SPR(Biacore)动力学亲和力分析
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» 高流速有效减少了扩散距离
• •
可选的预设分析模式中已考虑了物质迁移效应
15
实验设计
实验设计
稳态实验--分析亲和力
Biacore Training
• • • • • •
通过一系列不同的分析物浓度，确定达到稳态的结合水平 较高的偶联水平 浓度范围至少应该覆盖芯片表面的 20-80% 饱和度(RMAX) 设置对照芯片表面 设置至少一个浓度的样品重复 设置零浓度样品
2
动力学分析和亲和力分析的相关性?
•
Biacore Training
细胞本身就是一个动态系统 – 极少处在平衡状态 同样的亲和力，不同的反应，动力学数据一般并不相 同
» 动力学数据提供了更多的信息
•
3
同样的亲和力，不同的动力学
• •
Biacore Training
所有4个化合物的亲和力数据相同 KD = 10 nM = 10-8 M 结合动力学常数可有不同数量级范围内的改变，本例中为4个 数量级
源自文库17
必须考虑的几个因素
动力学分析
Biacore Training
• • • • • •
试剂纯度 偶联方法 偶联水平 配体活性 样品流速 分析物浓度范围
18
分析物浓度
动力学分析
•
Biacore Training
• •
浓度应该覆盖所有范围的结合曲线（低浓度—饱 和浓度） 设置至少一个浓度的样品重复 设置零浓度样品
我们无需知道复合物和配体的实际浓度！
8
Biacore中的速率和亲和力
A
Biacore Training
d [AB] dt ka
B
[A]
ka kd
[B]
AB
kd [AB]
dR dt RU/s
ka M-1s-1
C
M
[R max R]
RU
kd
R
s-1 RU
A has one binding site and reacts with immobilized ligand B has n identical and independent binding sites
Biacore Training
• • •
A 是溶液中的待分析物(analyte)
» A的游离浓度由流动系统控制，在检测中保持恒定
AB 是结合复合物
» AB的浓度可通过直接检测RU得到，表示为R
B 是偶联在传感芯片上的分子
» 总浓度能用 RU表示, 相当于最大结合反应理论值 Rmax » B的游离浓度即 Rmax-R
20
•
在Biacore中，所检测到的反应速率是物质迁移 现象和分子间的相互结合作用的综合结果
» 通过使用合适的反应环境，质量转移导致的影响能够 被最大程度地控制
12
什么是物质迁移? • 扩散的物质迁移
» 单一样品在静态的系统中
Biacore Training
分析物 梯度
•
经过一定的时间，靠近芯片表面的分析物的浓度将 会逐渐降低，并逐渐在溶液中形成一个分析物浓度 梯度
d [AB] dt M/s ka
M-1s-1 [A] M [B] M
B
ka kd
ka kd [A] [AB]
AB
A
[B]
B
d [AB] dt -d [AB] dt
B A
kd
s-1
[AB] M
where k a association rate constant [M-1s-1] k d dissociation rate constant [s-1]
动力学/亲和力分析
基础知识介绍
什么是动力学和亲和力? •
Biacore Training 动力学
» » » » 反应发生的速度? – 与时间相关 结合 – 分子间结合的速度 解离 – 分子复合物解离的速度 动力学分析能够确定在一个给定的时间跨度内，分子复 合物是否能够结合还是完全解离
•
亲和力
» 分子间结合的强度? – 与时间无关 » 亲和力分析能够确定反应处于平衡状态（结合与解离形 成动态平衡）时，复合物的浓度
19
总结
•
Biacore Training
B
亲和力分析
A
•
» 获得亲和力平衡常数 » 适合分析结合和解离速度较快的相互作用过程
动力学分析
» 获得反应速率常数和亲和力平衡常数 » 对分子间相互作用的详细描述 » 具有相同亲和力数据的反应，结合和解离速率常数往往完 全不同 » 对于了解生物学反应过程来说，获得反应速率常数往往比 亲和力分析更为重要
6
平衡常数(Equilibrium constants)
At equilibrium: Association ka M-1s-1 [A] M [B] M Dissociation kd s-1 [AB] M
Biacore Training
The equilibrium constants:
KA
KD
9
Biacore Training
传感图中的变量和表示方式
10
传感图中的信息 • Rmax, Req 和 KD的关系
Biacore Training
11
物质迁移（Mass Transport） •
Biacore Training 在Biacore中，和动力学测量相关的一种现象
» 描述生物分子从溶液向芯片表面转移的过程 » 和生物分子间的相互作用无关
13
分析物的消耗和补充
流动相高度
Biacore Training
1
扩散距离
2 3
1. 分析物由持续流动的样品所补充 2. 随着流速的下降，扩散效应会逐渐占据主导性、 3. 在配体/分析物表面发生的生物分子相互作用
14
减少物质迁移的影响 •
Biacore Training 更低的 Rmax (ligand密度) 高进样流速
•
Biacore Training
监测结合和解离速率
» 亲和力 动力学
• •
监测稳态水平
» 亲和力 动力学
监测溶液中游离的分析物分子
» 亲和力 动力学
5
1:1 动力学模型的速率方程
A
Biacore Training
Association: Dissociation:
Net rate equation:
ka kd kd ka
[AB] [A] [B] [A] [B] [AB]
the equilibrium association constant [M-1] the equilibrium dissociation constant [M]
7
Biacore中的平衡和动力学
A + B ⇔ AB
kd ka
浓度 = 100 nM 浓度 = 1000 nM
所有靶位 点被占据
Response
(M-1s-1)
kon
(s-1)
koff
10-2 10-3 10-4 10-5
30 min 60 min
106 105 104 103
30 min 60 min
时间
时间
4
用Biacore获得动力学和亲和力数据的3种方式
• •
可选的预设分析模式中已考虑了物质迁移效应
15
实验设计
实验设计
稳态实验--分析亲和力
Biacore Training
• • • • • •
通过一系列不同的分析物浓度，确定达到稳态的结合水平 较高的偶联水平 浓度范围至少应该覆盖芯片表面的 20-80% 饱和度(RMAX) 设置对照芯片表面 设置至少一个浓度的样品重复 设置零浓度样品
2
动力学分析和亲和力分析的相关性?
