血清酶类测定

在最佳条件下进行，反应中丙酮酸生成量与ALT活性不能呈现良好的线性关系 (这是赖氏法的最大缺陷)，其标准曲线不呈直线而为抛物线。
活性单位
赖氏法以卡门单位报告测定结果
卡门单位定义：血清1ml，反应液总体积3ml， 25℃，波 长340nm，比色杯光径1.0cm，每分钟吸光度下降0.001A为一 个单位（相当于每升反应体系中0.1608µmol NADH被氧化）。
临床酶学测定酶之前，标本还要经过采集、分离和储 存等一系列处理过程。而酶在血中处于一个动态变化过 程，血液离开机体后还会有一定变化。因此在其中任何 一个阶段处理不当，都有可能引起测定值的变化。
标本应避免溶血：
大多数酶在血细胞中的含量比在血浆中高得多 ，少量 血细胞的破坏就可能引起血浆中酶明显升高。如红细胞 内的LD、AST和ALT活性分别较血清中高150、15和7倍左 右，故测定这些酶时，样品应避免溶血。
[测定方法]
一、速率法（连续监测法 ）参考方法 原理
ALT L 丙氨酸 酮戊二酸 L 谷氨酸 L 丙酮酸
L 丙酮酸 NADH H LD L 乳酸 NAD
NADH在340nm处有特征吸收峰，连续监测NADH消耗引起的 340nm吸光度变化,根据340nm处吸光度下降速率（－△A/min） 计算ALT活性
肝硬变活动期、中毒性肝炎、胆结石、胆管炎和胆囊炎等。 (2)心血管疾病：急性心肌梗死、急性心肌炎、急性心力衰竭、脑 出血等。 (3)骨骼肌疾病：多发性肌炎、进行性肌营养不良等。 （4）一些药物和毒物可引起ALT活性升高：如氯丙嗪、异菸肼、 苯巴比妥、奎宁、水杨酸制剂及酒精、铅、汞、四氯化碳或有机磷等
评价
1. 该ALT测定法中存在两个消耗NADH的副反应
血清中存在的游离α-酮酸（如丙酮酸）和增多的谷氨酸 脱氢酶（GLDH）能消耗NADH，使测定值偏高。
双试剂法：血清与缺少α-酮戊二酸的底物溶液混合，37℃保温 5min，使样品中所含内源性α-酮酸（如丙酮酸）引起的副反应进 行完毕。然后，加入α-酮戊二酸启动ALT的催化反应，在波长 340nm处连续监测吸光度下降速率。根据线性反应期吸光度下降速 率(-△A／min)，计算出ALT活力单位。（ALT测定的首选方法）
ALT在肝脏疾病中的应用价值
急性肝炎
ALT急性明显升高，常达200U以上，病情较重者可达400-600U以上，甚至 更高，个别重型病人甚至可超过1000U。ALT越高，肝脏细胞损害越严重。
慢性肝炎
慢性活动性肝炎：ALT持续轻度升高几十或100U以上（100～200U）
重型肝炎
•由于肝细胞发生大量变性，坏死，使ALT大量进入血液，因此，ALT迅 速升高，高达数百～1000U以上，如果ALT含量越高，上升越快，说明 肝细胞坏死严重，病情进展也越快。 •当病情发展到一定的严重程度，肝细胞大量坏死，肝脏生产ALT的能力 丧失，这时血液中的ALT降低，但是黄疸却持续升高（胆红素上升）， 这种现象即所谓“酶胆分离”，往往提示病情正在恶化，常是肝坏死征 兆。
四、酶的区域化分布
血清酶 符号 来源
丙氨酸氨基转移酶 门冬氨酸氨基转移酶 肌酸激酶 乳酸脱氢酶 碱性磷酸酶 酸性磷酸酶 -谷氨酰转移酶 5-核苷酸酶 单胺氧化酶 -淀粉酶 脂肪酶 谷氨酸脱氢酶 异柠檬酸脱氢酶 胆碱酯酶 山梨醇脱氢酶 鸟氨酸氨基甲酰转移酶 卵磷脂胆固醇酰基转移酶
