第二章核酸的基本操作技术
基因工程知识点
基因工程各章知识点第一章绪论1．基因工程的首例操作实验三大理论基础：DNA是遗传物质、DNA的双螺旋结构和半保留复制、遗传密码的破译和遗传物质传递方式的确定三大技术基础：限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割、DNA连接酶的发现与DNA片段的连接、基因工程载体的研究与应用基因工程的诞生：72年，P.Berg首次实现体外DNA重组：体外用EcoRI分别切割SV40和λDNA,并用T4 DNA连接酶连接成为重组的杂种DNA分子73年，S.Cohen 体外重组DNA并转化：具Kanr的E.Coli质粒R6－5和具Tetr的E.Coli质粒pSC101切割并连接转化的大肠杆菌具有双重抗性S.Cohen 和H.Boyer首次实现真核基因在原核中表达：将非洲爪蟾的DNA与E.Coli质粒（pSC101）体外切割并连接，转化大肠杆菌2．基因工程的基本概念基因工程是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种新物体（受体）内，使之稳定遗传并表达出新产物或具有新性状的DNA体外操作技术，也称为分子克隆或重组DNA 技术。
供体、载体、受体是基因工程的三大基本元件。
3．基因工程的基本操作过程a分离目的DNA片段：酶切、PCR扩增、化学合成等。
b重组：体外连接的DNA和载体DNA，形成重组DNA分子。
c转化：将重组DNA分子导入受体细胞并与之一起增殖。
d筛选：鉴定出获得了重组DNA分子的受体细胞。
e对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。
第二章载体1．理解用PBR322和PUC18作载体的克隆外源基因的原理。
答案不确定PBR322作载体的克隆外源基因的原理:PBR322质粒具有12 种限制性内切酶的单一识别位点：Tet r 基因内有7个酶切位点：Bam HⅠ，SalⅠ：Amp r基因内有3 个酶切位点：PstⅠ。
Eco RⅠ和HindⅢ不在抗生素基因内，不导致插入失活。
核酸pcr操作流程
核酸pcr操作流程
核酸PCR（聚合酶链式反应）是一种用于扩增DNA片段的技朧，广泛应用于分子生物学、医学诊断、法医学等领域。
下面将介绍核
酸PCR的操作流程。
首先，准备PCR反应体系。
通常包括DNA模板、引物（primer）、dNTPs（四种脱氧核苷酸）、聚合酶、缓冲液和水。
DNA模板是待扩
增的DNA片段，引物是用于引导DNA合成的短链DNA片段，dNTPs
提供DNA合成所需的四种碱基，聚合酶是催化DNA合成的酶，缓冲
液用于维持反应的pH值。
其次，进行PCR反应。
将PCR反应体系加入PCR管中，放入
PCR仪中进行反应。
PCR反应通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，将反应体系加热至94-98摄氏度，使DNA双链解旋
成两条单链。
在退火步骤中，将反应体系降温至50-65摄氏度，引
物与DNA模板结合。
在延伸步骤中，将反应体系加热至72摄氏度，聚合酶在引物的引导下合成新的DNA链。
最后，进行PCR产物的分析。
PCR反应结束后，可以通过凝胶
电泳、实时荧光定量PCR等方法对PCR产物进行分析。
凝胶电泳可
以将PCR产物按照大小分离成不同的条带，从而确定PCR反应是否
成功。
实时荧光定量PCR可以实时监测PCR反应的进程，得到更加
准确的结果。
总的来说，核酸PCR是一种快速、灵敏、特异的DNA扩增技术，广泛应用于科研和临床实验中。
熟练掌握核酸PCR的操作流程对于
科研人员和临床医生来说至关重要，可以帮助他们更好地进行实验
和诊断工作。
核酸试剂操作方法
核酸试剂操作方法核酸试剂是用于提取、纯化和测定核酸分子的化学试剂。
核酸试剂的操作方法可以大致分为以下几个步骤：样品处理、溶解、纯化、测定等。
下面我将详细介绍每个步骤的操作方法。
1. 样品处理：在进行核酸提取前，首先需要对样品进行处理。
根据实验的目的和样品的性质，可以选择不同的样品处理方法。
比较常见的样品处理方法包括：细胞裂解、血浆或血清的凝固、骨髓抽提等。
在样品处理过程中要注意采用无菌操作，避免污染。
2. 溶解：将处理后的样品或沉淀加入适当的溶解液中，使核酸完全溶解。
常用的核酸溶解液包括：TE缓冲液、含EDTA的去离子水等。
在样品溶解时，需轻轻摇晃或轻轻慢搅拌，避免生成气泡。
3. 核酸纯化：核酸溶解后，需要进行纯化以去除与核酸有关的杂质，如蛋白质、盐类和酶等。
常用的核酸纯化方法有酚-氯仿法、硅胶柱法、离心柱法等。
不同的纯化方法适用于不同的样品类型和实验需求。
在纯化过程中，需要根据试剂的使用说明进行操作，以保证纯化效果。
4. 核酸测定：核酸纯化后，可以通过一系列测定手段来确定核酸的浓度和纯度。
测定核酸浓度和纯度的方法有：比色法、荧光法、紫外吸收法等。
在进行核酸测定时，需要根据试剂的使用说明和仪器的操作步骤进行操作，确保结果的准确性。
