第二章 分光光度技术

三、标准曲线的绘制 标准曲线：
配制一系列不同浓度的标准溶液,按测定管 方法进行吸光度测定。以吸光度为纵坐标，以 标准液浓度为横坐标，绘出一条曲线，此曲线 即称为标准曲线又叫做校正曲线或工作曲线。
A
C
（一）标准曲线的作用 1、从浓度- 吸光度之间的直线特性，可以 判断所采用方法是否符合Lamben-Beer氏 定律。
6、测定：轻轻拉动比色皿座架拉杆，使有色溶 液进入光路，此时表头指针所示为该有色溶液
的吸光度A。读数后，打开比色皿暗箱盖。
7、关机：实验完毕，切断电源，将比色皿取出 洗净，并将比色皿座架及暗箱用软纸擦净。
二、SP-722E型分光光度计的使用 1、准备： ①打开仪器电源开关，预热10分钟； ②设置所需波长。 2、调零： ①放入挡光块， 盖好样品室盖，按“0%T”调 透射比零。 ②取出挡光块，放置空白（第一槽位）及样品 ， 并使空白溶液处在光路中。
第二章 分光光度技术
分光光度技术（分光光度法）是利用物质对 某种波长的光具有选择性吸收的特性建立起来的 鉴别物质或测定其含量的一项技术。 其理论依据是Lambert和Beer定律。
分光光度法的发展历程： 1852年，Beer参考了 Bouguer1729年和 Lambert在1760年所发表的文章，提出了分光 光度的基本定律，即液层厚度相等时，颜色的 强度与呈色溶液的浓度成比例，从而奠定了分 光光度法的理论基础，这就是著名的朗伯-比 尔定律。
（二）分光系统（单色器）
定义：单色器是指能从混合光波中分解出来所需单 一波长光的装置，由棱镜或光栅构成。 作用：根据需要选择一定波长范围的单色光。 单色光：是指在此波长有最大发射，而在相邻较长 和较短波长范围内的发射能量较少。
常用的分光ห้องสมุดไป่ตู้统：
光学玻璃棱镜：色散力强，能在可见光区 工作； 石英棱镜：工作波长范围为185-4000nm， 在紫外区有较好的分辩力，而且也适用 于可见光区和近红外区。
好位于透光度为“0”处（此时，比色皿暗箱盖是
打开的，光路被切断，光电管不受光照）。
5、调节T=100％： 将盛蒸馏水（或空白溶液或纯溶剂）的比色 皿放入比色皿座架中的第一格内，有色溶液放在 其它格内，把比色皿暗箱盖子轻轻盖上，转动光 量调节器，使透光度T=100％，即表头指针恰好 指在T=100％处。

