式：
九、日常维护
分析仪器工作者要懂得仪器的日常维护和 对主要技术指标的简易测试方法，自己经 常对仪器进行维护和测试，以保证仪器工 作在最佳状态。
一、温度和湿度是影响仪器性能的重 要因素。他们可以引起机械部件的锈蚀， 使金属镜面的光洁度下降，引起仪器机械 部分的误差或性能下降；造成光学部件如 光栅、反射镜、聚焦镜等的铝膜锈蚀，产 生光能不足、杂散光、噪声等，甚至仪器
用紫外光源测定无色物质的方法，称为紫 外分光光度法；用可见光光源测定有色物 质的方法，称为可见光光度法。它们与比 色法一样，都以Beer-Lambert定律为基础。 上述的紫外光区与可见光区是常用的。但 分光光度法的应用光区包括紫外光区，可 见光区，红外光区。
第二章 紫外-可见分光光度法
1、光源
作用：供给符合要求的入射光。 （1）可见光光源 常见的可见光光源有：钨丝灯和卤钨灯。 （2）紫外光光源 常见的紫外光光源有：氢灯和氘灯。 •另外，为了使光源发出的光在测量时稳定，光 源的供电一般都要用稳压电源，即加有一个稳 压器。
2、单色器
作用：把光源发出的连续光谱分解成单色光，并 能准确方便地“取出”所需要的某一波长的光， 它是分光光度计的心脏部分。 组成：单色器一般由狭缝、色散元件（棱镜和光 栅）、透镜系统组成。 （1）棱镜单色器 •玻璃棱镜：可吸收紫外光，只能用于可见光区域。 •石英棱镜：用于紫外、可见和近红外三个光区域。 （2）光栅单色器 •可用于紫外、可见及红外光区域，目前生产的紫外可见分光光度计大多采用光栅作为色散元件。
•可见分光光度计：使用波长范围是400～780nm， 只能用于测量有色溶液的吸光度 •紫外-可见分光光度计：使用波长范围是200～ 1000nm，可测量在紫外、可见、近红外有吸收 的物质的吸光度。
四、分光光度计的维护 1、仪器对工作环境的要求
•稳固、温度15～28℃、干燥、无腐蚀性气体、 光线不宜过强
•可见分光光度计：使用波长范围是400～780nm， 只能用于测量有色溶液的吸光度 •紫外-可见分光光度计：使用波长范围是200～ 1000nm，可测量在紫外、可见、近红外有吸收 的物质的吸光度。
2、紫外-可见分光光度计——双光束
•/vlabcq/flash/分光光度计/分光光度 计.html
二、紫外-可见分光光度计的类型及特点 1、按使用的波长范围分
•可见分光光度计：使用波长范围是400～780nm， 只能用于测量有色溶液的吸光度 •紫外-可见分光光度计：使用波长范围是200～ 1000nm，可测量在紫外、可见、近红外有吸收 的物质的吸光度。
第2章 紫外-可见分光光度法
高职高专“十一五”规划教材
KMnO4的颜色及吸收光谱
仪器分析
化学工业出版社
高职高专“十一五”规划教材 仪器分析
（1）同一物质在不同波长处测得的吸光度不同,吸光度
最大处所对应的波长叫 最大吸收波长λmax。 （2）不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相 似,λmax不变。浓度越高，吸光度越大。 （3）在λmax处测定，吸光度最大，灵敏度最高。通常选 择λmax作为定量分析中的入射光波长。
光的波长λ(cm)、频 率 (Hz) ，它们与光速 c的关系是：
c
化学工业出版社
高职高专“十一五”规划教材 仪器分析
光具有粒子性，每个光子的能量与其频率 或波长有关：
在真空介质中，光速为2.9979×1010cm/s。单个 光子的能量E与上述三要素的关系是：
E hv h
c
E－－光子的能量，J；h－－普朗克常数（6.625×10－34J· s）
化学工业出版社
高职高专“十一五”规划教材 仪器分析
引言：什么是紫外-可见分光光度法？
是根据物质分子对波长为200760nm这一范围的电磁波的吸收特性所 不 建立起来的一种定性、定量和结构分析方 同 的 法。 光
化学工业出版社
高职高专“十一五”规划教材
§2.2.3 吸收定律
透光率和吸光度
仪器分析
光的吸收定律 基 本 原 理 郎伯-比尔定律
主要内容
