生物技术原理与方法基因工程

八、真核生物转化
根癌农杆菌法 / Ti质粒法转化植物 农杆菌可以侵染植物细胞，其Ti质粒可以整合到植
物细胞的染色体上。
步骤： 将目的基因克隆到Ti质粒上转化到农杆菌中利
生物技术原理与方法
浙江大学生物技术研究所 胡东维
主要ห้องสมุดไป่ตู้课内容
一、概论 二、基因工程 三、细胞工程 四、发酵工程 五、酶工程
(3 学时) (9 学时) (3 学时) (1 学时) (2 学时)
一、基因工程原理与方法
基因克隆的基本原理 基因工程的工具－－酶 基因工程载体 基因文库 转基因技术 转基因策略
一、基因工程原理
• 应用实例
1。利用大麦抗病基因(Mla)提高植物抗病性
Mla 是大麦的叶绿体蛋白，可增强对白粉病菌抗病性。 Mlo 的DNA约3700bp，具有11个内含子。 cDNA是可利用的方式
基 因 工 程 的 基 本 原 理
基因工程的基本原理
二、基因工程工具酶和DNA加工
基因工程的关键技术包括DNA的合成、切割、修饰加 工、连接等。
二、基因工程工具酶和DNA加工
1. DNA切割
1.2 DNase DNase I 无识别的内切酶，可产生大小均一的片段。
1.3 物理方法 利用超声波；振荡、加压等。
二、基因工程工具酶和DNA加工
2. DNA的修饰
Phosphatase 去除DNA末端的5’ P，防止分子间的连接。
Polymerase 补平DNA双链；合成DNA和RNA分子。
插入l噬菌体载体(连接)
转化进入细菌
扩增
载体类型：
lZAP噬菌体 ：23 kb
四、基因文库
3. 基因组文库的筛选 基因组文库培养 DNA探针或 蛋白抗体探针筛选 挑单斑 测序鉴定
五、PCR原理与方法
一般30－40个循环。单分子的理论扩增可达109 。
六、常用载体 的种类与结构
1. 质粒载体 Plasmid
一、基因的结构与表达调控
• 真核生物与原核生物基因的结构
一、基因的结构与表达调控
• 真核生物与原核生物基因的结构
原核生物结构基因的组成 多数以操纵子形式存在，多个基因转录；但往往分别
翻译。 无内含子结构。
一、基因工程原理
• 应用实例
1。利用Bt基因防治棉铃虫
Bt是苏云金杆菌的晶体蛋白，具有高度特异性杀虫活性。 在昆虫消化道内降解成为活化毒性肽，导致昆虫死亡。 该基因无内含子结构；但与真核生物的编码嗜好不同。
二、基因工程工具酶和DNA加工
1. DNA切割
1.1 限制性内切酶 (restriction endonuclease) 类型：即I 、II / III 型酶。真正有用的是II 型酶。 命名：属命＋种名＋菌株＋顺序号 Hind III；EcoRI；BamHI。 至今已发现上千种限制性内切酶，常用的有几十种。 特异性：4－6 碱基的识别位点 HpaII：C’CGG EcoRI：G’AATTC BamHI： G’GATCC Aha III：TTT’AAA
ori： 复制起点 Ampr、Tetr：抗性筛选基因 适宜的克隆位点 适当的拷贝数
六、常用载体的种类与结构
1. 质粒载体 Plasmid
六、 1. 常 用 载 体 的 种 类 与 结 构
质粒载体 Plasmid
六、常用载体的种类与结构
2. 噬菌体载体 phage vector
六、常用载体的种类与结构
四、基因文库
1. 基因组文库的构建： 基因组DNA的提取
基因组DNA的消解(随机) 补平
插入载体(连接)
载体类型：
l噬菌体 ：23 kb 粘粒：37－52 kb BAC(细菌人工染色体)：350 kb YAC(酵母人工染色体)：>1 mb
扩增
四、基因文库
2. cDNA文库的构建： 总mRNA的提取 反转录 cDNA合成
DNA的提取 PCR方法扩增特异性片段 插入载体上 转化细菌 筛选重组子
三、简单的基因克隆策略
mRNA提取 cDNA的合成 PCR扩增特异性片段 转化细菌 筛选重组子
四、基因文库
• 基因组文库：Genomic library 包含所有基因组DNA片
段重组子的总和。多用于基 因结构研究。
• cDNA文库：cDNA library (Expression library) 包含所有cDNA分子的重 组子的总和。多用于基因表 达产物，即基因功能的研究。
DNA在连接之前必须进行加工，把DNA分子切割成所 需的片段。有时为了便于DNA片段之间的连接，还须对片 段末端进行修饰。一般把DNA分子切割、DNA片段末端 修饰和DNA片段连接等所用的酶称为工具酶。
二、基因工程工具酶和DNA加工
基因工程的关键技术包括DNA的合成、切割、修饰加 工、连接等。
DNA在连接之前必须进行加工，把DNA分子切割成所 需的片段。有时为了便于DNA片段之间的连接，还须对片 段末端进行修饰。一般把DNA分子切割、DNA片段末端 修饰和DNA片段连接等所用的酶称为工具酶。
Exonucleases 补平DNA双链
Methylase 保护内切酶位点的降解
二、基因工程工具酶和DNA加工
3. DNA的连接
类型 平端连接与粘端连接。
酶 T4 DNA ligase：平端连接与粘端连接 E. coli DNA ligase：粘端连接
三、简单的基因克隆策略
克隆已知基因或其同源基因片段
七、原核生物的转化
（ transformation）
感受态细胞 (competent cells) 能够接受外源DNA的寄主细胞。 一般利用热激和冷激的方法改变细胞壁和质膜的结构，
使其成为感受态细胞。 典型步骤： 细菌冰培上养冷激离心－收20集保存加备入用C。aCl2溶液悬浮 42℃热激
转化 (transformation) 将外源DNA导入原核细胞内部的方法。 将重组DNA与感受态细胞混合，冷激，即可完成转化。
2. 噬菌体载体 phage vector
六、常用载体的种类与结构
3. 粘粒载体 cosmid （ 重组子37－52kb）
六、常用载体的种类与结构
4. 酵母人工染色体 yeast artificial chromosomse (YAC)
CEN4，4号染色体的着丝粒 TEL，端粒 ARS，自主复制起点 TRP1和URA3，酵母选择标记 SUP4，蓝白斑标记