除了上述操作步骤外，核酸试剂的操作还需要注意以下几点：1. 实验室条件：进行核酸实验需要在洁净、无菌的实验环境下进行，避免外源性DNA和RNA的污染。
2. 消毒处理：实验前需要将操作台面、试剂瓶盖、离心管等实验器材进行消毒处理，以避免细菌、病毒的污染。
3. 无菌操作：在进行核酸提取和纯化操作时，需采用无菌技术，包括用纯化的试剂和器皿、带手套、使用滤芯枪头等。
4. 试剂保存：核酸试剂的保存条件需根据试剂的要求进行，常见的存储条件包括-20保存、避光保存等。
5. 操作技巧：在进行核酸试剂操作时，需熟悉试剂的用途和使用方法，并掌握相关实验技巧，以保证试剂的有效使用。
总之，核酸试剂的操作方法涉及样品处理、溶解、纯化和测定等步骤。
新冠核酸检验操作规程
新冠核酸检验操作规程新冠核酸检验是一种常用的方法来检测新型冠状病毒感染，以下是新冠核酸检验的操作规程。
一、实验室准备工作：1. 确保实验室内有足够的试剂和耗材，包括核酸提取试剂、PCR试剂盒、纯化试剂盒、标本采集和保存耗材等；2. 检查实验室内的设备完好，并及时进行维护和校准；3. 准备好标本接收和处理的工作区域，并保持清洁和消毒。
二、标本采集和处理：1. 选择适当的采集方法和采集器具，如采用鼻咽拭子或喉拭子；2. 采集标本时，确保操作人员戴好一次性手套、口罩和护目镜，并遵循相关的操作规范；3. 将采集的标本放入含有病毒保存液的标本管中，并确保标本管密封良好；4. 标本采集完毕后，及时送至实验室进行处理。
三、核酸提取：1. 根据核酸提取试剂盒的使用说明，准备好提取试剂和相关的试剂盒；2. 根据提取试剂盒的操作规程，将采集的标本转移到提取试剂中，并进行充分混合；3. 按照试剂盒的说明，采用相应的方法进行病毒核酸的提取；4. 注意防止交叉污染和保持操作区域的清洁；5. 提取完成后，将提取得到的核酸样品保存在低温条件下，以备后续的PCR扩增。
四、 PCR扩增：1. 准备好PCR试剂盒和PCR扩增仪，并根据试剂盒的操作说明进行配置；2. 将核酸样品与PCR试剂混合，并进行扩增反应；3. 注意控制扩增反应的条件和时间，以保证扩增效果和准确性；4. 控制反应体系的污染，避免假阳性结果的发生；5. 扩增反应结束后，将反应产物进行凝胶电泳和解读结果。
五、结果分析和报告：1. 根据PCR扩增结果，分析是否存在病毒核酸的阳性；2. 结果分析应根据相关的操作规范和标准进行，确保结果的准确性；3. 对于阳性结果，应及时向相关部门进行报告，并根据相关的防控指南进行流行病学调查和隔离治疗等工作；4. 对于阴性结果，应综合考虑临床表现、流行病学史等因素，综合判断患者是否可能存在感染。
六、实验室安全和质量控制：1. 实验室操作人员应遵守相关的安全规范和操作规程，确保自身和他人的人身安全；2. 实验室应建立和维护质量控制体系，包括正控和负控样品的使用和管理；3. 定期参加质量评估和技术培训，提高实验室的技术水平和质量控制能力；4. 定期对实验室进行清洁和消毒，以保持实验室的清洁和无菌环境。
第二章核酸的基本操作技术
的目的。
要成功的提取mRNA，也应尽可能完全抑制或去除RNA酶的活性。
寡聚(dT)-纤维素柱法提纯mRNA的过程
柱平衡（以上柱缓冲液洗脱纤维素柱，至柱流出液 的pH值小于8.0)
装柱( RNA水溶液于65℃温育5min，迅速冷却后按 RNA水溶液︰ 上柱缓冲液=1 ︰ 1混合装柱 洗涤(以5-10V的上柱缓冲液将未与柱结合的RNA等
4、 影响质粒DNA产量的因素 最重要的是： 菌株的遗传背景， 质粒自身的拷贝数。
（1）受体菌株
一般要使用endA基因发生突变的大肠杆菌 菌株。如DH5、JM109、TG1等。
endA基因编码核酸内切酶Ⅰ，在Mg2+的存 在下可将双链DNA消化成7bp的寡核苷酸片段。
（2）质粒拷贝数 这是直接决定DNA产量的重要因素之一。 质粒本身的性质所决定。
② 葡萄糖
增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA 受机械力（震荡）的作用而降解。
③EDTA
Mg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活 性，防止DNA被酶降解。
④NaOH-SDS
NaOH：强碱，提供pH>12的碱性条件，使 DNA双链变性。
SDS: 溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结 合成“蛋白—SDS”复合物，使蛋白质（包括 DNA酶）变性沉淀。
（五）动物细胞DNA的提取
提纯的思路： 动物DNA的特性：分子量较大，易断，提取
过程中应尽量避免剧烈的搅拌，并注意抑制组织 中DNase的活性。
要去除的杂质：RNA、蛋白、多糖、脂类及 各种小分子杂质。
一般过程及原理： （1）组织粉碎
动物组织剪成小块，置液氮中冻结后 研磨成细粉末。
组织培养的细胞用胰酶消化松散后直 接使用。
基因工程知识点1
基因工程知识点基因工程1、操作水平:DNA分子水平目的:定向改变遗传物质或获得基因产物。