§2.2.1 光的基本特性
§2.2.2 物质对光的选择性吸收 §2.2.3 吸收定律
化学工业出版社
高职高专“十一五”规划教材
§2.2.1 光的基本特性
波速（c） 波长（λ） 频率（υ） 周期 （T） 波数（σ ）
分光光度技术
分光光度技术基本原理利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱，利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法，称为分光光度法或分光光度技术，使用的仪器称为分光光度计，这种分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用范围广，其中的紫外/可见分光光度技术更是生物化学研究工作中必不可少的基本手段之一。
因此本章重点讨论紫外/可见分光光度法的基本原理、仪器构造及其在生化领域中的应用等。
1. 光谱：光是电磁波，可用波长“λ”表示，电磁波谱是由不同性质的连续波长的光谱所组成，对于生物化学来说，最重要的波长区域是可见光和紫外光。
光的波长是二个相邻的波峰之间的距离。
光的传播是由相互垂直的电场分量“E”和磁场分量“H”所构成。
λ＝C/νλ——波长C——光速ν——频率，单位时间通过一个定点的波数。
光又可以看作是由具有能量的粒子所组成。
这些粒子所具有的原能量“E”由下式算出：E＝h·νH——普朗克常数（ 6.624×10-27尔格·秒）ν——频率紫外区可分为紫外（近紫外）和真空紫外（远紫外）。
由于吸收池（又称样品池、比色杯等）和光学元件以及氧气能吸收小于190nm波长的光，因此常规紫外测定集中在近紫外区，即200nm～400nm。
可见光区为400nm～800nm。
组成物质的分子均处于一定能态并不停地运动着，分子的运动可分为平动、转动、振动和分子内电子的运动，每种运动状态都处于一定的能级，因此分子的能量可以写成：E＝E0+E平+E转+E振+E电E0是分子内在的不随分子运动而改变的能量，平动能E平只是温度的函数，因此与光谱有关的能量变化是分子的转动能量、振动能量和分子的电子能量。
分子的每一种能量都有一系列的能级，能级不是任意的，而是具有量子化特征的，通常分子处于基态，当它吸收一定能量跃迁到激发态，则产生吸收光谱。
分子转动、振动和电子能级的跃迁，相应地产生转动、振动及电子光谱。
按照量子力学原理，分子能态按一定的规律跳跃式地变化，物质在入射光的照射下，分子吸收光时，其能量的增加是不连续的，物质只能吸收一定能量的光，吸收光的频率和两个能级间的能量差要符合下列关系：E＝E2- E1＝hE1、E2分别表示初能态和终能态的能量，初能态与终能态之间的能量差愈大，则所吸收的光的频率愈高（即波长愈短），反之则所吸收的光的频率愈低（即波长愈长）。
第二章分光光度法
第五节 测量误差和测量条件的选择
•
1、测量误差 许多误差来自吸光度的定量测定。光度测定过程 包括两个阶段：第一阶段是化学过程，即利用各种 化学反应将待测组分的溶液用适当的试剂处理，使 待测组分转变为一定组成的化合物，包括有色化合 物及各种络合物；第二阶段是物理过程，即将经第 一阶段处理的样品置于仪器中测定吸光度或绘制吸 收光谱。因此，测定过程中的误差可以分成: • 化学误差 • 仪器的误差 • 人为的误差
第七节 分光光度计
•
1 、分光光度计
• 仪器简介
任何类型的分光光度计都配备下列组成部 分：光源、单色器、吸收池、检测器和显示 仪表等。 国内比较常用的紫外－可见分光光度计有 单光束和双光束两种类型。
24
仪器的装置原理
单光束装置
光源 单色仪 空白或样 品吸收器 空白 检测器
单光束分光光度计
双光束装置
分光光度法
1概述 2朗白比尔定律 3显色反应 4显色剂
5测量误差及测量条件
6示差分光光度法 7分光光度计
1
h
c c
第一节 分光光度法概述
1、电磁辐射
光是电磁辐射。电磁辐射具有粒子的性质，也具 有波动的性质，其波动性可用波长（）来表示 。所谓波长即指在波传播路线上具有相同振动位 相的相邻两点之间的距离。电磁辐射的粒子性的 主要特征是每个光子具有能量，其与波长之间的 关系为：
