基因克隆与表达
基因克隆和表达技术及其应用研究
基因克隆和表达技术及其应用研究在现代生物技术领域，基因克隆和表达技术被广泛应用于生物医药、农业生产、环境保护等多个领域，是一项重要的研究方向。
本文将介绍基因克隆和表达技术的原理、工具和应用，旨在深入探讨该技术在现代生物科技领域中的应用价值。
一、基因克隆的原理与工具基因克隆是指将目标DNA片段放入载体中，通过复制和传递，获得大量相同的DNA分子的过程。
基因克隆需要用到一系列工具和分子生物学技术。
其基本的步骤包括：DNA提取、限制酶切割、连接和转化等。
DNA提取是指从细胞中获取目标DNA，一般从细胞核中提取DNA样品。
限制酶切割是一种利用特定的限制酶将DNA切割成不同长度的碎片的技术。
连接是指将目标DNA片段与载体DNA进行配对，在适当的连接条件下会形成一个大的DNA分子，也称作重组DNA。
最后的转化是将重组DNA重新引入一个宿主细胞，使其进行繁殖。
这些步骤组成了一个典型的基因克隆工作流程。
在基因克隆中，一些关键工具也是必不可少的。
例如，限制酶和DNA连接酶是进行酶切和连接的酶类；载体是将目标DNA载入的载体分子。
当然，在实验设计过程中，也需要考虑到多种子序列的选择，以获得最优的结果。
二、基因表达技术基因表达技术是指将克隆好的基因转录和翻译为蛋白质的过程。
基因表达技术所涉及的核心部分主要为转染和转录。
转染是指将载体转化到目标细胞中的过程。
转染可以分为多次批量的直接转染和、转染载体的两种方式。
对于细胞质和细胞核分离的情况，病毒载体或质粒载体也可以被用来介导转录。
质粒载体在转录的时候需要被移入到细胞的核中，由此促进了 DNA 受体和 RNA聚合酶之间的相互作用。
另一种重要的基因表达技术是转录，也称作转录调节。
转录调节可以分为两类：正调节和负调节。
正调节是指通过上调特定基因的表达、促进特定转录的过程；负调节是指通过下调特定基因的表达、抑制特定转录的过程。
转录调节受到多种因素的影响，例如转录因子和超融合酶等分子的运作。
基因克隆与表达及功能鉴定研究
基因克隆与表达及功能鉴定研究在现代生命科学领域中，基因克隆与表达以及功能鉴定是非常重要的研究方向之一，它涉及到许多生物医学、农业、工业和环境等领域的研究和实际应用。
本文将从基因克隆与表达的基本原理、方法、技术和应用，以及功能鉴定的原理、方法、技术和应用等方面进行探讨。
一、基因克隆与表达基因克隆是指通过分子生物学技术，将含有某个或某些特定基因的DNA序列从一个大的DNA分子（如染色体）中分离出来，然后插入到特定的载体DNA中，形成重组DNA分子的过程。
基因表达是指基因信息的转录和翻译过程，将基因的DNA序列转录成RNA分子，然后翻译成蛋白质分子的过程。
基因表达是生物体形成和发展的基础，也是生命活动的重要表现形式。
1. 基因克隆原理基因克隆的主要原理是利用限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶以及质粒或噬菌体等DNA载体的特性，将特定DNA序列插入到载体DNA中，形成重组DNA分子。
限制酶是一种能够识别、切割DNA分子特定序列的酶，其识别序列具有一定的特异性。
DNA连接酶是一种能够连接两个DNA分子的酶，常用的有T4 DNA连接酶和快速连接酶等。
DNA聚合酶是一种能够在DNA模板上合成互补链的酶，其作用是在重组DNA分子中完成互补链的合成。
2. 基因克隆方法基因克隆的主要方法有限制性片段长度多态性（RFLP）分析、聚合酶链式反应（PCR）克隆、原核表达克隆和真核表达克隆等。
RFLP分析是一种利用限制酶对DNA序列进行切割，并根据不同的RFLP位点进行区分的方法，其主要应用于基因型鉴定和进化研究等领域。
PCR克隆是一种利用PCR技术扩增目标基因或DNA片段，并将扩增产物克隆到载体DNA中的方法，其主要应用于基因检测、DNA测序和分子克隆等领域。
原核表达克隆是一种利用质粒或噬菌体等原核生物作为DNA载体，将外源基因转入细菌或古细菌等原核生物细胞中，通过蛋白质表达实现基因功能研究的方法。
真核表达克隆是一种利用真核生物（如哺乳动物、鸟类、昆虫、线虫等）作为DNA载体，将外源基因转入具有表达能力的真核细胞中，通过蛋白质表达实现基因功能研究的方法。
基因的克隆与表达课件
----TAC -----TTG GAC CTT AAG GAT CCA---
DNA序列
AAT CGG AAG AAT TCA GAC CTA GGT TTA GCC TTC TTA AGT CTG GCT CCA
基因的克隆与表达课件
位相载体----含有3种读码框的系列载体
基因的克隆与表达课件
优点： • 表达效率高 • 产物稳定 • 易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可
➢基因克隆(gene cloning) ➢基因表达(gene expression)
-原核基因表达 -真核基因表达
基因的克隆与表达课件
基因克 隆 Gene Cloning
基因的克隆与表达课件
➢概述 ➢克隆载体 ➢受体细胞 ➢体外重组的策略 ➢基因克隆工作流程
基因的克隆与表达课件
一、概述
• 确定了遗传信息的携带者，即基因的盆 子载体是DNA而不是蛋白质