理论基础：1）物质基础一一脱氧核甘酸2）结构基础一一规则的双螺旋结构3）中心法则，共用一套遗传密码2、基因工程（geneticengineering）:指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。
上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）,而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。
（基因操作、遗传工程、重组DNA技术）。
1973年诞生的基本用途:分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源;大规模生产生物活性物质；设计、构建生物的新性状甚至新物种。
3、重组DNA技术：是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组,然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术其核心步骤是DNA片段之间的体外连接。
4、基因工程的基本形式：第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表达经典基因工程第二代蛋白编码基因的定向诱变蛋白质工程第三代基因工程代谢信息途径的修饰重构途径工程第四代基因组或染色体的转移基因组工程5、基因工程诞生的理论基础:理论上的三大发现1】证实了DNA是遗传物质；2】揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理；3］遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定。
6、DNA双螺旋:带负电的糖一磷酸骨架在外侧,碱基在螺旋中间相互堆叠，以5'-3'方向反向平行关系。
第二章用于核酸操作的工具酶1、寄主的限制和修饰现象：［1］作用:保护自身DNA不受限制；破坏入侵的外源DNA,使之降解。
【2】入侵噬菌体的子代便能高频感染同一宿主菌，但却丧失了在其原来宿主细胞中的存活九因为它们在接受新宿主甲基化酶修饰的同时,也丧失了原宿主菌甲基化修饰的标记。
2、限制性核酸内切酶的命名：如:HindI属名(H)+种名(in)+株名(d)+类型(I)II型限制性核酸内切酶的基本特性:识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列,大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧,识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构。
分子生物学第九章--分子生物学研究方法电子教案精选全文
可编辑修改精选全文完整版•第九章分子生物学研究方法1．课程教学内容(1)核酸技术1—基本操作(2)核酸技术2—克隆技术(3)核酸技术3—测序(4)基因表达和表达分析基因定点诱变(5)蛋白质与核酸的相互作用(6)其他（热点）技术2．课程重点、难点基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测技术3．课程教学要求掌握基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测等各种技术的原理。
本章内容•核酸的凝胶电泳•DNA分子的酶切割•核酸的分子杂交•基因扩增•基因的克隆和表达•细菌的转化•DNA核苷酸序列分析•蛋白质的分离与纯化•研究DNA与蛋白质相互作用的方法一、核酸的凝胶电泳基本原理：当一种分子被放置在电场当中时，它们会以一定的速度移向适当的电极。
电泳的迁移率：电泳分子在电场作用下的迁移速度，它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷成正比。
由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖和丙烯酰胺，从而降低了对流运动，故电泳的迁移率又同分子的摩擦系数成反比。
在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的。
从这个意义上讲，DNA和RNA的多核苷酸链可叫做多聚阴离子，因此，当核酸分子放置在电场中时，它就会向正极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移率，取决于核酸分子本身大小和构型。
分子量较小的DNA 分子，比分子量较大的分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快些。