ALT AST CK LDH ALP ACP -GT 5-NT MAO AMS LPS GLDH ICD CHE SDH OCT LCAT
2.在IFCC推荐的试剂盒中含有P5P，这是转氨酶的辅基， 能使血清中ALT发挥最大活性。
（二）定时比色法（两点法） 国内采用的比色测定法有三种： 赖氏法（30min） 金氏法（60min） 改良穆氏法（30min） 三种方法的原理、试剂、操作步骤和酶作用温度 都相似，单位定义和标准曲线绘制方法有差异。
（二）在诊断急性心肌梗死中的应用
CK-MB，LDH1，AST
（三）在诊断急性胰腺炎中的应用
AMY，LPS
（四）在诊断骨骼疾病中的应用
ALP
（五）在诊断肌肉疾病中的应用
AST，CK，LDH，ALD
（六）在诊断前列腺疾病中的应用
ACP
（七）在诊断肿瘤中的应用
同工酶
第二节 临床常用血清酶活性测定
标本（血清或血浆）
Hale Waihona Puke 赖氏比色法 原理：丙氨酸 +α-酮戊二酸
ALT
37°pH7.4
丙酮酸 + 谷氨酸
2,4-二硝 基苯肼 丙酮酸苯腙 α-酮戊二酸苯腙 (在碱性条件下呈红棕色) (在碱性条件下呈红棕色) 选择在500-520nm处检测，丙酮酸苯腙的显色强度约为α-酮戊二酸苯腙的3倍 必须降低底物α-酮戊二酸及2,4-二硝基苯肼的浓度 ALT测定不是
• 为防止酶蛋白变性 ，一般至少应在血清分离后的 当天进行测定，否则应放冰箱冷藏 • 有些酶如LD及其同工酶(LD4和LD5)在低温(特别是 20℃冰冻)可引起不可逆性失活，反而不如室温稳定 （“冷变性”）。
氨基转移酶活性测定
氨基转移酶又称转氨酶，在机体内多达60余种，广泛存在于肝 脏、心肌、骨骼肌、肾、脑、胰、肺、白细胞、红细胞中。 A-NH2+B
LD ALP（碱性磷酸酶） ACP（酸性磷酸酶）
（四）其他： 测定值受抑制剂和活化剂影响
三、血清酶的生理变异
1.性别 少数酶如CK、ALP及GGT等有性别差异，与血清酶的 来源组织有关。 2.年龄 血清酶的活性随年龄而变化，ALP和GGT到老年时可有 轻度升高。年龄差异也见于同工酶。 3.进食 过量饮酒可使血清GGT明显升高。 4.运动 多种血清酶活性升高，如CK、LD、AST、ALD和ALT 等，其升高的幅度与运动量、持续时间、运动频率及 骨骼肌所含的酶量有关。 5.妊娠 胎盘组织可分泌一些酶进入母体血液，如耐热ALP、 LD、LAP和ALT（少数）等，引起血清中这些酶活性升 高。 6.其他 一些酶活性与体重、身高的增长、体位改变、昼夜变 化及家庭因素有关。
转氨酶
A+B-NH2
其中以丙氨酸氨基转移酶(ALT或GPT)和天门冬氨酸氨基转移酶 (AST或GOT)两种最为重要，它们催化机体内氨基酸的转氨基反 应：
ALT L-丙氨酸 + α-酮戊二酸 ↔ 丙酮酸 + L-谷氨酸 AST L-天门冬氨酸 + α-酮戊二酸 ↔ 草酰乙酸 + L-谷氨酸
血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性测定
（二）赖氏比色法
AST ↔ 草酰乙酸 + L-谷氨酸 自发↓脱羧 丙酮酸
L-天门冬氨酸 + α -酮戊二酸
[参考区间]
