1碱法提取质粒

原理
பைடு நூலகம்
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1、挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的LB培养 基中，于37℃振荡培养14～18 h。-培养时间不 能太长，否则细菌老化，代谢产物太多。影响 质粒质量。 2、取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心 8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体 尽可能流尽。
3、将细菌沉淀重悬于200μ l预冷的溶液Ⅰ中，剧 烈振荡，使菌体分散混匀。
6、13000g离心10min取上清，加入等体积的苯酚 /氯仿/异戊醇，振荡混匀，4℃离心14000g10min。 -抽提掉剩余蛋白。 7、小心移出上清于一新微量离心管中，加入1倍 体积的异丙醇，混匀，4℃离心12000g，10min。 -可以用两倍体积的无水乙醇，室温放置2-5min 离心。不要沉淀太久。 8、1ml 75%乙醇洗涤沉淀1次，4℃离心，弃上清， 将沉淀在室温下晾干。-不要太干，否则不易溶 解。。 9、沉淀溶于20μ l TE（含RNase A 20μ g/ml）， 37℃水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存备用。 10、琼脂糖电泳检测。
DNA
3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）3M，pH 4.8 中和PH值，并与
SDS作用沉淀
4.苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）苯酚变性抽提蛋白;氯
仿防止苯酚与水互溶。异戊醇的作用是降低表面张力，可以减 少泡沫

5.异丙醇，乙醇（无水乙醇、70%乙醇）沉淀质粒 6.TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。 RNase A：10mg/ml
试剂准备 ：

1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖 平衡渗透压，调节PH值，有利悬
浮。

25mM Tris-HCl(pH 8.0) 调节PH值 10mM EDTA(pH 8.0） 高压灭菌15min ，贮存于4℃鏊和离子 抑制DNase 活性 2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS 裂解细菌，变性线性
实验步骤图解
实验思考题
在本实验中，溶液I，溶液II，溶液III的作用
分别是什么？
实验目的
了解掌握碱法提取质粒的原理和方法。
掌握微量移液器、高速离心机等的正确使用。
提取质粒。
实验原理
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传
因子,大小为1kb-200kb,双链,闭环,以超螺旋 状态存在于宿主细胞中 。 一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤： ①培养细菌，使质粒DNA大量扩增；②收集 和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA。 分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的 方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷 灰石层析法等。
4、加200μ l新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀 （不要剧烈振荡），使细胞膜裂解,DNA变性。放置时间不能太长。因为在碱性条件下基因组 DNA会慢慢断裂 。混匀动作要轻柔,既保证细 菌沉淀在试剂中充分扩散又要避免机械剪切已 变性的质粒DNA和染色体基因组DNA 。
5、加入200μ l预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次 混匀，见白色絮状沉淀，放置5min。-中和溶液， 此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性， 形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。