Gel matrix (胶支持物) is an inserted, jello-like porous material that supports and allows macromolecules to move through.Agarose (琼脂糖):(1) a much less resolving power than polyacrylamide,(2)but can separate DNA molecules of up to tens of kbDNA can be visualized by staining the gel with fluorescent dyes, such as ethidium bromide (EB 溴化乙锭)Polyacrylamide (聚丙稀酰胺):(1)has high resolving capability, and can resolve DNA that differfrom each other as little as a single base pair/nucleotide.(2)but can only separate DNA over a narrow size range (1 to a fewhundred bp).Pulsed-field gel electrophoresis (脉冲电泳)(1)The electric field is applied in pulses that are orientedorthogonally (直角地) to each other.(2)Separate DNA molecules according to their molecule weight, as wellas to their shape and topological properties.(3)Can effectively separate DNA molecules over 30-50 kb and up toseveral Mb in length.二、DNA分子的酶切割Restriction endonucleases (限制性内切酶) cleave DNA molecules at particular sitesRestriction endonucleases (RE) are the nucleases that cleave DNA at particular sites by the recognition of specific sequences.RE used in molecular biology typically recognize (识别) short (4-8bp) target sequences that are usually palindromic (回文结构), and cut (切割) at a defined sequence within those sequences. e.g. EcoRIThe random occurrence of the hexameric (六核苷酸的) sequence: 1/4096 (4-6=1/46)(1) Restriction enzymes differ in the recognition specificity: target sites are different.(2) Restriction enzymes differ in the length they recognized, and thus the frequencies differ.(3) Restriction enzymes differ in the nature of the DNA ends they generate: blunt/flush ends (平末端), sticky/staggered ends (粘性末端).(4) Restriction enzymes differ in the cleavage activity.三、核酸的分子杂交原理：带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。
采核酸培训操作规程(3篇)
第1篇一、目的为了确保核酸检测工作的顺利进行，提高核酸检测的准确性和安全性，特制定本操作规程。
本规程适用于所有参与核酸检测工作的相关人员。
二、适用范围本规程适用于各级医疗机构、疾控中心、检测机构等从事核酸检测工作的相关人员。
三、操作流程1. 准备工作- 确保核酸检测实验室环境符合国家标准，通风良好，温度适宜。
- 准备好核酸检测所需的试剂、仪器、耗材等，并检查其有效性。
- 确保实验室人员穿戴个人防护装备，如医用防护服、手套、口罩等。
2. 样本采集- 根据样本类型（咽拭子、鼻拭子等）选择合适的采集工具。
- 使用无菌操作技术，采集样本时避免污染。
- 样本采集后立即封存，并做好样本标签。
3. 样本处理- 将采集的样本按照试剂说明书要求进行处理。
- 注意处理过程中的无菌操作，防止交叉污染。
4. 核酸检测- 将处理好的样本按照试剂说明书要求进行核酸检测。
- 使用自动化仪器进行核酸提取和扩增，确保检测效率。
