碱法抽提质粒DNA原理
质粒DNA的提取
质粒DNA的提取一、原理采用碱变性发抽提取质粒DNA。
该法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性预复性的差异而达到分离目的的。
在PH大于12的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中。
而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。
通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
二、方法1.挑取一环在LB固体培养基平板上生长的含PUC57质粒的大肠杆菌，接在含有100μg/ml氨苄青霉素（Amp）的LB液体培养基（5ml/15ml试管）中，37℃震摇培养过夜。
2.将1.5ml菌液加入微离心管中，14000r/min，离心10秒，其取上清液。
反复数次，收集全部菌体。
3.倾去上清，滤纸吸干。
4.加30μlTE缓冲液（10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0）,振荡起菌体。
5.加30μlTENS溶液（10mmol/L Tris—HCl, pH8.0，1mmol/L EDTA,0.1mol/LNaOH,0.5%SDS）,震荡10秒至溶液变粘稠。
6.加150μl 3.0mol/LnaAC,震荡3—5S，14000r/min，离心3分钟，沉淀细胞碎片及染色体DNA。
7.上清液转移至另一微离心管中，甲等体积胞和酚，混匀，12000r/min,离心2分钟。
8.上层水相转移至另一位离心管，加2倍量冷水乙醇，14000r/min，离心20分钟。
9．倾去乙醇，加入7o％冷乙醇淋洗。
10．倾去乙醇，滤纸吸于，真空抽吸2～3分钟。
lI．加人50μlTE缓冲液，溶解DNA。
12，加入1μl核糖核酸酶(10mg／m1)，14000r/min,离心2s，使核糖核酸酶与管底液体混匀。
大肠杆菌质粒DNA的提取(碱法)报告
质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型， 是比病毒更简单的原始生命。 质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到雌性体， 是细菌有性繁殖的性因子. １９５２年由Lederburg正式命名为质粒。
质粒类型：
按复制方式分为两种类型：松弛型质粒和严紧型质粒
1. 松弛型质粒
松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依 赖于宿主提供的半衰期较长的酶。即使蛋白质合成受抑制， 质粒的复制依然进行。当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体 复制的氯霉素等抗生素存在时，质粒的拷贝数可达20003000拷贝。
分钟。
四、操作步骤
6、上清液（700μl左右）移入干净EP管中,加入等体积的 酚：氯仿：异戊醇(25:24:1), 振荡混匀,4℃下12000g离心 5min。 7、将水相（上清）（500μl左右）移入干净EP管中,加入2 倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱中15分钟， 然后4℃下12000g离心10分钟。 8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加 入1ml 70％乙醇洗沉淀一次。 9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥 10分钟或室温干燥。
二实验原理?使蛋白质或脂类等菌体成分变性?基因组dna产生缺刻变成线状并解离成单链变性?由于质粒dna较小仍为环状变性区虽大但不分离利用强碱或加热及表面活性剂sds裂解菌体中和或恢复至室温?变性的质粒dna按原互补配对结构复性?基因组dna随机复性与蛋白质等菌体成分结合在一起离心分离?质粒dna存在于上清中回收?苯酚氯仿异戊醇抽提乙醇沉淀纯化二实验原理碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们的
pH7.8（酸性下DNA分配于有机相，酚的密度大），可使DNA在上清 中。异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫）
质粒dna提取原理
质粒dna提取原理
质粒DNA提取原理是通过破坏细菌细胞壁和细胞膜结构，释
放质粒DNA，并利用化学方法提取纯化质粒DNA。
质粒DNA提取的步骤如下：
1. 细胞裂解：将细菌培养物经过离心，得到菌体沉淀，然后加入裂解缓冲液，破坏细菌细胞壁和细胞膜，释放质粒DNA。
2. 质粒DNA纯化：加入一定量的碱性溶液，使细菌染色体DNA变性沉淀，而质粒DNA仍溶于溶液中。
然后通过离心，将质粒DNA沉淀下来。
3. 质粒DNA沉淀：将溶液中的质粒DNA与乙醇混合，使质
粒DNA沉淀成片状。
通过离心，得到质粒DNA沉淀。
4. 质粒DNA溶解：将质粒DNA沉淀洗涤去除杂质，并用适
当的缓冲液将质粒DNA溶解，得到高浓度的质粒DNA。
质粒DNA提取的关键在于破坏细菌细胞结构，释放质粒DNA，然后利用沉淀和溶解等步骤进行纯化。
通过以上步骤，可以提取到纯化后的质粒DNA，用于后续实验或分析。
实验一 碱法提取质粒DNA
实验一碱法提取质粒DNA一、目的掌握微量移液器、高速离心机等的正确使用掌握碱法提取质粒DNA的原理和方法。
二、原理从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
从大肠杆菌中抽提质粒DNA的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法，碱变性法因其抽提效果好，收得率高，获得的DNA可用于酶切、连接与转化，因而被各实验室广泛采用。