基因的克隆与表达课件
（二）体外重组 连接体系的建立： • 温度：粘末端连接：12-18℃
平末端连接：室温（低于30℃) • DNA量：载体分子数/目的基因分子数
=1：1-3 • 酶量：平端连接时需加大酶量
基因的克隆与表达课件
（三）转化—Cacl2法、电击法
（四）重组子的筛选及鉴定
1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑）
基因的克隆与表达课件
二．原核生物基因结构和表达特点
基因的克隆与表达课件
• 原核生物染色体DNA是裸露的环形 DNA，其转录和翻译是偶联的连续 进行。
• 原核生物形成多顺反子mRNA： mRNA在合成过程中和多个核糖体 结合，翻译形成多条肽链。
基因的克隆与表达课件
3、一般不含内含子（intron），没有转 录及翻译后加工系统
基因工程中的基因克隆与基因表达实验总结
基因工程中的基因克隆与基因表达实验总结基因工程作为一门新兴的交叉学科，已经广泛应用于生物医学、农业、环境保护等领域。
其中，基因克隆和基因表达实验是基因工程的核心技术，对于研究基因功能和开发新药已经起到了重要作用。
本文将对基因工程中的基因克隆和基因表达实验进行总结，并探讨其在科学研究和应用中的前景。
一、基因克隆实验基因克隆是通过重组DNA技术，将感兴趣的基因从一个生物体中复制并插入到另一个生物体中的过程。
它是研究基因功能、生物制药和转基因等领域的基础。
基因克隆实验主要包括以下几个步骤：1. DNA提取与限制性内切酶切割：通过提取DNA样品，使用限制性内切酶切割将目标基因和载体DNA切割成相应片段。
2. 基因插入：将目标基因与载体DNA片段进行连接，常用的方法是使用DNA连接酶将两者黏合。
3. 转化与筛选：将连接后的DNA转入到宿主细胞中，使其成为转基因细胞。
通过选择性培养基进行筛选，可以获得拥有目标基因的转基因细胞。
通过基因克隆实验，我们可以获得不同生物体的目标基因，并进行后续的研究和应用。
例如，通过将某种植物的耐旱基因克隆到其他作物中，可以提高作物的抗旱能力，增加农作物产量。
二、基因表达实验基因表达实验是将目标基因在宿主细胞中进行转录和翻译，产生具有特定功能的蛋白质的过程。
基因表达实验是研究基因功能和制备重组蛋白等领域的重要手段。
基因表达实验主要包括以下几个步骤：1. 选择合适的表达系统：根据需要表达的蛋白质的性质和规模，选择合适的表达系统。
常用的表达系统包括细菌、酵母、哺乳动物细胞等。
2. 构建表达载体：将目标基因插入到表达载体中，通常使用限制性内切酶和DNA连接酶进行连接，并通过测序确保插入正确。
3. 细胞转染：将构建好的表达载体导入到宿主细胞中。
不同表达系统有不同的转染方法，如细菌的化学转型、酵母的电转染等。
4. 表达和纯化：经过一定时间的培养，宿主细胞会表达目标基因，合成目标蛋白质。
可以通过蛋白质纯化技术，如亲和层析、凝胶电泳等手段获得纯度较高的目标蛋白质。
基因克隆与表达
基因克隆与表达基因克隆与表达是生物学领域中重要的技术手段和研究方法。
通过基因克隆和表达，科学家能够研究特定基因的功能、调控机制以及其在生物体内的作用，这对于深入了解生物体的生理过程和疾病发生机制具有重要意义。
本文将介绍基因克隆与表达的原理、方法以及应用。
一、基因克隆基因克隆是将特定基因从一个生物体中分离并复制到另一个载体中的过程。
这个过程主要涉及DNA的分离、复制和连接。
常用的基因克隆技术包括PCR、限制性内切酶切割、琼脂糖凝胶电泳和基因插入等。
1. PCR聚合酶链反应（PCR）是一种强大的基因扩增技术。
它通过不断地重复某一特定区域的DNA序列，使其得以大规模复制。
PCR可以在短时间内合成大量目标DNA片段，为基因克隆提供了充足的材料。
2. 限制性内切酶切割限制性内切酶可以识别并切割特定的DNA序列。
通过选择合适的限制性内切酶，可以实现将目标基因从源DNA中切割下来，为下一步的基因克隆做好准备。
3. 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一种常用的DNA分离技术。
通过将DNA样品加入琼脂糖凝胶槽中，并施加电场，DNA片段会根据其大小在凝胶中迁移。
凝胶电泳可以帮助科学家分离和纯化目标基因。
4. 基因插入基因插入是将目标基因连接到载体上的过程。
载体可以是质粒、病毒或者人工染色体等。
通过连接酶的作用，目标基因与载体可以稳定地结合在一起。
二、基因表达基因表达指特定基因通过转录和翻译过程转化为蛋白质的过程。
从基因克隆到基因表达，可以分为以下几个步骤：转染或转化、筛选和检测。
1. 转染或转化转染是指将外源DNA导入到动物细胞中的过程，而转化是将外源DNA导入到细菌细胞中的过程。
转染和转化可以通过多种方法实现，如化学法、电穿孔法和基因枪法等。
2. 筛选筛选是为了确定是否成功将目标基因表达在宿主细胞中而进行的步骤。
常见的筛选方法包括荧光筛选和克隆筛选。
荧光筛选利用荧光蛋白标记目标基因，观察细胞是否出现荧光信号。
克隆筛选则利用选择性培养基，筛选出含有目标基因的克隆。
《基因克隆与表达》课件
2 留下问题和展望
引发学生对基因克隆与表达的思考和问题，并展望该领域的未来发展。