5. 结果分析- 对检测结果进行仔细分析，确保结果的准确性。
- 记录检测结果，并进行数据统计和分析。
6. 报告出具- 根据检测结果出具核酸检测报告。
- 报告应包括样本信息、检测结果、检测日期等。
7. 废弃物处理- 将使用过的试剂、耗材等废弃物按照相关规定进行分类、封装，并交由有资质的机构进行处理。
四、注意事项1. 人员培训- 所有参与核酸检测的人员必须接受专业培训，掌握核酸检测的原理、操作流程和注意事项。
- 定期进行技能考核，确保操作人员熟练掌握操作技能。
2. 无菌操作- 核酸检测过程中必须严格遵守无菌操作规程，防止污染。
3. 试剂和耗材管理- 试剂和耗材应定期检查，确保其质量和有效性。
- 试剂和耗材的储存条件应符合要求，避免因储存不当导致失效。
4. 生物安全- 严格遵守生物安全操作规程，防止病毒传播。
- 实验室应配备必要的防护设施，如生物安全柜、消毒设备等。
5. 记录管理- 所有核酸检测活动应有详细记录，包括样本信息、操作人员、检测时间、结果等。
《基因工程B》复习提纲2020
第一章基因工程概述一、名词解释基因、基因操作、基因工程、重组DNA技术二、思考题1、简述基因工程操作的基本步骤。
2、简述基因工程操作的理论依据。
3、简述基因工程诞生理论上的三大发现和技术上的三大发明。
第二章基因工程的工具酶一、名词解释限制性内切酶、同裂酶、同尾酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶二、思考题1、简述限制性内切酶命名的基本原则。
2、影响限制性内切酶活性的因素主要有哪些？3、影响连接反应效率的因素主要有哪些？4、大肠杆菌DNA聚合酶有哪些活性？分别简要说明其主要用途。
5、简述切口平移法标记DNA的原理。
答：首先，在Mg2+存在下利用低限量的DNase I处理双链DNA，随机产生少量切口；然后，利用大肠杆菌DNA聚合酶I的5'→3'外切酶活性在切口处向3'端平移去除核苷酸，同时，其5'→3'聚合酶活性则将切口作为引物沿5'→3'方向催化DNA合成；随着反应的进行，5'端核苷酸不断去除，3'端核苷酸不断掺入，导致切口沿着DNA合成方向移动，即切口平移。
如果在反应体系中加入标记dNTP，则这些标记dNTP将取代原有的核苷酸残基，产生带标记的DNA分子。
6、简述交换（置换）法标记DNA的原理。
答：反应体系中只有一种标记的dNTP存在时，可利用大肠杆菌DNA聚合酶I或T4/T7 DNA 聚合酶的3’→5’外切酶活性从3’端降解DNA，当露出与该标记dNTP互补的碱基时，上述酶的5'→3'聚合酶活性则催化该位置发生合成反应，用标记的dNTP置换原来的核苷酸残基，产生3’端标记的DNA。
第三章基因工程的载体一、名词解释载体、质粒、噬菌体、噬菌体溶菌周期、噬菌体溶原周期、克隆载体、表达载体、穿梭载体、整合载体、表达标签二、思考题1、简述克隆载体具备的基本条件。
2、以大肠杆菌为例，解释利用α互补筛选重组质粒的原理。
核酸检测的操作规程
核酸检测的操作规程核酸检测的操作规程一、实验室准备1. 确保实验室设备正常运行并处于良好状态，包括核酸提取仪、PCR仪、离心机等。
2. 准备所需试剂和材料，包括核酸提取试剂盒、逆转录试剂盒、PCR试剂盒等。
3. 检查并清洁实验台面及仪器表面，以确保无任何污染。
4. 佩戴防护装备，包括实验帽、实验服、手套等，以防止实验过程中的交叉污染。
5. 核对每个样本的信息，确保准确无误。
二、核酸提取1. 提取样本之前，将样本转移到符合规定的安全实验室。
2. 根据试剂和设备的说明书，进行核酸提取。
将样本加入提取试剂中，充分混合。
3. 使用离心机进行离心分离，离心条件按照试剂盒的要求。
4. 将提取的核酸样品转移至干燥的离心管中，保存在低温条件下，避免冻融。
三、逆转录1. 准备逆转录反应液，按照试剂盒说明书中的配方比例配制。
2. 将核酸样品与逆转录反应液混合，反应温度和时间按照试剂盒要求进行设置。
3. 使用逆转录仪进行反应，注意反应过程中温度的稳定。
4. 反应结束后，检查反应液的外观，确保反应成功。
四、PCR扩增1. 准备PCR反应液，按照试剂盒说明书中的配方比例配制。
2. 将逆转录反应液与PCR反应液混合，充分混合。
3. 设定PCR仪的温度曲线和扩增时间，确保参数设置正确。
4. 在PCR扩增结束后，进行凝胶电泳检测，检查扩增产物的数量和大小。
五、结果分析和记录1. 根据凝胶电泳的结果，判定扩增产物是否存在。
2. 根据扩增产物的大小和带电泳率，判断所检测的目标基因是否存在。
3. 记录检测结果，包括样本编号、核酸提取情况、逆转录情况、PCR扩增结果等。
4. 输送结果至指定的部门或仪器进行最终结果分析和报告生成。
六、实验后处理1. 清洗实验台面和仪器设备，以确保无任何污染。
2. 妥善处理实验过程中产生的废液和废弃物，按照规定的程序进行处理。
3. 对实验室设备进行常规的维护和保养，以确保正常运行。
以上是核酸检测的操作规程，通过严格的操作流程和规范的实验室操作，可以确保核酸检测的准确性和可靠性，提供有效的数据支持。