•
Biacore Training
细胞本身就是一个动态系统 – 极少处在平衡状态 同样的亲和力，不同的反应，动力学数据一般并不相 同
» 动力学数据提供了更多的信息
•
3
同样的亲和力，不同的动力学
• •
Biacore Training
所有4个化合物的亲和力数据相同 KD = 10 nM = 10-8 M 结合动力学常数可有不同数量级范围内的改变，本例中为4个 数量级
源自文库17
必须考虑的几个因素
动力学分析
Biacore Training
• • • • • •
试剂纯度 偶联方法 偶联水平 配体活性 样品流速 分析物浓度范围
18
分析物浓度
动力学分析
•
Biacore Training
• •
浓度应该覆盖所有范围的结合曲线（低浓度—饱 和浓度） 设置至少一个浓度的样品重复 设置零浓度样品
我们无需知道复合物和配体的实际浓度！
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Biacore中的速率和亲和力
A
Biacore Training
d [AB] dt ka
B
[A]
ka kd
[B]
AB
kd [AB]
dR dt RU/s
ka M-1s-1
C
M
[R max R]
RU
kd
R
s-1 RU
A has one binding site and reacts with immobilized ligand B has n identical and independent binding sites
Biacore Training
• • •
A 是溶液中的待分析物(analyte)
» A的游离浓度由流动系统控制，在检测中保持恒定
AB 是结合复合物
» AB的浓度可通过直接检测RU得到，表示为R
B 是偶联在传感芯片上的分子
» 总浓度能用 RU表示, 相当于最大结合反应理论值 Rmax » B的游离浓度即 Rmax-R
20
•
在Biacore中，所检测到的反应速率是物质迁移 现象和分子间的相互结合作用的综合结果
» 通过使用合适的反应环境，质量转移导致的影响能够 被最大程度地控制
12
什么是物质迁移? • 扩散的物质迁移
» 单一样品在静态的系统中
Biacore Training
分析物 梯度
•
经过一定的时间，靠近芯片表面的分析物的浓度将 会逐渐降低，并逐渐在溶液中形成一个分析物浓度 梯度
d [AB] dt M/s ka
M-1s-1 [A] M [B] M
B
ka kd
ka kd [A] [AB]
AB
A
[B]
B
d [AB] dt -d [AB] dt
B A
kd
s-1
[AB] M
where k a association rate constant [M-1s-1] k d dissociation rate constant [s-1]
动力学/亲和力分析
基础知识介绍
什么是动力学和亲和力? •
Biacore Training 动力学
» » » » 反应发生的速度? – 与时间相关 结合 – 分子间结合的速度 解离 – 分子复合物解离的速度 动力学分析能够确定在一个给定的时间跨度内，分子复 合物是否能够结合还是完全解离
•
亲和力
» 分子间结合的强度? – 与时间无关 » 亲和力分析能够确定反应处于平衡状态（结合与解离形 成动态平衡）时，复合物的浓度
19
总结
•
Biacore Training
B
亲和力分析
A
•
» 获得亲和力平衡常数 » 适合分析结合和解离速度较快的相互作用过程
动力学分析
» 获得反应速率常数和亲和力平衡常数 » 对分子间相互作用的详细描述 » 具有相同亲和力数据的反应，结合和解离速率常数往往完 全不同 » 对于了解生物学反应过程来说，获得反应速率常数往往比 亲和力分析更为重要
6
平衡常数(Equilibrium constants)
At equilibrium: Association ka M-1s-1 [A] M [B] M Dissociation kd s-1 [AB] M
Biacore Training
The equilibrium constants:
KA
KD
9
Biacore Training
传感图中的变量和表示方式
10
传感图中的信息 • Rmax, Req 和 KD的关系
Biacore Training
11
物质迁移（Mass Transport） •
Biacore Training 在Biacore中，和动力学测量相关的一种现象
» 描述生物分子从溶液向芯片表面转移的过程 » 和生物分子间的相互作用无关
13
分析物的消耗和补充
流动相高度
Biacore Training
1
扩散距离
2 3
1. 分析物由持续流动的样品所补充 2. 随着流速的下降，扩散效应会逐渐占据主导性、 3. 在配体/分析物表面发生的生物分子相互作用
14
减少物质迁移的影响 •
Biacore Training 更低的 Rmax (ligand密度) 高进样流速
•
Biacore Training
监测结合和解离速率
» 亲和力 动力学
• •
监测稳态水平
» 亲和力 动力学
监测溶液中游离的分析物分子
» 亲和力 动力学
5
1:1 动力学模型的速率方程
A
Biacore Training
Association: Dissociation:
Net rate equation:
ka kd kd ka
[AB] [A] [B] [A] [B] [AB]
the equilibrium association constant [M-1] the equilibrium dissociation constant [M]
7
Biacore中的平衡和动力学
A + B ⇔ AB
kd ka
浓度 = 100 nM 浓度 = 1000 nM
所有靶位 点被占据
Response
(M-1s-1)
kon
(s-1)
koff
10-2 10-3 10-4 10-5
30 min 60 min
106 105 104 103
30 min 60 min
时间
时间
4
用Biacore获得动力学和亲和力数据的3种方式