什么是基因克隆与表达
解读基因克隆与表达的定义， 了解其在基因研究中的作用。
基因克隆和表达的重要 性
探讨基因克隆与表达在科学 研究和应用中的重要价值。
课程大纲介绍本课程的内容和学习 Nhomakorabea 标，为后续的学习做好准备。
基因克隆
基因克隆是获取目标基因及其背后的DNA片段的过程。PCR、限制性酶切和连接反应是基因克隆中常用的关键 技术。
2 重组蛋白表达
探讨重组蛋白表达的步骤以及在基因工程和生物医药领域中的可行表达体系选择。
3 基因治疗
介绍基因治疗的原理和在疾病治疗中的应用前景。
结论
在基因研究和应用中，基因克隆和表达起着至关重要的作用。通过了解相关技术和应用，我们可 以更好地理解基因的功能和探索其在生物科学中的潜力。
1 基因克隆和表达的重要性再强调
PC R
探讨聚合酶链式反应（PCR）在 基因克隆中的原理、步骤和应 用。
限制性酶切
介绍限制性酶切的原理及其在 基因克隆中的应用。
连接反应
讨论连接反应在基因克隆中的 原理、步骤和应用。
基因表达
基因表达是指利用转化和重组蛋白表达系统来实现基因功能研究和基因治疗的过程。
1 转化
深入解析转化的原理、步骤和转化后的检测方法。
《基因克隆与表达》PPT 课件
这是一份专业的《基因克隆与表达》PPT课件，将带你深入了解基因克隆和表 达的重要性以及相关技术。通过本课件，你将掌握基因克隆和表达的关键步 骤和应用。
简介
基因克隆与表达是研究基因结构和功能的重要方法。本课程将介绍基因克隆与表达的基本概念、原理和技术， 并探讨其在生物科学研究和应用中的重要性。
现代分子生物学技术
CATALOGUE
目录
基因克隆与表达 基因组学与蛋白质组学 基因编辑技术 生物信息学 分子生物学技术的应用
01基因克隆与表达基因构建通过构建基因，将特定基因的DNA片段插入到载体中，以便于基因的筛选和克隆。
限制性酶切和连接
利用限制性内切酶对DNA进行切割，再通过DNA连接酶将目的基因与载体进行连接，实现基因的克隆。
基因编辑技术的应用
04
生物信息学
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01
02
03
克隆基因的表达载体
02
基因组学与蛋白质组学
基因组学研究方法
基因组学研究主要采用全基因组测序、基因表达分析、基因突变检测等技术手段。
基因组学应用
基因组学在医学、农业、生物技术等领域有广泛应用，如疾病诊断、药物研发、农作物改良等。
基因组学定义
基因组学是研究生物体基因组的学科，包括基因的识别、测序、分析和功能研究。
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生物信息学
生物信息学
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生物信息学
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基因克隆与表达
精选2021版课件
卫文强 2015.112
目的基因-T
表达载体
酶切， 胶回收，连接
转化到克隆用细胞（Top10)
提质粒，酶切验证
转化到表达用细胞（BL21（DE3)）
诱导表达
SDS-PAG精E选2021版课件
2
影响限制性内切酶活性的因素
1）. DNA的纯度
DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、 SDS、EDTA等都会影响酶的活性。
• 酶用量不能超过酶切总体积的10%；
• 多种酶进行酶切时，先低盐后高盐缓冲 液；
精选2021版课件
5
1、连接
连接、转化与重组子鉴定
精选2021版课件
6
（2）. 连接条件
（1）必须是两条双链DNA。
（2）DNA 3’ 端有游离的-OH， 5’端有一个磷酸基团（P）。
（3）需要能量 动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+
精选2021版课件
7
2）连接温度：
连接效果最好在37 ℃，但形成的互补 不稳定; 最佳连接温度：12-16 ℃，较好的连 接效果，互补又较稳定;
3）反应液中的成分：
ATP：反复冻熔，ATP活性降低，ATP溶解度 不高，连接缓冲液宜分装；
单价离子：150-200mM NaCl，提高连接效果； PEG：5%以下可以提高连接效率
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15
抽提出的质粒三种构型 电泳结果：
1）开 环 2）线 状 3）超螺旋
-
电 泳 方 向
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+
16
凝胶电泳技术
电泳目的：对核酸分子进行分离和检测
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转基因技术的原理
转基因技术的原理转基因技术是一种通过改变生物体的遗传信息来获得特定性状的技术，它是现代生物技术的重要组成部分。
转基因技术的原理主要包括基因克隆、基因导入和基因表达三个基本步骤。
首先，基因克隆是指从一个生物体中获得目标基因，并将其进行复制。