＝ｈ•ｃ/λ 。
2
电磁辐射按波长顺序排列，称为电磁波谱
波长范围 0.0001～10nm 频率范围(MHZ) 3×1014～3×1010 跃进能级类型 核能级 内层电子能级 0.005～0.14nm 6×1014～2×1012
分光光度技术3-4
分光光度技术的基本应用
❖ 结构分析
❖ 作为结构分析，紫外吸收光谱远不及红外吸收光谱重要可靠， 因为紫外吸收光谱曲线的特征性不及红外光谱曲线，红外光 谱曲线属‘指纹’型，而大多数有机化合物在紫外光区无吸 收。
❖ 利用紫外吸收光谱可鉴定化合物中具有共轭系统和芳环结构。
❖ 不同物质可能有相同的最大吸收波长，但其吸光系 数不一定相同。K值愈大，说明该物质溶液对光吸 收愈强烈，则比色测定的灵敏度愈高。
分光光度技术基本原理
❖ 吸光度“A”有一个重要性质是其具有加和性： ❖ A＝k1L1C1＋k2L2C2＋k3L3C3＋……
❖ 即混合物的总吸光度等于溶液中的各组份各 自在该波长下吸光度的算术和。这是多元混 合物分光光度法定量分析的基础。
❖
可见或紫外分光光度法都可用于测定溶液中物质的含量。测定标准溶液
（浓度已知的溶液）和未知液（浓度待测定的溶液）的吸光度，进行比较，由
于所用吸收池的厚度是一样的。也可以先测出不同浓度的标准液的吸光度，绘
制标准曲线，在选定的浓度范围内标准曲线应该是一条直线，然后测定出未知
液的吸光度，即可从标准曲线上查到其相对应的浓度。
❖
分光光度计的应用----定量分析
❖ 混合样品的定量分析 ❖ 吸收光谱不重叠的混合物定量方法 -----互不干扰 分别测定 ❖ 吸收光谱重叠的混合物定量方法
❖ 采用化学计量学方法可以克服光谱定量分析中出现的多重共线性、光谱重叠和组 分的相互干扰等问题, 并且不需分离可直接同时测定混合体系的各组分。因此发 展了如主成分回归( PCR) 、小波包变换、人工神经网络( ANN) 以及遗传算法等 多种线性或非线性的多元校准方法, 波长选择是光谱分析中各种多元校准方法的 关键步骤。
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4、仪器连续使用时间不应超过2 h，每次使用后需
根据实验要求，转动波长调节器，使 指针指示所需要的单色光波长。
3、固定灵敏度档： 根据有色溶液对光的吸收情况，为使吸 光度读数为0.2-0.7，选择合适的灵敏度。为 此，旋动灵敏度档，使其固定于某一档， 在实验过程中不再变动。 一般测量固定在“1”档。
4、调节“0”点： 轻轻旋动调“0”电位器，使读数表头指针恰
A
280nm
Λ(nm)
实际测试原则： 1．应使被测溶液的吸光度为0.1-0.7，而以0.2-0.6 最理想。过低的吸光度因仪器的读数误差而产生很 大的相对误差。反之，过高的吸光度则往往已超过 直线范围而引入误差。 2．应使干扰影响降低至最低限度。在反应中，如 遇不易去除的干扰色泽，应选用对此干扰色泽最不 灵敏的波长。 3．应使标准曲线在尽可能大的范围内接近直线。
红光 蓝光 紫外光
衍射光栅：即在石英或玻璃的表面上刻划 许多平行线，刻线处不透光，于是通过 光的干涉和衍射现象，较长的光波偏折 的角度大，较短的光波偏折的角度小， 因而形成光谱。
（三）狭缝 狭缝是指由一对隔板在光通路上形成的缝隙， 用来调节入射单色光的纯度和强度。 狭缝可在0－2mm宽度内调节，由于棱镜色 散力随波长不同而变化，较先进的分光光度计 的狭缝宽度可随波长一起调节。
（二）分光系统（单色器）
定义：单色器是指能从混合光波中分解出来所需单 一波长光的装置，由棱镜或光栅构成。 作用：根据需要选择一定波长范围的单色光。 单色光：是指在此波长有最大发射，而在相邻较长 和较短波长范围内的发射能量较少。
常用的分光系统：
光学玻璃棱镜：色散力强，能在可见光区 工作； 石英棱镜：工作波长范围为185-4000nm， 在紫外区有较好的分辩力，而且也适用 于可见光区和近红外区。