核酸检测操作培训课件
核酸检测操作培训课件核酸检测操作培训课件随着新冠疫情的爆发和蔓延，核酸检测成为了目前最主要的病毒检测手段之一。
为了提高核酸检测的准确性和效率，许多机构和实验室都开展了相关的操作培训课程。
本文将介绍一些核酸检测操作培训课件的内容和要点。
一、核酸检测的原理和意义在介绍具体的操作步骤之前，首先需要了解核酸检测的原理和意义。
核酸检测通过提取样本中的核酸，利用特定的引物和酶的作用，扩增目标病毒的核酸片段，并通过荧光信号等方式进行检测和定量。
核酸检测的意义在于及时发现感染者，采取相应的隔离和治疗措施，有效遏制病毒的传播。
二、核酸检测的操作步骤1. 样本采集与保存核酸检测的第一步是样本采集与保存。
常见的样本包括鼻咽拭子、咽拭子、唾液等。
在采集样本时，需要注意采集器具的清洁和消毒，避免外界污染。
采集后的样本应妥善保存，避免温度过高或过低，影响核酸的稳定性。
2. 样本处理与核酸提取样本处理与核酸提取是核酸检测的关键步骤之一。
首先需要将采集的样本转移到提取管中，加入相应的提取缓冲液，破坏细胞膜和核酸的结构。
然后通过离心等操作，将核酸从其他组分中分离出来，并将其溶解在适当的缓冲液中，以便后续的扩增和检测。
3. 核酸扩增与检测核酸扩增与检测是核酸检测的核心步骤。
常用的扩增方法包括聚合酶链式反应（PCR）、实时荧光定量PCR（qPCR）等。
在扩增过程中，需要添加特定的引物和酶，以选择性地扩增目标病毒的核酸片段。
扩增后的产物可以通过荧光信号等方式进行检测和定量。
三、操作注意事项和常见问题在进行核酸检测操作时，需要注意以下几个方面的问题：1. 严格遵守操作规程和实验室安全规定，确保自身和他人的安全。
2. 保持操作环境的洁净和无菌，避免外界污染对实验结果的影响。
3. 使用高质量的试剂和耗材，确保实验的准确性和可靠性。
4. 注意样本的保存和处理方法，避免核酸的降解和损伤。
5. 定期进行设备的维护和校准，确保设备的正常运行和结果的准确性。
DNA操作的基本技术
RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经 过复性处理后，形成异源双链旳过程
一、Southern 印迹可用于分析基因 拷贝数旳变化
• 由E. M. Southern在1975年提出 • 可用于分析基因拷贝数旳变化 • 基本操作过程涉及
* DNA序列分析措施旳演变和发展
• 20世纪70年代 – 双脱氧链终止法：F. Sanger – 化学裂解法：A. Maxam和W. Gilbert
• 20世纪80年代 – PCR及自动测序技术
一、DNA序列分析有双脱氧链终止法和 化学裂解法
• （一）Sanger双脱氧链终止法利用2′，3 ′ 双脱氧核苷酸掺入中
酵母单杂交技术旳基本原理
三、蛋白质-RNA相互作用也可采用酵母 三杂交系统进行分析
• 酵 母 三 杂 交 系 统 （ yeast three-hybrid system）于1996年由等首先报道
（一）用于蛋白质-RNA相互作用分析旳酵母 三杂交系统需要杂合RNA
酵母三杂交基本原理
（二）酵母三杂交系统应用范围广泛
• 可进行与特定蛋白结合旳未知RNA旳筛选； • 拟定RNA-蛋白质相互作用旳构造域； • 鉴定、分离能够辨认具有主要生理功能
RNA旳RNA结合蛋白。
蓝 ddC
ddT
荧光标识
DNA合成
毛细管电泳
测序成果展示
二、DNA序列分析能够揭示基因和 基因组一级构造变化
• 经过DNA序列分析能够鉴定基因和基因组 旳变异
• 经过DNA序列测定分析人工重组旳基因 • 经过DNA序列测定对定点突变进行确认
第四节
DNA芯片技术
简答核酸制备的基本操作流程
简答核酸制备的基本操作流程下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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RNA基本操作技术
RNA基本操作技术RNA（核糖核酸）是生物体内重要的信息传递分子，具有多种功能，包括编码蛋白质、调节基因表达等。
研究RNA的基本操作技术对于生物学研究及生物医学研究具有重要意义。
以下将介绍RNA的提取、纯化、合成以及检测等基本操作技术。
首先，RNA的提取是RNA研究的首要步骤。
常用的RNA提取方法有酚-氯仿法和离心柱法。
酚-氯仿法通过酚和氯仿的相互作用，使RNA从细胞中析出。
离心柱法则利用离心柱将细胞破碎后的混合液分离为RNA在上层，DNA和蛋白质沉淀在下层。
根据研究需求可以选择适合的提取方法。
其次，RNA的纯化是提取RNA后的必要步骤。
纯化可以去除杂质，提高RNA的纯度。
常用的RNA纯化方法包括酚醇沉淀法和离心柱法。
酚醇沉淀法通过酚和醇的相互作用，使RNA从杂质中析出。
离心柱法则利用离心柱将RNA溶液在离心过程中与柱子质量交互作用，使RNA与柱子结合，去除杂质。
纯化后的RNA用于后续实验，能够减少假阳性结果产生。
RNA的合成是RNA研究的重要环节。