这一步骤通常是通过PCR技术或者其他基因克隆技术来实现的。
通过这一步骤，科学家们可以获得他们感兴趣的基因，并将其进行后续的操作。
其次，基因导入是指将获得的目标基因导入到另一个生物体中。
这一步骤通常是通过载体DNA或者病毒载体来实现的。
科学家们将目标基因与载体DNA结合，然后将其导入到目标生物体的细胞中。
在细胞内，目标基因会被插入到生物体的染色体中，并成为其遗传信息的一部分。
最后，基因表达是指在目标生物体中使导入的基因表达出目标蛋白质。
这一步骤通常是通过转录和翻译过程来实现的。
一旦目标基因被导入到生物体的染色体中，它就会参与到生物体的基因表达过程中，从而使目标蛋白质得以表达出来。
通过以上三个基本步骤，转基因技术可以实现对生物体特定性状的改变。
例如，科学家们可以通过转基因技术来增加作物的抗病性、抗虫性和耐逆境能力，从而提高作物的产量和质量。
此外，转基因技术还可以用于生产药物、改良家畜和提高微生物的发酵能力等方面。
总的来说，转基因技术的原理是通过基因克隆、基因导入和基因表达三个基本步骤来实现对生物体特定性状的改变。
这一技术已经在农业、医药和工业等领域发挥着重要作用，为人类社会的发展做出了重要贡献。
随着科学技术的不断进步，相信转基因技术将会在未来发挥更加重要的作用，为人类社会的可持续发展提供更多的可能性。
基因克隆与表达的研究方法
基因克隆与表达的研究方法基因克隆和表达是生命科学中重要的研究方法，它们在基因工程、药物研发、癌症治疗等领域发挥着重要作用。
在克隆和表达一个基因之前，需要先建立一个可重复的实验方法，以确保实验结果的准确性和可靠性。
本文将介绍基因克隆和表达的一些通用方法和技术。
1. PCR扩增PCR扩增是一种常用的克隆方法，它可以在短时间内高效地扩增DNA序列。
这种方法需要一对引物，在PCR反应中引物定向扩增目标序列。
PCR反应需要一个DNA模板、引物和聚合酶，在合适的反应条件和温度下进行。
PCR扩增后的产物可以纯化、酶切、克隆到表达载体上。
2. 限制性内切酶消化限制性内切酶消化是一种分子生物学技术，可以将DNA分子切成不同的长度，并生成暴露的粘性末端。
这样的末端可以与其他的DNA分子的互补末端连接起来，从而实现DNA的克隆。
在DNA克隆中，选择合适的限制性内切酶可以实现目标DNA序列的克隆。
3. 匀浆凝胶电泳匀浆凝胶电泳是一种检测DNA大小的技术，它可以用于确认PCR扩增产物的大小，鉴定DNA克隆的有效性以及纯化DNA等。
在匀浆凝胶电泳中，DNA样品被负载到凝胶上，并在电场作用下迁移。
根据DNA分子大小的不同，可以通过在凝胶上形成特定的DNA带和条带，从而检测DNA分子的大小。
4. 蛋白表达的研究方法蛋白表达是生命科学研究中重要的实验方法，可以获得对生命过程和重要分子的深入了解。
在蛋白表达中，需要克隆一个给定的基因到一个特定的表达载体上。
表达载体中包含能够转录和翻译蛋白质所需的所有元件。
在表达系统中，可以使用细胞培养、原核生物、真核生物等不同的宿主来表达蛋白。
5. 功能分析的研究方法在获得基因克隆和表达蛋白之后，需要通过功能分析进一步了解目标基因和蛋白的生物学功能。
在功能分析中，常用的方法包括基因敲除、蛋白互作、基因组学、蛋白质修饰等。
通过这些方法，可以深入研究生物学体系的信号传导、调节机制、发育和疾病机制等问题。
分子生物学：基因克隆及克隆基因的表达
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG
Bg lⅡ AGATCT TCTAGA
互连后？
GCCTAG+
GATCC G
ATCTAG+GATCTA
Ⅱ型限制性内切酶具有一些共性和特性：
5. 不同的酶可以识别同一个序列 同工异源酶（isoschizomer）或同裂酶 能识别同一序列（切割位点可同或不同）但来源不同的两种酶。
6. 水浴槽
8. 电泳系统
分子克隆常用的有毒试剂
1. 溴化乙锭: （Ethidium bromide，EB）用来染DNA和RNA的染料, 是一种致癌物 质；它是DNA突变的诱变剂，可以嵌入DNA，使DNA发生突变，致癌。 有累积 效应，不要直接接触，但是要注意通过呼吸摄入，故此环境要通风。EB可以被 皮肤吸收。做实验的时候一定要带手套。但是，只要按照标准的操作使不会有问 题的。严禁随便丢弃。因为EB是强致癌性，而且易挥发，挥发至空气中，危害 很大。
2. DEPC：DEPC即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可灭活各种蛋白质， 是RNA酶的强抑制剂；DEPC是一种潜在的致癌物质，在操作中应尽量在通风的 条件下进行，并避免接触皮肤。DEPC毒性并不是很强，但吸入的毒性是最强的， 使用时戴口罩。不小心占到手上注意立即冲洗。