碱变性法抽提质粒DNA的基本原理是根据染色体DNA和质粒DNA分子量的巨大差异而达到分离的。
首先用含一定浓度葡萄糖的缓冲液（溶液Ⅰ）悬浮菌体，再加入溶液II（NaOH、SDS）后，碱性环境下菌体的细胞壁裂解，而使质粒缓慢释放出来，并且碱性条件使DNA的氢键断裂，宿主染色体双螺旋结构解开而变性，而闭合环状的质粒DNA的两条链不会完全分离，当加入溶液III中和后，宿主染色体DNA相对分子质量大，还没来得及复性，就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分子量的RNA等缠绕在一起而沉淀下来，而质粒DNA由于能够迅速配对恢复原来的构型而溶解在上清液中。
然后用酚、氯仿多次抽提进一步纯化质粒DNA 。
氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。
再用两倍体积的无水乙醇洗涤沉淀，以去除残留的氯仿。
最后用75％乙醇溶液洗涤沉淀，以去除残留的盐离子。
最后获得的质粒DNA储存在TE溶液中，-20℃保存。
用于下一步凝胶电泳鉴定。
三、仪器设备、材料与试剂仪器设备恒温培养箱恒温摇床台式离心机高压灭菌锅制冰机电子天平pH计量筒（10 mL，100 mL，500 mL，1 000 mL）烧杯（50 mL，100 mL，500 mL，1 000 mL）一次性手套无粉乳胶手套（光明牌，大、中、小三种号码）玻璃棒称量勺微量移液器（1 000 μL，200 μL，20 μL）酒精灯灭菌的1.5 mL 离心管（eppendorf管）灭菌吸头（1 000 μL，200 μL），相应的吸头盒吸水纸250mL三角瓶材料：含pKS质粒或pUC系列质粒的大肠杆菌。
实验一、质粒DNA的提取及检测实验报告
实验一、质粒DNA的提取及检测【实验目的】1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术3、学会PCR操作的基本技术第一部分质粒DNA的提取一、实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于～这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。
当加入的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
二、仪器与试剂1、仪器恒温摇床、台式离心机2、试剂溶液I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、酚、氯仿三、实验步骤1、将2mL含相应抗生素（Amp:50μg/mL）的LB液体培养基加入到试管中，接入含pUC19质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。
2、取培养物倒入微量离心管中，4000r/min离心2min。
3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。
4、将细菌沉淀悬浮于100μL溶液I中，充分混匀，室温放置10 min。
5、加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上5min。
6、加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。
冰上放置15min。
7、12000r/min，离心15min，将上清转至另一离心管中。
8、向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心5min，将上清转移到另一离心管中。
9、向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min。
12000r/min，离心5min。
碱裂法小规模提取质粒DNA及琼脂糖凝胶电泳
碱裂法小规模提取质粒DNA及琼脂糖凝胶电泳一．实验原理碱裂解抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性和复性的差异而达到分离目的。
在碱性条件下，线性大分子细菌染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构互补链变性解开。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离。
当用pH4.8的NaAc高盐缓冲液调其pH值至中性，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中为可溶状态。
而染色体DNA不能复性，形成缠连的网状结构。
通过离心将细胞碎片，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来被除去，质粒DNA及部分RNA，蛋白质则存在于上清中，再用RNaseA 处理，酚/氯仿抽提和乙醇沉淀而获得质粒DNA。
质粒（plasmid）通常指细菌中独立于染色体外，能自主复制的遗传因子，它能够稳定地遗传某些性状。
天然的质粒都是环状双链DNA，大小从5kb到400kb不等。
质粒虽然独立于染色体外自主复制和遗传，但其复制又依赖于宿主编码的酶和蛋白质复制因子。
质粒按照其稳定拷贝数的多少可分为严谨型和松弛型，严谨型质粒在每个细菌细胞中有1～5拷贝，松弛型质粒在每个细菌细胞中可达10～200个，甚至更多拷贝。
1.质粒的结构：(1)抗性基因（Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene)ori, Origin of replication)； (2)启始复制子（(3)多克隆位点(MSC, Multiple cloning site or polylinker)2.细菌裂解的方法：（1）碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS（2）煮沸裂解法:沸水煮沸40秒（3）SDS裂解法：10%SDS,一般用于质粒大量提取。
SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。
碱裂解法提取质粒DNA的实验原理和操作步骤
碱裂解法提取质粒DNA的实验原理和操作步骤碱裂解法是一种常用的方法，用于提取质粒DNA（plasmid DNA）纯化。
以下是具体的实验原理和操作步骤。
实验原理：碱裂解法利用碱性溶液将细菌细胞的细胞壁和细胞膜溶解，使细菌细胞内的质粒DNA被释放出来。
接着，使用中性化剂中和碱性溶液，使DNA带正电荷，而细胞中的蛋白质则带负电荷，从而能够通过离心将DNA与蛋白质分离。
最后，通过浓缩、洗涤和纯化，得到高质量的质粒DNA。
操作步骤：1.培养细菌：选取含有质粒DNA的细菌菌株，如大肠杆菌。
在含有适当抗生素的培养基中培养细菌菌株。
2.收获细菌：当菌液呈现较稠的浑浊状态时，收取细菌培养物。
使用离心机将菌液离心，分离菌体沉淀和上清液。
将上清液倒掉，保留菌体沉淀。
3.碱裂解：将菌体沉淀溶解于碱性溶液中，如盐酸和十二烷基硫酸钠（SDS）溶液。
轻轻混合并将溶液放入水浴中加热，使细菌细胞壁和细胞膜被溶解。
4.中和：使用中性化剂，如醋酸，使溶液中的酸性物质中和。
这样可以确保DNA带正电荷，而蛋白质和其他污染物则带负电荷。
5.离心：将溶液离心，在离心过程中，DNA会与细胞内其他分子分离，形成一个DNA沉淀。
上清液中含有蛋白质和其他污染物。
6.洗涤：使用洗涤缓冲液，如乙酸盐缓冲液，洗涤DNA沉淀，去除残留的污染物。
7.纯化：用去离子水溶解DNA沉淀，使其溶解在水中。
将溶解的DNA沉淀通过滤纸等过滤装置过滤掉残余杂质。
8.浓缩：通过酒精沉淀法或其他方法，将DNA溶液浓缩到所需的浓度。
9.检测：使用紫外分光光度计等方法，测定提取的质粒DNA的纯度和浓度。
注意事项：1.在实验过程中保持操作环境和仪器无菌。
2.碱裂解法中使用的溶液需准备新鲜，并避免受到污染。
3.操作过程中需要低温处理和离心操作，以保护DNA的完整性。
4.质粒DNA的提取可以根据实验目的进行进一步的扩增、测序或转染等应用。
总结：通过碱裂解法，可以从细菌中提取纯化的质粒DNA。
质粒DNA的提取实验报告
质粒DNA的提取一、实验方法碱裂解法抽提质粒DNA二、实验原理基于质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异。
三、实验步骤1）质粒提取1. 10,000g,1min离心收集1.5－5ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。
2. 加入100μl溶液1，振荡至彻底悬浮。
3. 加入200μl溶液2，立即轻柔颠倒离心管6次，使菌体充分裂解，随后将离心管冰上放置3分钟4. 加入150μl溶液3，立即温和颠倒离心管数次，冰上放置3分钟，10，000g离心10min。
5. 将步骤4的上清转移至新的离心管（尽量去除杂质），加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合均匀10，000g离心5min。
6. 将步骤5的上清转移至新的离心管，加入2倍体积的无水乙醇，室温放置5－10min，沉降DNA7. 10，000g离心10分钟,弃乙醇，保留沉淀，加入1ml 70％的乙醇洗涤沉淀，10，000g离心5分钟8. 倒掉乙醇溶液，用吸水纸吸净管壁上的水珠，室温蒸发痕量乙醇9. 加入适量含RNase的TE或灭菌双蒸水溶解质粒DNA2）质粒鉴定→琼脂糖凝胶电泳灌胶：胶中加入荧光染料(SYBR Green I)加样：质粒+上样缓冲液→混匀电泳结果观察：UV灯下四、实验结果五、实验分析裂解细胞中除含有质粒DNA外，还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂类等物质，因此用碱裂解法除去杂质1、防止DNA裂解：Solution 11）、所含糖增加溶液黏度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切作用降解2）、所含EDTA抑制酶活性2、溶解与变性：Solution21)强碱使质粒DNA和染色体DNA变性2）离子型表面活性剂SDS可溶解膜蛋白3、沉降与复性：Solution31)质粒DNA复性2）在钾盐中，染色体DNA形成缠连的不溶性网状结构，和不稳定的大分子RNA以及变性的蛋白质和细菌碎片等一起沉淀预期结果为剩余质粒DNA4、琼脂糖凝胶电泳1）荧光染色染料分子可嵌入双链DNA分子配对碱基之间2）琼脂糖可起到电泳和分子筛的作用，因所带电荷、分子量大小和构型不同，泳动速度不同六、误差分析实验失败，本组实验出现4条带，3明1暗，明亮处应为DNA分子数最多的，为质粒DNA，质粒DNA前有较暗的两条带，推测其中一条为未复性质粒DNA，可能Solution2处变性过长，不易复性，或Solution3处时间过短，复性不充分。
质粒提取实验报告
1. 学习并掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和操作步骤。
2. 掌握DNA琼脂糖凝胶电泳技术，用于检测提取的质粒DNA。
3. 熟悉实验室安全操作规程，提高实验技能。
二、实验原理质粒是细菌细胞质中独立于染色体之外的小型环状双链DNA分子，具有自主复制能力。
在基因工程中，质粒常作为载体携带外源基因进行扩增和表达。
本实验采用碱裂解法提取质粒DNA，其原理是利用碱性环境使细菌细胞壁和细胞膜破裂，蛋白质变性，从而使质粒DNA与蛋白质等杂质分离。
随后，通过酚-氯仿抽提、乙醇沉淀等步骤纯化质粒DNA。