第二章 分光光度技术
分光光度技术（分光光度法）是利用物质对 某种波长的光具有选择性吸收的特性建立起来的 鉴别物质或测定其含量的一项技术。 其理论依据是Lambert和Beer定律。
分光光度法的发展历程： 1852年，Beer参考了 Bouguer1729年和 Lambert在1760年所发表的文章，提出了分光 光度的基本定律，即液层厚度相等时，颜色的 强度与呈色溶液的浓度成比例，从而奠定了分 光光度法的理论基础，这就是著名的朗伯-比 尔定律。
3、吸光度测量： ①按方式选择(mode)键选ABS档，进行测定。
②拉动样品拉手使被测样品依次进入光路，则显
示器上依次显示样品的吸光度值。
三、722型分光光度计的使用 1、预热；比色杯倒入待测样品 2、调节波长 3、开盖“T”位，调“0”旋钮 4、关盖“A”位,调“100”旋钮 5、测定
四、分光光度计使用注意事项：
1854年，Duboscq和 Nessler等人将此理论应用于定 量分析化学领域，并且设计了第一台比色计。 1918年，美国国家标准局制成了第一台紫外可见 分光光度计。
此后，紫外可见分光光度计经不断改进，又 出现自动记录、自动打印、数字显示、微机控制 等各种类型的仪器，使光度法的灵敏度和准确度 也不断 提高，其应用范围也不断扩大。
L
根据Lambert-Beer定律，吸光度与溶液的 浓度成正比，与光束通过溶液的距离(即光程) 成正比，用数学表达式表示为： A=KCL 式中C代表该物质的浓度，L代表光程，一般 以cm表示。
当C的单位用mol· L－1，L用cm时，常数K用ε 表示，其单位为L· mol－1 · cm－1，ε称为摩尔吸光系 数，此时上式变为： A = εCL 摩尔吸光系数ε:是待测物质浓度C为1mol· L－1，液层 厚度为1cm时，在特定波长下所具有的吸光度。ε 值越大，表示有色物质对该波长光的吸收能力越 强，有色物质的颜色越深，测定的灵敏度也就越 高。
第三节
分光光度计的使用
一、72l型分光光度计的使用 721型分光光度计是一种国产、常用的可见分 光光度计，适用于400～760nm的波长范围。
仪器的使用时应注意： 1、预热仪器： 打开电源开关，使仪器预热20min。 为了防止光电管疲劳，预热仪器时和在 不测定时应将比色皿暗箱盖打开，使光 路切断。 2、选定波长：
1、为了防止光电管疲劳。不测定时必须将 比色皿暗箱盖打开，使光路切断，以延 长光电管使用寿命。
2、比色皿的使用方法： （1）拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面， 不要碰比色皿的透光面，以免沾污，不得将光学 面与硬物或脏物接触。 （2）盛装溶液时，高度为比色皿的2/3处即可，光学 面如有残液可先用滤纸轻轻吸附，然后再用镜头 纸或丝绸擦拭。
第一节
分光光度法的基本原理及应用
一、光吸收基本定律——朗伯－比尔（Lambert-Beer） 定律 当一束单色光通过溶液时，一部分被吸收，一 部分则透过溶液。 设入射光强度为I0，透射光强度为It： 则透光度 T= It/I o I0 It 吸光度(A)或光密度(O.D.) 则可表示为A= -lgT。 C
（四）比色杯 比色杯也叫样品池、吸收器或比色皿，是光 度测量系统的最重要部分之一。 1、光学玻璃比色杯：在可见光范围内测量时选用 2、石英比色杯：在紫外线范围内测量时要选用。 比色杯光程一般设定为1cm： 容积为:1cm×1cm×3cm 2cm×1cm×3cm 0.5cm×1cm×3cm
（五）检测器系统 有许多金属能在光的照射下产生电流，光 愈强电流愈大，此即光电效应。 因光照射而产生的电流叫做光电流。 常用受光器：硒光电池、光电管或光电倍增管 可将通过比色杯的光线的能量转变成电能， 进一步再用适当的方法测量所产生的电流。
A
由 A=εLC
推Hale Waihona Puke C=εL第二节分光光度计
能从含有各种波长的混合光中将每一 单色光分离出来并测量其强度的仪器称 为分光光度计。