3.苯酚：苯酚又名酚或石碳酸,为高毒类原浆毒物,对人体危害严重。它的浓溶液 对皮肤有强烈的腐蚀性,苯酚所致的急性中毒常常造成死亡。 4. 氯仿：三氯甲烷，侵入途径：吸入、食入、经皮吸收。健康危害：主要作用 于中枢神经系统，具有麻醉作用，对心、肝、肾有损害。吸入或经皮肤吸收引起 急性中毒，初期有头痛、头晕、恶心、呕吐、兴奋、皮肤粘膜有刺激症状，以后 呈现精神紊乱、呼吸表浅、反向消失、昏迷等，重者发生呼吸麻痹、心室纤维性 颤动、并可有肝、肾损害。误服中毒时，胃有烧灼感、伴恶心、呕吐、腹痛、腹 泻以后出现麻醉症状。慢性中毒：主要引起肝脏损害，此外还有消化不良、乏力、 头痛、失眠等症状，少数有肾损害。 5. 十二烷基硫酸钠（SDS）：提取质粒使用的溶液II中含有SDS，对粘膜和上呼 吸道有刺激作用，对眼和皮肤有刺激作用。可引起呼吸系统过敏性反应。。 6. 其它常用的试剂如强酸强碱都有很强的腐蚀性。
基因克隆与表达
基因表达的检测方法
Northern blot：检测mRNA的方法，可用于检测基因的表达水平。
RT-PCR：通过逆转录和PCR技术，检测特定基因的表达水平。
Western blot：检测蛋白质的方法，可用于检测基因的表达产物。 免疫荧光技术：通过抗体与目标蛋白质的结合，利用荧光标记技术进行 检测。
基因克隆与表达的研究流程
同的后代。
克隆技术可以用 于繁殖动物、植 物和微生物，以 及用于生产转基 因生物和基因治
疗。
克隆技术的主要 步骤包括获取供 体细胞的DNA、 将DNA植入受 体细胞、培养产 生的胚胎并使其 发育成新个体。
克隆技术的优点 包括可以快速繁 殖具有优良性状 的动物和植物， 以及可以用于基 因治疗和药物生
产等领域。
生物安全：基因 克隆与表达技术 可用于检测和预 防生物威胁，如 生物武器和病原 体的传播，保障 公共安全。
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克隆技术的应用：克隆技术在医学、农业、生物技术等领域具有广泛的应用价值，例如 用于生产转基因动物、研究动物模型、繁殖濒危物种等。
克隆技术的分类
胚胎干细胞克隆技术 核移植克隆技术 转基因克隆技术 基因克隆技术
克隆技术的应用
添加项标题
克隆动物：通过基因克隆技术可以繁殖出具有相同基因的动物， 用于医学研究、药物筛选和动物模型建立等。
03 基因表达的调控
基因表达的概述
基因表达的定义：基因表达是指基因经过转录和翻译，将遗传信息传递给蛋白质的过程。
基因表达的调控方式：包括转录水平的调控、转录后的调控和翻译水平的调控。
基因表达的调控机制：包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA等。
基因表达的生物学意义：基因表达调控对于生物体的生长发育、代谢和环境适应性等方 面具有重要意义。目的基因的获取：通过基因、PCR、基因合成等方法获取目的基因
基因克隆及克隆基因的表达
LOGO
三、目的DNA与载体连接（接）
T4DNA ligase
LOGO
四、重组DNA转入宿主细胞进行扩增（转）
宿主细胞
感受态细胞（competent cell）：
处于易于接纳外源物质的状态的细菌
LOGO
几个相关概念：
Lac I
Prokaryotic Expression Plasmid
LOGO
一、原核宿主细胞 大肠杆菌（E.coli)
优点：简便, 快速、成本低 可高密度发酵培养 20-30min
注意：
12 hours Once 用来克隆基因和表达基因的菌株不一样， the recombinant system is established, it is cheap to manufacture.
T-载体：
T7
pMD18-T 2692bp
HindIII Spln PstI HincII AccI SalI
T
T
Xbal BamHI SmaI XmaI KpnI SacI EcoRI
LOGO Sp6
克隆载体用于外源DNA的克隆和无性繁殖
（二）常用克隆载体的种类
速高效表达基因产物。
真核表达系统： 外源基因引入真核细胞，使外源
基因在真核细胞中表达。
LOGO
第一部分.外源基因在原核细胞中的表达
原核细胞表达 系统组成
一、原核宿主细胞 二、原核表达载体
Recombinant Protein
wΒιβλιοθήκη
转化（transformation） 质粒或黏粒→细菌 质粒→酵母（真核细胞） 转染（transfection） 外源DNA→真核细胞（酵母除外） 感染（infection） 噬菌体颗粒→细菌 病毒颗粒→哺乳细胞
基因工程中的基因克隆与表达
基因工程中的基因克隆与表达基因工程是一门涉及分子生物学、遗传学、生物化学等多个学科的综合性科学。
其中，基因克隆和基因表达是基因工程研究的两个重要方面。
本文将就基因克隆和基因表达的原理、方法及应用进行探讨。
一、基因克隆1.原理基因克隆是指将目标基因从其天然基因组或其他来源中分离出来，并将其插入到另一个载体（如质粒）中，使其能够在宿主细胞内复制和表达。
基因克隆的原理是基于DNA序列特异性杂交的方法，利用限制性内切酶切割目标DNA和载体DNA，然后将它们黏合在一起，形成重组DNA。
通过转形或感染，使重组DNA 进入宿主细胞内，并复制和表达。
2.方法基因克隆的方法主要有限制性酶切与黏合（RE-Mediated Ligation）、PCR（聚合酶链反应）、TA克隆和基因文库等。
限制性酶切与黏合是一种常用的基因克隆方法。
该方法利用限制性内切酶切割DNA，然后通过T4 DNA连接酶黏合在一起。
这种方法操作简单、效率高，但存在限制内切酶的局限性，无法应用于不同酶切位点的DNA。