三、实验材料1. 大肠杆菌菌种（含有质粒）2. LB液体培养基3. 碱裂解液（含SDS、NaOH）4. 酚-氯仿5. 乙醇6. TE缓冲液7. 琼脂糖8. 电泳缓冲液9. DNA分子量标准10. 紫外线灯11. 凝胶电泳仪12. 离心机13. 微量移液器14. 玻璃棒1. 菌液制备：将含有质粒的大肠杆菌接种于LB液体培养基中，37℃培养过夜。
2. 离心：取1.5ml菌液，4000r/min离心5min，弃上清液。
3. 碱裂解：向沉淀中加入100μl碱裂解液，混匀，室温放置5min。
4. 酚-氯仿抽提：取1/3体积的酚-氯仿，加入上述裂解液，混匀，室温放置10min。
5. 离心：4000r/min离心10min，取上清液。
6. 乙醇沉淀：向上清液加入等体积的乙醇，混匀，-20℃放置1h。
7. 离心：8000r/min离心10min，弃上清液。
8. 溶解：用50μl TE缓冲液溶解沉淀，即为提取的质粒DNA。
9. DNA琼脂糖凝胶电泳：取5μl提取的质粒DNA，加入1μl DNA分子量标准，进行琼脂糖凝胶电泳。
10. 观察：打开紫外线灯，观察电泳结果。
五、实验结果1. 琼脂糖凝胶电泳结果显示，提取的质粒DNA在相应位置出现条带，与DNA分子量标准相符。
2. 提取的质粒DNA纯度较高，无杂质。
六、实验讨论1. 碱裂解法提取质粒DNA操作简便，效率较高，是实验室常用的提取方法。
碱裂解法抽提质粒DNA的原理很详细
碱裂解法质粒提取的原理碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA 是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
（简明原理：碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。
碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。
）细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。
下面是该法的提取原理:碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。
溶液I的作用任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH 值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。
那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。
实验一碱变性法抽提质粒DNA
03 实验步骤
准备实验材料
实验器材
离心管、离心机、移液器、磁力搅拌器、恒温水 浴锅等。
试剂
细胞培养基、细胞裂解液、质粒DNA洗涤液、TE 缓冲液等。
质粒DNA标准品
用于定量和验证实验结果。
细胞培养与收集
选择适当的细胞系进 行培养，确保细胞生 长旺盛。
将收集的细胞转移到 离心管中，离心去除 上清液，得到细胞沉 淀。
03
靠的结果。
实验注意事项
01
02
03
04
在操作过程中，要保持低温环 境，以防止DNA降解。
在加入试剂时，要保证试剂的 浓度和纯度，以避免对实验结
果的影响。
在操作过程中，要避免气泡的 产生，以免影响实验结果。
在操作过程中，要注意安全， 避免试剂溅出对皮肤和眼睛的
伤害。
实验总结与思考
01
通过实验，我们成功地使用碱变性法抽提了质粒 DNA，得到了较为纯净的质粒DNA。
质粒DNA的质量评估
总结词质量可靠
详细描述：通过质量评估，质粒DNA的质量可靠，可用于后续的PCR扩增和克隆实验。
05 注意事项与实验总结
实验注意事项
01
实验前确保所有仪器和器具已经消毒，并处于良好的工作状态。
02
在操作过程中，要避免DNA污染，尤其是来自细菌和PCR产物
的污染。
在加入试剂和操作步骤时，要保证准确性和一致性，以获得可
将裂解液转移到一个新的离心管中，加入等体积的酚-氯仿混合液，充分混合后离心， 取上层水相。
将水相转移到一个新的离心管中，加入适量的乙醇和盐溶液，充分混合后离心，去 除上清液。
用洗涤液洗涤沉淀，去除残留的盐离子和酚。
碱裂解法提取质粒-配方,最好的说明
碱裂解法提取质粒一、根本概念1．质粒：质粒是染色体外能够进展自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。
现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。
在基因工程中质粒常被用做基因的载体。
许多细菌除了染色体外，还有大量很小的环状DNA分子，这就是质粒(plasmid)。
质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。
有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进细菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。
目前，已发现有质粒的细菌有几百种，的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA 分子(简称cccDNA)。
细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%～3%。
根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。
每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。
按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒;另一类是松弛型质粒，当染色体复制停顿后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。
