核酸提取

DNA提取的几种方法
染色体DNA的提取
➢ CTAB法 ➢ SDS法 ➢ 其它
DNA提取的几种方法
非染色体DNA的提取 ➢ 质粒DNA的提取
• 碱裂解法 • 煮沸法
➢ 线粒体、叶绿体DNA的提取 • 差速离心结合SDS裂解法
基因组DNA－CTAB法
CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）
➢ CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基 三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜， 并与核酸形成复合物。
➢ 复性时间也不宜过长，否则会 有基因组DNA的污染
➢ G＋菌、酵母质粒的提取，应先 用酶法或机械法处理，以破壁
DNA分离、纯化
基因组DNA的提取
质粒DNA的提取
➢ 采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提 供相应的缓冲体系
➢ 采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但 动作要轻柔
➢ 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间
➢ 针对不同材料，选择适当的裂 解预处理方式：
• 植物材料－－液氮研磨 • 动物组织－－匀浆或液氮研磨 • 组培细胞－－蛋白酶K • 细菌－－溶菌酶破壁 • 酵母－－破壁酶或玻璃珠
➢ 高温温浴时，定时轻柔振荡
➢ 菌体量适当
➢ 培养基去除干净，同时保证菌 体在悬浮液中充分悬浮
➢ 变性的时间不要过长（5分钟）， 否则质粒易被打断
➢ 使用处于对数期的新鲜菌体 （老化菌体导致开环质粒增加）
➢ 培养时应加入筛选压力，否则 菌体易污染，质粒易丢失
➢ 尽量选择高拷贝的质粒，如为 低拷贝或大质粒，则应加大菌 体用量
➢ 菌株不要频繁转接（质粒丢失）
细胞裂解
基因组DNA的提取
质粒DNA的提取
➢ 材料应适量，过多会影响裂解， 导致DNA量少，纯度低
➢ 该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通 过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙 醇沉淀即可使核酸分离出来。
基因组DNA－SDS法
SDS法原理
➢ SDS(十二烷基硫酸钠)是一种阴离子去垢剂，在高温 （55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白 变性，释放出核酸；
➢ 用多糖水解酶将多糖降解。
➢ 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可 以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。
核酸分离、纯化
多酚的去除：
➢ 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、 抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等
➢ 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它 们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合
➢ 当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象；
➢ 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。
DNA提取的基本步骤
I.材料准备 II.破碎细胞或包膜－内容物释放
wenku.baidu.com离子的去除：
➢ 70％的乙醇洗涤
核酸沉淀、溶解
基因组DNA的提取
质粒DNA的提取
➢ 当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀， 沉淀会更充分
➢ 沉淀时加入1/10体积的NaOAc（pH5.2，3M），有 利于充分沉淀
➢ 沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等
➢ 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；
➢ 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。
质粒DNA－煮沸法
煮沸法原理
➢ 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；
➢ 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白 质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；
➢ 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀 水相中的DNA。
基因组DNA－其它方法
根据细胞裂解方式的不同有：
➢ 物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法
➢ 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 ➢ 生物方式：酶法
➢ 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相 应的去杂质的方法
核酸分离、纯化
蛋白质的去除：
➢ 酚/氯仿抽提 ➢ 使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等） ➢ 高盐洗涤 ➢ 蛋白酶处理
核酸分离、纯化
多糖的去除：
➢ 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体 积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。
基因组DNA－其它方法
根据核酸分离纯化方式的不同有： ➢ 吸附材料结合法：
• 硅质材料
高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷高效。
• 低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。
阴离子交换树脂 适用于纯度要求高的实验。
• 磁珠
磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的 物，从而达到分离目的。
基因组DNA－其它方法
前言
核酸是遗传信息的载体，包括DNA和RNA, 是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究 的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实 验技术中最重要、最基本的操作 。
内容
第一部分：DNA提取方法简介
第二部分：DNA提取常见问题、 原因分析及其对策
第三部分：RNA提取方法简介
第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策
III.核酸分离、纯化 IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质 V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
材料准备
基因组DNA的提取
质粒DNA的提取
➢ 最好使用新鲜材料，低温保 存的样品材料不要反复冻融
➢ 提取血液基因组DNA时，要 选择有核细胞（白细胞）
➢ 组培细胞培养时间不能过长， 否则会造成DNA降解
➢ 含病毒的液体材料DNA含量较 少，提取前先富集
➢ 浓盐法：
利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离
➢ 有机溶剂抽提法：
有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用
➢ 密度梯度离心法：
利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物
质粒DNA－碱裂解法
碱裂解法原理
➢ 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；