PCR是用于复制DNA片段的重要方法，也可以用于基因克隆。
PCR方法可以在不使用限制酶的情况下，从任何源提取DNA片段，扩增需要的基因段，并使用酶切和连接技术插入到载体中。
TA克隆是指用于从PCR产物中克隆DNA的一种方法。
该方法利用了Taq聚合酶不完全特异性合成3'-末端斜伸的性质，使产生的末端序列与T自带的A进行互补配对，从而使PCR产物能够被直接连接到TA克隆载体上。
基因文库是一种重要的基因克隆技术，可以将许多目标基因同时克隆入同一载体中。
基因文库分为cDNA文库和基因组文库。
通过荧光筛选或选择性培养，可以从文库中筛选出感兴趣的基因。
3.应用基因克隆技术广泛应用于基因工程、疫苗制备、药物研发、作物改良、动物遗传改良、环境污染治理等领域。
例如，利用基因克隆技术可以创造出超级细菌、工业用酶、新型药物、高产优质作物等。
二、基因表达1.原理基因表达是指基因通过转录和翻译的过程，将DNA序列转化为蛋白质的过程。
基因克隆和表达在蛋白质功能研究中的应用
基因克隆和表达在蛋白质功能研究中的应用蛋白质是生命体内最为丰富和基本的生物大分子，其在生命体内承担着诸多重要的生命过程，如代谢、信号传递、免疫反应、细胞分裂等。
因此，对蛋白质的结构与功能进行研究具有非常重要的科学意义和实用价值。
在这方面，基因克隆和表达技术作为分子生物学研究的重要手段之一，已经被广泛应用于蛋白质结构与功能研究中。
一、基因克隆的原理和方法基因克隆是指将外源DNA序列插入到宿主DNA分子中并将其复制的过程。
它是构建重组DNA分子、获得纯化蛋白质和基因功能研究等生物学实验中必不可少的技术手段。
基因克隆技术的主要步骤包括：1、DNA提取：从目标细胞中提取出DNA2、PCR扩增：利用聚合酶链式反应技术，对目标基因进行扩增3、限制性内切酶切割：用限制性内切酶对扩增出的基因进行切割4、连接外源基因：将切割好的外源基因与质粒连接，构建出重组质粒5、质粒转化：将重组质粒导入宿主细胞中，使其在宿主细胞中稳定复制二、蛋白质表达的原理和方法蛋白质表达是指通过构建重组DNA分子的方式，使得目标蛋白质能够在宿主细胞中稳定表达的技术。
蛋白质表达技术的主要步骤包括：1、重组DNA构建：将目标基因与表达载体连接，构建成重组DNA分子2、宿主细胞转化：将重组DNA分子导入宿主细胞中，使其在宿主细胞中稳定复制3、蛋白质表达：宿主细胞利用其自身的蛋白质表达系统将目标蛋白质进行合成并进行折叠4、蛋白质纯化：利用各种不同的蛋白质纯化技术，将目标蛋白质进行纯化三、基因克隆和表达在蛋白质结构和功能研究中的应用1、蛋白质结构研究基因克隆和表达技术被广泛应用于研究目标蛋白质的结构。
例如，通过在目标蛋白质序列中引入特定的蛋白质标签，可以方便地提取出目标蛋白质，从而通过结晶学研究其晶体结构。
此外，基因克隆和表达技术也被广泛应用于核磁共振光谱、电镜等研究中，以研究蛋白质的结构。
2、蛋白质功能研究基因克隆和表达技术也被广泛应用于研究目标蛋白质的功能。
基因克隆和表达的实验设计
基因克隆和表达的实验设计实验目的研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。
实验方法；通过分别将0M-5a（pEGFP-N3）和0M-5a（pET-28a）提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入0M-5a感受态细胞中进行转化，通过限制性核酸内切酶Not l与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后，通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体Bl-2/内进行表达，再用IPTG诱导GFP 基因表达，如果可以看到显现绿色，判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。
材料与方法：实验材料克隆菌0W-5a、表达菌6l-21为本实验室收藏菌种，质粒pET-28a 和pEGFP-N3，引物，限制性内切酶Bam H1、Not I仪器设备Eppendof 离心机、电泳仪、电子天平、台式离心机、控温磁力搅拌器、调温电热套pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器、紫外灯、生物洁净工作台、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、平板封口膜、离心管。
实验原理生物的大部分或几乎全部DNA都集中在细胞核或类核中。
DNA在体内通常都与蛋白质结合，蛋白质对DWA制品的污染常影响到以后的DWA操作过程，因此需把蛋白质除去，一般采用酚氯仿抽提法。
苯酚、氟仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响。
经苯酚、氟仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相，少量的或与DNA紧密结合的蛋白质可用蛋白酶予以去除。
DNA制品中少量的RNA无影响，必要时可加入不含DNase的RNase 去除RNA污染。