一般分子量较大的质粒属严紧型。
分子量较小的质粒属松弛型。
质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，*些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。
在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。
人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。
常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。
pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点。
如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。
质粒DNA的提取和鉴定
五、注意事项——材料准备
➢ 使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增 加）
➢ 培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失
➢ 尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加 大菌体用量
➢ 菌株不要频繁转接（质粒丢失）
五、注意事项——细胞裂解
➢ 菌体量适当。
➢ 培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。
1. 请涂布平板培养后，重新挑 选新菌落进行液体培养
2. 可减少菌体用量或增加溶液 的用量
对
3. 不要频繁转接，每次接种时 应接种单菌落。检查抗生素
策
使用浓度是否正确。
4. 溶液Ⅱ在温度较低时可能出 现浑浊，置于37℃保温片刻 直至溶解为清亮的溶液。
六、质粒DNA提取常见问题
问题二：质粒纯度不高，如何解决？
作用:酸性下质粒DNA复性，变性蛋白－SDS＋线性DNA沉 淀， K＋可中和DNA
三、实验仪器、材料与试剂
▪ 平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） 作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机 相的分离。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有机 相，酚的密度大），可使DNA在上清中。异戊醇 有助于消除抽提过程中出现的泡沫）
（二）材料：含有质粒的大肠杆菌、LB液体培养基 （三）试剂： ▪ 溶液I 50mM 葡萄糖 25mMTris·HCl（pH8.0）10mM EDTA
作用:分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活 ▪ 溶液II 0.2N NaOH 1%SDS（新鲜配制）
作用:细胞壁肽聚糖碱性下水解,核酸和蛋白质变性。 ▪ 溶液III 5M KAC
➢ 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间
➢ 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质 的方法
碱裂解法抽提质粒的原理
碱裂解法抽提质粒的原理SDS碱裂解法制备质粒DNA的原理：细菌悬浮液暴露于高pH的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，相互缠绕成大型复合物，被十二烷基硫酸盐包盖，当用钾离子取代钠离子时，复合物会从溶液中有效沉淀下来，离心去除后，就可从上清液中回收质粒DNA。
1．试剂（1）溶液Ⅰ：Tris-HCL（pH8.0）25mmol/L,EDTA(pH8.0)10mmol/L,葡萄糖50mmol/L,溶菌酶（临用时加）5mg/ml（2）溶液Ⅱ（新鲜配制）：NaOH 0.2mol/L,SDS 1﹪(W/V)（3）溶液Ⅲ（100ml）：5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml(pH4.8),水28.5ml（4）酚-氯仿-异戊醇（25：24：1）（5）无水乙醇和70﹪乙醇（6）无DNA酶的胰RNA酶（7）TE2．实验流程（1）挑取一些独立的转化菌落进行小规模培养，用无菌牙签或挑种环挑取单菌落于20ml 含有相应抗生素的LB液体培养基中，于37℃剧烈震摇下培养过夜。
（2）将1.2ml培养物倒入微量离心管中，于4℃以5000g离心5分钟（两次），将剩余的培养物贮存于4℃。
（3）吸取并弃去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
（4）将细菌沉淀重悬于100μl溶液Ⅰ中，剧烈振荡。
注：溶菌酶促使大肠杆菌细胞变得脆弱而易于裂解。
溶菌酶对反应液的pH有很大的依赖关系，当其低于8.0时，细胞裂解的效果就大为逊色。
因此，溶液Ⅰ不仅使用了Tris-HCL缓冲体系，同时好加入了适量的葡萄糖而有利于pH的调节。
乙二胺四乙酸（EDTA）因其是二价金属离子（如Mg2＋等）的螯合剂，故少量地存在便可抑制核酸酶的活性，从而保护质粒DNA免被降解。
（5）加200μl溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。
确保离心管的整个表面均与溶液Ⅱ接触。
注意不要振荡。
将离心管放置于冰上5分钟。
注：SDS的作用在于使细胞裂解，以释放出质粒及染色体的DNA。
sds碱裂解法制备质粒dna
sds碱裂解法制备质粒dna
SDS碱裂解法是一种常用的质粒DNA提取方法。
该方法利用定量的SDS和NaOH对细菌细胞进行裂解，使DNA迅速释放。