合成的RNA可以用于基因组学、转录组学以及RNA修饰研究等多个领域。
常用的RNA合成方法有原位合成法和化学合成法。
原位合成法利用核酸酶的逆合成活性，在DNA模板上合成RNA。
化学合成法则利用化学方法在固相合成支持物上逐个添加核苷酸来合成RNA。
根据具体需求，可以选择不同的合成方法。
最后，RNA的检测是研究RNA功能的重要手段。
常用的RNA检测方法有逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、Northern blot、原位杂交以及基因芯片技术等。
RT-PCR方法可以定量分析RNA的表达水平，并检测低水平的RNA。
Northern blot技术则能够检测特定长度的RNA分子，并定量测量RNA的表达水平。
原位杂交方法则可检测RNA在细胞中的位置和表达水平。
基因芯片技术则能够同时检测大量的RNA表达，并分析差异表达基因。
综上所述，RNA的基本操作技术包括提取、纯化、合成和检测等。
核酸检测操作指南
核酸检测操作指南
1. 简介
核酸检测是一种用于检测特定病原体的方法，常用于疾病诊断
和大规模筛查。
本操作指南旨在提供核酸检测的基本步骤和注意事项。
2. 操作步骤
步骤一：样本采集
1. 确保采集器具和试剂齐全，并严格按照操作要求进行消毒。
2. 使用无菌棉签或采样管收集样本。
常见的样本来源包括喉拭子、鼻拭子、唾液等。
3. 确保样本采集完整，避免交叉污染。
步骤二：核酸提取
1. 根据实验室提供的核酸提取试剂盒使用说明，进行核酸提取。
2. 注意严格按照操作要求进行样本处理，避免污染和损坏。
步骤三：核酸扩增
1. 根据实验室提供的核酸扩增试剂盒使用说明，进行核酸扩增。
2. 注册样本信息，确保数据的准确性和可追溯性。
步骤四：结果判读
1. 根据实验室提供的结果判读标准，对扩增反应结果进行判读。
2. 注意识别阳性和阴性结果，避免误读和漏读。
3. 注意事项
- 操作前必须戴好防护手套和口罩，做好个人防护。
- 严格按照操作要求和实验室规范进行操作，防止交叉污染。
- 对于复杂样本或结果不确定的情况，及时与实验室负责人沟
通并寻求帮助。
- 操作结束后，记得将实验器材进行消毒处理。
以上为核酸检测操作指南的简要介绍和操作步骤，希望能对您
的工作有所帮助。
> 注意：本文档内容仅供参考，请在实际操作中严格遵守相关
法规和实验室规范。
> 注意：由于核酸检测标准和操作要求可能因地区和实验室而异，请在操作前核实并了解相关指导。
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增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA 受机械力（震荡）的作用而降解。
③EDБайду номын сангаасA
Mg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活 性，防止DNA被酶降解。
④NaOH-SDS
NaOH：强碱，提供pH>12的碱性条件，使 DNA双链变性。
SDS: 溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结 合成“蛋白—SDS”复合物，使蛋白质（包括 DNA酶）变性沉淀。
3、病毒DNA：构建克隆和表达载体，分离目的基因 4、叶绿体和线粒体DNA： 构建克隆载体，分离目的基因
（二）DNA提取的一般步骤
准备生物材料： 选用的材料应处于提取DNA得率最高的生长期。如：
提取大肠杆菌质粒DNA，菌液应培养至对数生长后期(测定 OD600值）；提取植物DNA，最好选取幼嫩的部分。
特点：能较好的去除糖类杂质，对于含糖较高的材料 最为合适;在提取前期能同时得到高质量的DNA及RNA
（四）细菌质粒DNA的提取—— 碱裂解法
提取的思路： 质粒的特性：共价闭合、环状的小分子量DNA 要去除的物质：
基因组DNA（调节pH从12.6降到7.0左右） 蛋白质（SDS和蛋白酶变性，苯酚-氯仿 抽提） 脂类及小分子杂质（乙醇等） RNA（RNase)
第一步：溶菌
使用“溶液Ⅰ”溶解细菌细胞壁。
Solution I 的配制：
50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl(pH8.0)， 10mM EDTA， 4-5mg/ml溶菌酶， RNase A
第二步：破膜，蛋白质和DNA变性 溶液II 破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。 Solution II 的配制（现用现配）： 0.2M NaOH，1.0%SDS
4、 影响质粒DNA产量的因素 最重要的是： 菌株的遗传背景， 质粒自身的拷贝数。
（1）受体菌株
一般要使用endA基因发生突变的大肠杆菌 菌株。如DH5、JM109、TG1等。
endA基因编码核酸内切酶Ⅰ，在Mg2+的存 在下可将双链DNA消化成7bp的寡核苷酸片段。