第三节
分光光度计的使用
一、72l型分光光度计的使用 721型分光光度计是一种国产、常用的可见分 光光度计，适用于400～760nm的波长范围。
仪器的使用时应注意： 1、预热仪器： 打开电源开关，使仪器预热20min。 为了防止光电管疲劳，预热仪器时和在 不测定时应将比色皿暗箱盖打开，使光 路切断。 2、选定波长：
2、作多次平行测定绘制标准曲线，可判断 在整个测定过程中操作，仪器等误差的 大小，从而确定该测定方法的可靠性。
3、从绘制标准曲线的斜率可以比较各种方 法的灵敏度。 4、当进行大批样品分析时，可省略多次计 算，从吸光度值直接查阅标准曲线而求 得被测物质的浓度。
（二）标准曲线的作法 1、标准液浓度的选择： 在制备标准曲线时，标准液浓度选 择一般应能包括待测样品的可能变异最 低与最高值，一般可选择5种浓度。浓度 差距最好是成倍增加或等级增加，并应 与被测液同样条件下显色测定。
A
280nm
Λ(nm)
实际测试原则： 1．应使被测溶液的吸光度为0.1-0.7，而以0.2-0.6 最理想。过低的吸光度因仪器的读数误差而产生很 大的相对误差。反之，过高的吸光度则往往已超过 直线范围而引入误差。 2．应使干扰影响降低至最低限度。在反应中，如 遇不易去除的干扰色泽，应选用对此干扰色泽最不 灵敏的波长。 3．应使标准曲线在尽可能大的范围内接近直线。
（3）凡含有腐蚀玻璃的物质的溶液，不得长期 盛放在比色皿中。
（4） 比色皿在使用后，应立即用水冲洗干净。 必要时可用1：1的盐酸浸泡，然后用水冲洗干 净。不能用碱溶液或氧化性强的洗涤液洗比色 皿，以免损坏。也不能用毛刷清洗比色皿，以 免损伤它的透光面。每次做完实验时，应立即 洗净比色皿。
（5）在测定一系列溶液的吸光度时，通常都按 由稀到浓的顺序测定，以减小测量误差。
第一节
分光光度法的基本原理及应用
一、光吸收基本定律——朗伯－比尔（Lambert-Beer） 定律 当一束单色光通过溶液时，一部分被吸收，一 部分则透过溶液。 设入射光强度为I0，透射光强度为It： 则透光度 T= It/I o I0 It 吸光度(A)或光密度(O.D.) 则可表示为A= -lgT。 C
根据实验要求，转动波长调节器，使 指针指示所需要的单色光波长。
3、固定灵敏度档： 根据有色溶液对光的吸收情况，为使吸 光度读数为0.2-0.7，选择合适的灵敏度。为 此，旋动灵敏度档，使其固定于某一档， 在实验过程中不再变动。 一般测量固定在“1”档。
4、调节“0”点： 轻轻旋动调“0”电位器，使读数表头指针恰
（四）比色杯 比色杯也叫样品池、吸收器或比色皿，是光 度测量系统的最重要部分之一。 1、光学玻璃比色杯：在可见光范围内测量时选用 2、石英比色杯：在紫外线范围内测量时要选用。 比色杯光程一般设定为1cm： 容积为:1cm×1cm×3cm 2cm×1cm×3cm 0.5cm×1cm×3cm
（五）检测器系统 有许多金属能在光的照射下产生电流，光 愈强电流愈大，此即光电效应。 因光照射而产生的电流叫做光电流。 常用受光器：硒光电池、光电管或光电倍增管 可将通过比色杯的光线的能量转变成电能， 进一步再用适当的方法测量所产生的电流。
（6）不能将比色皿放在火焰或电炉上进行加热 或干燥箱内烘烤； （7） 在测量时如对比色皿有怀疑，可自行检测。 用户可将波长选择置实际使用的波长上，将一 套比色皿都注入蒸馏水，将其中一只的透射比 调至95%（数显仪器调置100%）处，测量其他 各只的透射比，凡透射比之差不大于0.5%即可 配套使用
3、一般应把溶液浓度尽量控制在吸光度值0.1-07的 范围内进行测定。这样所测得的读数误差较小。
二、波长的选择
原则： 波长的选择一般是选择待测物质最大吸收峰
的波长(λmax)。
因在λmax测定吸光度，敏感度最高。在吸 收峰波长处测吸光度，波长变化影响最小；而 在其他波长处，波长变化对吸光度影响大，甚 至测得浓度-吸光度曲线不呈直线。
常用方法：选择测定某一溶液所需的波长，可以 用不同的波长作该溶液的吸收光谱曲线，从曲 线上选择最适当的波长来进行这一溶液的测定 工作。
A
由 A=εLC
推出 C=
εL
第二节
分光光度计
能从含有各种波长的混合光中将每一 单色光分离出来并测量其强度的仪器称 为分光光度计。
一、分光光度计的类型 （一）按仪器使用的光学系统 单波长分光光度计 双波长分光光度计 单光束分光光度计 双光束分光光度计。
（二）按仪器的使用波长 可见光分光光度计 紫外分光光度计 红外分光光度计 全波段分光光度计 荧光分光光度计 火焰分光光度计
2、标准液的测定： 在比色时，读取吸光度至少读2-3次， 求其平均值，以减少仪器不稳定而产生的 误差。 3、标准曲线图的绘制： 一般常用的是吸光度-浓度标准曲线。 可用普通方格纸作图，也可利用计算器进 行统计学处理。
四、待测溶液浓度的计算： （一）利用标准管法计算待测溶液的浓度： 在同样实验条件下同时测得标准管和待测管 的吸光度值，然后进行计算： 根据Lambert-beer定律： 标准管：As = KCSL (下标S：标准液) 待测管：Ax＝KCxL (下标X：待测液) 两种溶液的液层厚度、温度相同，测定同一 物质所用单色光相同，则两式相比得： As Cs = Ax Cx 即 Ax Cx = As Cs
L
根据Lambert-Beer定律，吸光度与溶液的 浓度成正比，与光束通过溶液的距离(即光程) 成正比，用数学表达式表示为： A=KCL 式中C代表该物质的浓度，L代表光程，一般 以cm表示。
当C的单位用mol· L－1，L用cm时，常数K用ε 表示，其单位为L· mol－1 · cm－1，ε称为摩尔吸光系 数，此时上式变为： A = εCL 摩尔吸光系数ε:是待测物质浓度C为1mol· L－1，液层 厚度为1cm时，在特定波长下所具有的吸光度。ε 值越大，表示有色物质对该波长光的吸收能力越 强，有色物质的颜色越深，测定的灵敏度也就越 高。