一、分光光度计的类型 （一）按仪器使用的光学系统 单波长分光光度计 双波长分光光度计 单光束分光光度计 双光束分光光度计。
（二）按仪器的使用波长 可见光分光光度计 紫外分光光度计 红外分光光度计 全波段分光光度计 荧光分光光度计 火焰分光光度计
光电比色计用硒光电池为受光器。 光电池受光照射产生的电流颇大，可直接用微 电流计量出。但是，当连续照射一段时间会产 生疲劳现象而使光电流下降，要在暗中放置一 些时候才能恢复。因此使用时不宜长期照射， 随用随关，以防止光电池因疲劳而产生误差。
较精密的分光光度计都是采用真空光电管或光 电倍增管作为受光器，并采用放大装置以提高 敏感度。 虽然光谱范围狭窄的单色光的能量比范围宽的 弱很多，但这种有放大线路的灵敏检测系统仍 可能准确地检测出来。
（6）不能将比色皿放在火焰或电炉上进行加热 或干燥箱内烘烤； （7） 在测量时如对比色皿有怀疑，可自行检测。 用户可将波长选择置实际使用的波长上，将一 套比色皿都注入蒸馏水，将其中一只的透射比 调至95%（数显仪器调置100%）处，测量其他 各只的透射比，凡透射比之差不大于0.5%即可 配套使用
3、一般应把溶液浓度尽量控制在吸光度值0.1-07的 范围内进行测定。这样所测得的读数误差较小。
(二)利用标准曲线进行换算： 先配制一系列已知不同浓度的标准溶液， 按测定管同样方法处理显色，分别读取各管光 密度，以各管光密度为纵轴，各管浓度为横轴，
在方格坐标纸上作图得标准曲线，以测定管光
密度从标准曲线上可求得测定物的浓度。
(三)直接利用公式进行计算
如果已知摩尔消光系数ε，则可直接利
用公式进行计算求得物质的浓度。
6、测定：轻轻拉动比色皿座架拉杆，使有色溶 液进入光路，此时表头指针所示为该有色溶液
的吸光度A。读数后，打开比色皿暗箱盖。
7、关机：实验完毕，切断电源，将比色皿取出 洗净，并将比色皿座架及暗箱用软纸擦净。
二、SP-722E型分光光度计的使用 1、准备： ①打开仪器电源开关，预热10分钟； ②设置所需波长。 2、调零： ①放入挡光块， 盖好样品室盖，按“0%T”调 透射比零。 ②取出挡光块，放置空白（第一槽位）及样品 ， 并使空白溶液处在光路中。
（3）凡含有腐蚀玻璃的物质的溶液，不得长期 盛放在比色皿中。
（4） 比色皿在使用后，应立即用水冲洗干净。 必要时可用1：1的盐酸浸泡，然后用水冲洗干 净。不能用碱溶液或氧化性强的洗涤液洗比色 皿，以免损坏。也不能用毛刷清洗比色皿，以 免损伤它的透光面。每次做完实验时，应立即 洗净比色皿。
（5）在测定一系列溶液的吸光度时，通常都按 由稀到浓的顺序测定，以减小测量误差。
2、标准液的测定： 在比色时，读取吸光度至少读2-3次， 求其平均值，以减少仪器不稳定而产生的 误差。 3、标准曲线图的绘制： 一般常用的是吸光度-浓度标准曲线。 可用普通方格纸作图，也可利用计算器进 行统计学处理。
四、待测溶液浓度的计算： （一）利用标准管法计算待测溶液的浓度： 在同样实验条件下同时测得标准管和待测管 的吸光度值，然后进行计算： 根据Lambert-beer定律： 标准管：As = KCSL (下标S：标准液) 待测管：Ax＝KCxL (下标X：待测液) 两种溶液的液层厚度、温度相同，测定同一 物质所用单色光相同，则两式相比得： As Cs = Ax Cx 即 Ax Cx = As Cs
二、波长的选择
原则： 波长的选择一般是选择待测物质最大吸收峰
的波长(λmax)。
因在λmax测定吸光度，敏感度最高。在吸 收峰波长处测吸光度，波长变化影响最小；而 在其他波长处，波长变化对吸光度影响大，甚 至测得浓度-吸光度曲线不呈直线。
常用方法：选择测定某一溶液所需的波长，可以 用不同的波长作该溶液的吸收光谱曲线，从曲 线上选择最适当的波长来进行这一溶液的测定 工作。
三、标准曲线的绘制 标准曲线：
配制一系列不同浓度的标准溶液,按测定管 方法进行吸光度测定。以吸光度为纵坐标，以 标准液浓度为横坐标，绘出一条曲线，此曲线 即称为标准曲线又叫做校正曲线或工作曲线。