接着，加入适当的中和缓冲液，使DNA回复其天然形态，并去除蛋白质等污染物。
最后，通过酒精沉淀法或硅胶柱层析法纯化DNA。
以下是该方法的具体步骤：
1.生长细菌
生长适量细菌菌株并收获细菌：可以选择不同种类、不同来源、不同
体积得到不同量的细菌。
2.裂解细胞壁
将细菌沉淀后加入缓冲液和SDS混合。
SDS能够破坏细菌的细胞膜，使细胞壁裂解，从而将DNA释放出来。
3.中和
加入NaOH将溶液pH值升高至12，使DNA形状发生改变，变得易于析出。
接着，加入Tris-HCl中和缓冲液降低pH值，恢复DNA天
然形态，并使DNA强度不受影响。
4.去除杂质
通过高速离心将DNA沉淀下来，将上清液与DNA分离。
可以采用氯仿提取法以去除蛋白质和其他杂质，专用的富集试剂和离心柱可做更细致的纯化。
5.精华DNA
通过酒精沉淀法或硅胶柱层析法纯化DNA。
酒精沉淀法适用于大量DNA纯化，但对于大片段、GC富集的DNA适用。
硅胶柱层析法适用于小规模、高质量、片段少的DNA纯化，但成本稍高，操作复杂。
总之，SDS碱裂解法是一种快速，简单的质粒DNA提取方法。
由于其便捷的操作和高质量的DNA回收率，它已被广泛应用于基因工程和分子生物学等领域。
碱裂解法提取质粒原理
碱裂解法提取质粒原理
PCR (聚合酶链反应，polymerase chain reaction) 是一种可以在体外放大特定DNA
片段的技术，也称为扩增（amplification）技术。
PCR法可以有效地检测和扩增DNA片段。
该方法被用来在受检实体中提取、检测、识别和检测DNA多样性。
质粒可以通过PCR线性化来提取，也就是说，可以使用多个特异性引物（特异性对特
定片段的DNA的结合）及特定的片段的DNA作为模板，以获得一条目标片段（目标片段）。
碱裂解特定质粒原理是利用酵素将核酸中几个碱基分解，从而模拟碱基降解，如激酶
能够代表核酸序列几个碱基中的某一碱基。
碱裂解法检测质粒的方法通常用PCR技术来实现，这是因为扩增的方式允许在给定片段的碱基顺序上获得更高的灵敏度和特异性。
碱裂解能够确定质粒的结构，利用一种叫做“碱裂解”的方式，这种方式可以将一段DNA拆分成其他的片段，从而了解其结构，增强检测能力。
碱裂解技术包括酶具（如酶切酶），这些对特定碱基序列特异性，可以用来解析特定质粒，检测出质粒中特定载荷裂解
了的区域片段，以及分析质粒的尺寸。
通过PCR与碱裂解技术，可以高效提取质粒，检测其结构，从而改善生物体的检测以
及疾病的治疗。
此外，碱裂解技术还可以进一步改善基因密码的加密状态，以及鉴定新的
质粒结构。
碱裂解法提取质粒原理
碱裂解法提取质粒原理
碱裂解法是一种常用的提取质粒的方法，其原理主要基于碱性条件下DNA的
特性。
在这种方法中，碱性条件能够使得DNA变性，即双链DNA分子被分解成
两条单链DNA。
这种变性的DNA在碱性条件下会呈现出单链的形态，使得质粒
得以被提取出来。
在进行碱裂解法提取质粒时，首先需要将含有目标质粒的细菌进行培养，使得
细菌大量繁殖并产生大量的质粒。
随后，通过离心等方法将细菌进行分离，得到含有目标质粒的细菌菌体。
接下来，将细菌菌体进行溶解，使得细菌菌体内的细胞壁和膜被破坏，释放出含有质粒的细胞内液。
此时，碱性条件的作用就体现出来了。
通过加入碱性溶液，使得DNA发生变性，双链DNA分子被分解成两条单链DNA。
在这种碱性条件下，质粒的DNA与
细菌染色体的DNA会有不同的解旋速度，从而使得质粒的DNA得以被分离出来。
质粒的DNA呈现出线性形态，方便后续的提取和纯化。
在质粒的DNA被分离出来后，可以通过中性化等方法使得DNA重新回到双
链的形态，从而得以进行后续的分析和应用。
碱裂解法提取质粒的原理简单而有效，被广泛应用于分子生物学领域中。
总的来说，碱裂解法提取质粒的原理是基于碱性条件下DNA的变性特性。
通
过使DNA变性，质粒的DNA得以被分离出来，从而实现了质粒的提取。
这种方
法简单易行，成本低廉，适用于大规模的质粒提取工作。
因此，碱裂解法在分子生物学研究中具有重要的应用价值。
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溶液I，50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸。
让我们先来看看溶液I的作用。
任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。
那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。
所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。
那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
在溶液I中加入高达10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。
如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。
如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。
有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。
轮到溶液II了。
这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。
要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。
很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。
事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。