第二章 核酸的基本操作技术
本章的主要内容
• 核酸的提取 • 核酸的检测与保存 • 核酸的凝胶电泳 • 核酸的分子杂交
第一节 核酸的提取
一、DNA的提取 二、RNA的提取
一、 DNA的提取
DNA是生物的主要遗传物质，因而DNA的制 备是基因工程的基础。由于生物形式的多样性 （细菌、植物、动物），以及DNA在生物体中存 在形式的差异（染色体、线性DNA、质粒），因 此，制备DNA的过程和方法也不相同。
裂解细胞： 对于原核生物可用溶菌酶、冰冻和超声波等法；对于
结构复杂的动植物材料先粉碎，然后用液氮研磨或匀浆。
分离和提取DNA： 总DNA，酚／氯仿等抽提； 叶绿体／线粒体DNA，一般采取先提纯细胞器，再溶解 细胞器膜，待释放出细胞器DNA后，再进一步提取纯化之。 质粒DNA，要将其与染色体DNA分开。
第三步：中和
溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物 和染色体DNA、RNA沉淀。 Solution III的配制：
3M 醋酸钠（用冰醋酸调pH至4.8）
第四步：离心除去沉淀 上清液中含有闭合质粒DNA。
第五步：纯化DNA 酚-氯仿抽提。
第六步：沉淀DNA 0.6倍体积的异丙醇或2倍体积的乙醇。
1、原理
DNA双链
变性 强碱
DNA单链 中性 复性
闭合环状的质粒DNA，在变性后不会 分离，复性快；
染色体线性DNA变性后双链分离，难以 复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复 合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。
变性
2 、所用的试剂作用
① 溶菌酶 能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽
聚糖中的-1，4糖苷键。 在碱性条件（pH>8）下有活性。
有时还需要加入CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）除 去细菌多糖。
基本原理：CTAB可溶解细胞膜，与核酸形成复合物， 在高盐溶液中是可溶的；在低盐溶液中沉淀，通过离心就 可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开； 然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加 入乙醇使核酸沉淀，而CTAB溶于乙醇。
⑤ NaAc-HAc缓冲液
冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8。用来中和 NaOH变性液，使DNA复性。
⑥ 酚-氯仿 蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白
质，使蛋白质沉淀。 苯酚用来抽提蛋白，氯仿用来抽提苯酚。
⑦ 乙醇 用于沉淀DNA。 DNA分子以水合状态“溶于”水里， 乙醇能夺去DNA分子的水环境。
⑧ RNase A
降解RNA渣滓。 以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。
⑨ TE缓冲液 DNA保存液。 由Tris-HCl和EDTA配制。 Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼 酸缓冲液），有利于以后操作；
EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。
3、碱抽提法提取质粒DNA的步骤
（一）DNA在生物体中的存在形式
1、染色体DNA 是生物体遗传信息的主要载体 * 原核生物染色体：结构简单，储存的信息相对较少 * 真核生物染色体：结构复杂，储存大量的遗传信息 用途：分离目的基因，研究基因的调控与表达
2、质粒DNA（染色体外遗传物质） 特点：能自我复制，大小不一，在体内以超螺旋形 式存在，在体外以超螺旋、开环和线形存在。 用途：构建克隆、表达载体，分离目的基因
（三）细菌总DNA的制备（E.coli）
1.菌体培养: 将活化的菌体接种于LB(Luria- Bertani) 培养基，于37 oC培养至对数生长期,然后置冰水浴20min 2.收集菌体: 离心(5000 g， 5 min) (50 ml) 3.菌体裂解: 加5ml冷 TES(0.1 M Tris-HCl,0.1 M EDTA， 0.15 M NaCl，pH 8.0)加10 mg 溶菌酶，于37 oC 温育10 min 4.去RNA: 加入1 mg RNaseA，于室温温育15 min 5.去蛋白: 加入0.6 ml 10% SDS和Protease K(0.1mg/ml)， 50 oC，3h，加苯酚-氯仿抽提(等体积) 6.沉淀DNA: 加入1/10 V 的NaAc，2 V 无水乙醇以玻璃 棒缠绕絮状沉淀，溶于TE Buffer中