实验步骤1、100ml细菌过夜培养液，5000rpm离心10分钟，去上清液。
2、加TE悬浮沉淀，并加10%S0S，50ul20mg/ml（或1mg干粉）蛋白酶K，混匀，37℃保温1小时。
基因克隆和表达技术在生物医药中的应用
基因克隆和表达技术在生物医药中的应用随着基因技术的迅猛发展，基因克隆和表达技术已经成为生物医药研究领域中最受关注的应用之一。
基因克隆和表达技术是指通过人工手段构建和操纵生物分子的DNA、RNA序列，实现对特定蛋白质或生化物质大量生产的技术。
基因克隆技术可以帮助研究人员得到需要的DNA序列，这些序列可以用于表达特定的蛋白质或功能分子，如药物、激素、抗体等。
同时，表达技术可以使得研究人员大量生产这些分子，从而满足临床治疗和科研需求。
基因克隆和表达技术在生物医药中的应用非常广泛。
下面将从三个方面介绍其应用。
一、基因克隆和表达技术在药物研究中的应用基因克隆和表达技术可以用于生产大量高质量的药物，从而提高药物疗效。
例如，利用基因克隆和表达技术可以生产重组人胰岛素，以治疗糖尿病。
此外，基因克隆和表达技术还可以生产一些专门用于癌症治疗的药物，如靶向药物、细胞因子和基因治疗药物等。
这些药物可以针对患者的特定症状进行优化，提高疗效。
二、保健品与生物制品领域中的应用生物制品和保健品是一些重要的医药品类别，包括抗体、基因序列、细胞和疫苗等。
基因克隆和表达技术在这些药物中也发挥了重要作用。
例如，表达特定的基因序列可以生产抗体，提高机体的自身免疫力，进而预防或医治疾病。
而在生物制品领域，基因克隆和表达技术则可以生产更加纯净的生物制品，从而提高生产效率和质量。
三、医学诊断领域中的应用基因克隆和表达技术还可以用于诊断某些疾病，如癌症、遗传病等。
例如，利用基因克隆和表达技术可以检查特定基因的突变情况，从而诊断遗传病。
同时，在癌症治疗中，基因克隆和表达技术可以检查癌症细胞的特定基因，以确定其对于特定药物的敏感性，从而更好地为患者提供精准治疗方案。
总之，基因克隆和表达技术在生物医药领域中具有重要的应用，为疾病的治疗和诊断提供了有力的支持。
未来，随着技术的不断发展和研究的深入，相信基因克隆和表达技术将为生物医药领域带来更多的突破和创新，为人类的健康福祉作出新的贡献。
基因克隆技术及其在蛋白表达中的应用
基因克隆技术及其在蛋白表达中的应用基因克隆技术是一种将外源DNA片段转化到DNA质粒中的技术，其产物为克隆DNA分子。
这种技术可以应用于如生物医学、农业等领域中的研究和应用。
其中，蛋白表达是基因克隆技术的一个重要应用方向。
1. 基因克隆技术的原理和方法基因克隆技术的原理大致分为三个步骤：DNA分子的制备、限制性内切酶切割、DNA片段连接到载体DNA上。
DNA分子的制备涉及DNA提取、PCR扩增、酶切等技术，目的是获得含有目标DNA片段的DNA。
限制性内切酶切割是将DNA分子切割成特定的片段，目的是获得目标DNA片段。
DNA片段连接到载体DNA上是通过连接酶将DNA片段与载体DNA连接成DNA重组物质。
同样的，基因克隆技术的方法分为三种：限制性内切酶法、PCR扩增法和基因文库法。
2. 蛋白表达及其意义蛋白表达是指基因的DNA序列转化为相应的蛋白质。
蛋白质在生命体内十分重要，它们构成了生物体的各种器官和组织的结构，并且承担着许多生物学过程的重要作用，如酶的催化作用、免疫系统的维持、基因的调控等。
因此，蛋白表达在生物医学、农业等许多领域中具有无限的应用前景，包括生物药物生产、食品安全、草地生态建设等。
3. 基因克隆技术在蛋白表达中的应用基因克隆技术在蛋白表达中的应用主要分为两种：原核表达和真核表达。
原核表达是将外源DNA片段转化到大肠杆菌等细菌中，使其在细菌内部表达并获得蛋白质。
这种方法无需使用复杂的细胞系统，适用于简单的蛋白质表达。
真核表达是将外源DNA片段转化到哺乳动物或其他真核生物的细胞中，使其在细胞中表达并获得蛋白质。
这种方法对于复杂的蛋白质表达和修饰更为有效。
4. 基因克隆技术在生产生物药中的应用基因克隆技术在生产生物药方面的应用十分广泛。
这种方法的基本思想是：将人类基因移植到可表达该基因的外源宿主细胞中，并使该宿主细胞制造有效的蛋白质。
基因克隆技术可以生产生物药，如干扰素、人免疫球蛋白、重组胰岛素等，这些生物药可以更准确地控制疾病的进程，减轻患者的痛苦，并提高治愈率。
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基因克隆与表达
5、原核生物中参与转录的基因结 构：
• 启动子 • 终止子
基因克隆与表达
启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合
酶识别、结合并启动基因转录的一段 DNA序列。 • 一般长40-60bp，富含A-T碱基对 • 具有保守序列： -10区（pribnow box）：TATAAT -35区：
基因的克隆与表达
基因克隆与表达
➢基因克隆(gene cloning) ➢基因表达(gene expression)
-原核基因表达 -真核基因表达
基因克隆与表达
基因克 隆 Gene Cloning
基因克隆与表达