速率法：8～40 U/L（反应温度为37℃，试剂不含P5P）
赖氏比色法： 8～28卡门单位（反应温度为37℃）
[临床意义]
1.AST广泛分布于全身各组织器官，在心肌细 胞内含量最多，当心肌梗死时，血清中AST活力 增高，在发病后6～12h之内显著增高，在48h达 到高峰，约在3～5d恢复正常。 2.血清中的AST也可来源于肝细胞，各种肝病 可引起血清AST的升高，有时可达1200卡门单位， 中毒性肝炎还可更高。 3.肌炎、胸膜炎、肾炎及肺炎等也可引起血 清AST的轻度增高。
酶的释放速度大致与酶的分子量成反比
（二）血中酶的清除：
一般以血中酶的半寿期来代表酶从血中清除快慢
AST 半寿期 17±5h ALT 半寿期 47±10h （三）酶合成异常：
1、合成减少： 对于血浆特异酶，细胞内酶合成下降
是引起血中酶变化的重要因素
2、合成增加： （1）癌细胞
（2）骨骼疾病 （3）前列腺癌
及时分离血清（血浆）：
静脉采血后，必须在1-2h内及时离心，将血清与血 细胞、血凝块分离，以免血细胞中的酶通过细胞膜 进入血清而引起误差。
尽量用血清标本：
大多数抗凝剂都在一定程度上影响酶活性，临床上 除非测定与凝血或纤溶有关的酶，一般都应以血清 作为首选测定标本。
及时测定，如不能及时测定，应放入冰箱 保存（但有些标本不能冷冻）
二、血清酶变化的病理生理机制
（一）细胞酶释放
1、细胞内外酶浓度的差异：
对于非血浆特异酶，细胞内外浓度差可在千倍以上，因此只要有少 量细胞坏死或者细胞有轻度病变，血中酶浓度就可能明显升高。
2、酶在细胞内定位与存在形式： 最容易释放入血的是胞质中游离的酶，而在 细胞亚显微结构中的酶则较难溢出
3、酶蛋白分子量的大小：
肝硬化
ALT增高程度与肝硬化的活动度和肝组织炎症改变及肝细胞损害程 度相一致。对ALT进行监测有助于对肝硬化病情的判断。若是静止 性肝硬化，则ALT维持正常 ；肝硬化病人的转氨酶出现较大幅度 的升高，提示病情可能发展成活动性，须引起警惕。
肝癌
80%—90%肝细胞都是在肝硬化基础上发生的，因此，在早期，ALT是否增高 主要决定于肝硬化的活动程度。若是静止性肝硬化，则ALT维持正常，因为 肝细胞发生癌变时，细胞并没有坏死破坏，ALT没有释放出来，因此，ALT 没有升高，或ALT有轻度或中度增高。
血清天冬氨酸氨基转移酶（AST）活性测定 [测定方法]
一、速率法（连续监测法 ） 参考方法
AST L 门冬氨酸 酮戊二酸 L 谷氨酸 L 草酰乙酸
L 草酰乙酸 NADH H MD L 苹果酸 NAD
NADH在340nm处有特征吸收峰，连续监测NADH消耗引起的 340nm吸光度变化,根据340nm处吸光度下降速率（－△A/min） 计算AST活性
AST/ALT比值大小有助于临床判断肝病严重程度
肝细胞中的总含量： AST（主要存在于肝细胞线粒体内）＞ALT（主要存在于肝细胞胞浆内） 肝细胞轻度损伤时主要是胞浆酶释放出来，血清中ALT＞AST；而肝细 胞重度损伤时胞浆酶、线粒体酶均释放出来，血清中AST＞＞ALT；随着 肝病由轻变重，AST/ALT的比值就由＜1变为＞1 急性肝炎的AST/ALT均值为0.56:1 肝硬化的AST/ALT均值为1.13：1 肝癌组AST/ALT均值为2.41：1 急性肝坏死组AST/ALT均值为3.61：1