用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。
如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。
很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。
有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。
这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样），不然基因组DNA也会断裂。
基因组DNA的断裂会带来麻烦，后面我再详细说明。
每个人都知道，溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。
最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。
如果你这样怀疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。
大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。
如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。
既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。
因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。
但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。
这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。
如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。
大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA
也一起被共沉淀了。
这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。
那么2 M的醋酸又是为什么而加的呢？是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。
基因组DNA 一旦发生断裂，只要是50－100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。
所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。
很多人误认为是溶液III加入后基因组DNA 无法快速复性就被沉淀了，这是天大的误会，因为变性的也好复性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。
NaOH本来是为了溶解细胞而用的，DNA分子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。
溶液III加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了PDS沉淀更充分一点。
不要以为PDS沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白质不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA，不然时间一长就会因为混入的DNase而发生降解。
这里用25/24/1的酚/氯仿/异戊醇是有很多道理的，这里做个全面的介绍。
酚（Phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。
至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。
回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA 沉淀出来。
这时候如果放到－20℃，时间一长反而会导致大量盐的沉淀，这点不同于普通的DNA酒精沉淀回收，所以不要过分小心了。
高浓度的盐会水合大量的水分子，因此DNA 分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。
如果感觉发生了盐的沉淀，就用70％的乙醇多洗几次，每次在室温放置一个小时以上，并用tip将沉淀打碎，就能得到好的样品。
得到的质粒样品一般用含RNase（50 ug/ml）的TE缓冲液进行溶解，不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的。
琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下你能看到三条带，但千万不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。
碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA，不信的话你用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样。
其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。
如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA 的片断。
非常偶然的是，有时候抽提到的质粒会有7－10条带，这是由于特殊的DNA序列导致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致。