➢概述 ➢克隆载体 ➢受体细胞 ➢体外重组的策略 ➢基因克隆工作流程
基因克隆与表达
一、概述
一个相同酶切位点，可将另一末端补平
基因克隆与表达
2、平末端连接： • 酶切点为平末端或任何两个末端补平
的DNA • 效率低，酶用量大
基因克隆与表达
3、人工接头连接 人工接头：人工合成含有酶切位点的寡
核苷酸片段
基因克隆与表达
4、T-A克隆 • T-vector两条链的5’端含有一个游
离的T • PCR过程中，普通的Taq酶可在产
（二）体外重组 连接体系的建立： • 温度：粘末端连接：12-18℃
平末端连接：室温（低于30℃) • DNA量：载体分子数/目的基因分子数
=1：1-3 • 酶量：平端连接时需加大酶量
基因克隆与表达
（三）转化—Cacl2法、电击法
（四）重组子的筛选及鉴定
1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑）
原位杂交
3、一般不含内含子（intron），没有转 录及翻译后加工系统
4、原核生物中功能相关的基因串联在 一起，形成操纵子。
基因克隆与表达
操纵子（operon）：是一组功能上相 关，受同一调控区控制的基因组成的 一个遗传单位
基因克隆与表达
• 原核生物基因表达的基本单位（即一 个转录单位）。
• 共同协调作用，完成某一多肽的表达 调控。
无特异的内源性核酸内切酶 载体复制、扩增不受阻 与载体有互补性
基因克隆与表达
四、体外重组的策略
1、粘末端连接 1）全同源粘末端连接 • 最方便简单 • 高背景-载体自身环化 • 双向插入
基因克隆与表达
2）定向克隆：使外源基因定向插入到载体 中的克隆策略
• 粘-粘连接：最有效、最快捷 • 粘-平连接：适用于外源基因仅与载体有
基因克隆与表达
基因克隆的技术路线
目的基因
载体
体外重组
重组子（杂合DNA）
转化
受体细胞
筛选阳性克隆
大量扩增，获得子代DNA
基因克隆与表达
基因克隆与表达
二、克隆载体 ➢复制基因(replicator) ➢选择性记号 ➢克隆位点
基因克隆与表达
三、受体细胞
1、定义：外源DNA导入的细胞，是 重组体扩增的场所。 2、要求：易于接纳外源DNA
• 确定了遗传信息的携带者，即基因的盆 子载体是DNA而不是蛋白质
• 揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机理
• 提出了中心法则和操纵子学说，破译了 遗传密码
基因克隆与表达
1973年Cohen完成第一个基因工程实验 经体外重组获得杂合DNA 杂合子转化入大肠杆菌
➢所需元件： 限制性内切酶 连接酶 载体 受体细胞
基因克隆与表达
4、PCR扩增目的基因片段 • 适用于克隆序列清楚的基因 • 以基因组DNA为模板，直接进行PCR
扩增较难 • 多采用以mRNA为模板的RT-PCR法
基因克隆与表达
5、人工合成较短的DNA 6、差异显示法(differential display,
DD)—筛选差异表达的基因
基因克隆与表达
2．真核表达系统：使外源基因在真核细 胞中表达的体系。
基因克隆与表达
二．原核生物基因结构和表达特点
基因克隆与表达
1. 原核生物染色体DNA是裸露的环形 DNA，其转录和翻译是偶联的连续 进行。
2. 原核生物形成多顺反子mRNA： mRNA在合成过程中和多个核糖体 结合，翻译形成多条肽链。
基因克隆与表达
library)以组织细胞中的mRNA为模 板，反转录合成双链cDNA ，各 cDNA分子分别插入载体形成重组子， 再导入宿主细胞克隆扩增。这的3’端多加一个A
基因克隆与表达
五、基因克隆的工作流程
（一）目的基因的获得
1、直接分离3、构建cDNA4、PBiblioteka BaiduR
5、人工合成
6、差异显示
基因克隆与表达
1、直接物的基因组DNA切割成一定大 小的片段，并与合适的载体重组后 导入宿主细胞，进行克隆。这些存 在于所有重组、鉴定：
• 长度鉴定：酶切、PCR
• 方向鉴定：联合酶切
• 测序
基因克隆与表达
基因的表达
Gene Expression
基因克隆与表达
一．表达系统： 基因工程中用来获得有功能的异源蛋白 质的体系，包括克隆载体，表达载体及 受体细胞。
基因克隆与表达
基因克隆与表达
据受体细胞的不同可分为：
1．原核表达系统： 将外源基因引入原核细胞，并使其在原 核细胞中以发酵形式快速高效地表达、 合成基因产物的体系。
基因克隆与表达
基因克隆（分子克隆molecular cloning）----通过体外重组技术,将一 段目的DNA经切割、连接插入适当载 体，并导入受体细胞，扩增形成大量 子代分子的过程。
基因克隆与表达
基因克隆的核心-----体外重组 (Recombination) : 人工将一段目的DNA 插入一个载体的过程。
基因克隆与表达
•构建流程
抽提基因组 DNA 鸟枪法制备DNA片 段 DNA片段与载体重组
转化宿主菌
筛选目的基因（核酸探针法、 免疫结合法）
基因克隆与表达
• 特点及应用： 包含所有遗传信息 构建难度大（单拷贝基因、长片段基因） 筛选难度大 用于研究基因在基因组中的情况
基因克隆与表达3、构建cDNA，筛选目的基因 • cDNA(complementary DNA