光电比色计用硒光电池为受光器。 光电池受光照射产生的电流颇大，可直接用微 电流计量出。但是，当连续照射一段时间会产 生疲劳现象而使光电流下降，要在暗中放置一 些时候才能恢复。因此使用时不宜长期照射， 随用随关，以防止光电池因疲劳而产生误差。

较精密的分光光度计都是采用真空光电管或光 电倍增管作为受光器，并采用放大装置以提高 敏感度。 虽然光谱范围狭窄的单色光的能量比范围宽的 弱很多，但这种有放大线路的灵敏检测系统仍 可能准确地检测出来。
二、分光光度计的结构 无论哪一类分光光度计都由下列五部分组成。 光源 单色器 狭缝 样品池 检测器系统
（一）光源 分类： 连续光源：主要用于分子光谱的测定 线光源：主要用于分子发射光谱、原子吸收 光谱和拉曼散射光谱的分析。
常用的的连续光谱：有三类
1、紫外光源：由能产生连续光谱的紫外灯提供光源， 常用的紫外灯有氢灯、氘灯。氢灯和氘灯能发射 150－400nm的紫外光。 2、可见光源：由能产生连续光谱的可见灯提供光源， 常用的有卤钨灯、钠灯等，卤钨灯发射320－ 2000nm连续光谱。 3：红外光源：由纳恩斯特（Nernst）棒产生。
红光 蓝光 紫外光
衍射光栅：即在石英或玻璃的表面上刻划 许多平行线，刻线处不透光，于是通过 光的干涉和衍射现象，较长的光波偏折 的角度大，较短的光波偏折的角度小， 因而形成光谱。
（三）狭缝 狭缝是指由一对隔板在光通路上形成的缝隙， 用来调节入射单色光的纯度和强度。 狭缝可在0－2mm宽度内调节，由于棱镜色 散力随波长不同而变化，较先进的分光光度计 的狭缝宽度可随波长一起调节。
(二)利用标准曲线进行换算： 先配制一系列已知不同浓度的标准溶液， 按测定管同样方法处理显色，分别读取各管光 密度，以各管光密度为纵轴，各管浓度为横轴，
在方格坐标纸上作图得标准曲线，以测定管光
密度从标准曲线上可求得测定物的浓度。
(三)直接利用公式进行计算
如果已知摩尔消光系数ε，则可直接利
用公式进行计算求得物质的浓度。
1854年，Duboscq和 Nessler等人将此理论应用于定 量分析化学领域，并且设计了第一台比色计。 1918年，美国国家标准局制成了第一台紫外可见 分光光度计。
此后，紫外可见分光光度计经不断改进，又 出现自动记录、自动打印、数字显示、微机控制 等各种类型的仪器，使光度法的灵敏度和准确度 也不断 提高，其应用范围也不断扩大。
4、仪器连续使用时间不应超过2 h，每次使用后需
1、为了防止光电管疲劳。不测定时必须将 比色皿暗箱盖打开，使光路切断，以延 长光电管使用寿命。
2、比色皿的使用方法： （1）拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面， 不要碰比色皿的透光面，以免沾污，不得将光学 面与硬物或脏物接触。 （2）盛装溶液时，高度为比色皿的2/3处即可，光学 面如有残液可先用滤纸轻轻吸附，然后再用镜头 纸或丝绸擦拭。
分光光度法和比色法的比较 比色法 分光光度法 波长范围 可见光区 可见光区、紫外光区和 红外光区 单色光产生 滤光片 棱镜或光栅 谱带宽度 40～120 nm 3～5 nm 在紫外光区可到1 nm以下 光谱范围 在200nm-10μ之间 其中200nm－400nm为紫外光区 400nm－760nm为可见光区 760nm－10,000nm为红外光区
3、吸光度测量： ①按方式选择(mode)键选ABS档，进行测定。
②拉动样品拉手使被测样品依次进入光路，则显
示器上依次显示样品的吸光度值。
三、722型分光光度计的使用 1、预热；比色杯倒入待测样品 2、调节波长 3、开盖“T”位，调“0”旋钮 4、关盖“A”位,调“100”旋钮 5、测定

四、分光光度计使用注意事项：