1碱法提取质粒
试验一碱裂解法抽提质粒DNA
3 质粒DNA的进一步纯化
加入TE使DNA溶液为200ul，加入等体积的酚/氯仿，充 分振荡：会分三层 12000rpm，离心5分钟，吸取上清液 加入等体积的氯仿， 12000rpm，离心5分钟，取上清 加入1/10体积的3MNaAc，加2倍体积的预冷的无水乙醇， 混匀。 置于-70℃冰箱约10min以上或者-20℃冰箱30min至数个 小时
三、材料、试剂及仪器
1 材料： （1）菌种E.coliDH 10B含质粒pSK （2）菌种E.coliDH 10B含质粒pMP3 2 试剂: LB培养基（ 固体和液体）;氨苄青霉素 (Amp,100mg/ml);20﹪SDS;溶液Ⅰ; 溶液Ⅱ （最好现配现用）;溶液Ⅲ（-20℃预冷）; 4N NaOH; 3MNaAc（PH5.2）;无水乙醇; TE缓冲 液（PH8.0）; RNaseA(10mg/ml); 70﹪乙醇;饱 和酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）
2.点样
1xTE或ddH2O:7μL 10ul混合液 10xloading buffer : 1ul 样品:2 ul 混合后点入点样孔中。其中最左边的两个孔点5ulMarker3和 DS2000作为分子量标准。 3.电泳
打开电源开关，调节电压至3-5v/cm即100V，可见溴酚蓝 条带由负极向正极移动，约一小时可观察
12000rpm离心15分钟（4℃），倒掉酒精，离心几秒， 用移液枪尽可能除去酒精 用0.5ml70 %酒精洗DNA沉淀一次，离心2分钟，倒掉酒 精 离心几秒，用移液枪尽可能除去酒精，风干。 加30ulTE溶解DNA沉淀（TE不加RNase）
五、实验注意事项
1 挑菌落应挑单菌落。 可用牙签挑取，也可用tip头挑取。市场上买的 牙签上有防腐剂，应用沸水煮过之后，烘干用 2 细菌培养过程应注意保持细菌的通气性： （1）培养基的体积不能占培养管的体积太多 （2）培养管的体积不用盖太紧 （3）培养管倾斜培养：可增大细菌与氧气接触 面积 （4）转速为200rmp：快一点的转速有利于保持 其的通气性
01碱裂解法抽提大肠杆菌质粒
1、实验目的 ： 学习与掌握碱裂解法抽提大肠பைடு நூலகம்菌质 粒DNA的原理与方法
2、实验原理：
碱裂解法抽提质粒DNA是基于染色体DNA与 质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。
3、实验步骤及各步注意事项
1. 取1.4ml大肠杆菌培养液12000rpm离心 2min，弃上清，收集菌体。 注意点：上清为培养基，必须尽量倾倒 干净，并在吸水纸上吸干，如有较多培 养基残留可能会影响后续实验。
6. 取上清，加等体积（400µ l）的酚/氯仿/ 异戊醇，充分混匀，室温，12000rpm离 心5min。
注意点：酚氯仿有腐蚀性，盖严离心管 盖，避免接触酚氯仿，如接触立即用水 冲洗。
7. 吸上层水相，再加1ml(约2.5倍体积）预 冷的无水乙醇，混匀。 注意点：一定避免吸到中间沉淀及下层 酚氯仿。宁可损失一定上清。
2. 加100µl的溶液 I，使菌体充分悬浮，室 温静置3min。 注意点：必须充分混匀至看不见沉淀， 可用移液器吹打或者用混匀器振荡。
3. 加入200µl溶液II，温和上下颠倒2-3次， 溶液转变为澄清透明。 注意点：不可剧烈振荡。
4. 加入150µl溶液III，上下颠倒混匀数次， 静置2-3min。 注意点：不可剧烈振荡，此时应出现白 色沉淀。 5. 12000 rpm离心5min。
8. 4℃，12000rpm离心10min。
9. 弃上清，加入0.5 ml 70％乙醇，4℃， 12000 rpm离心5 min。
10. 弃上清，沉淀自然干燥10 min后，加 20µ l无菌水溶解。 注意点：弃上清时尽量将酒精倾倒干净， 但注意不要将沉淀弃去。
实验一 碱法提取质粒DNA
实验一碱法提取质粒DNA一、目的掌握微量移液器、高速离心机等的正确使用掌握碱法提取质粒DNA的原理和方法。
二、原理从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
从大肠杆菌中抽提质粒DNA的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法，碱变性法因其抽提效果好，收得率高，获得的DNA可用于酶切、连接与转化，因而被各实验室广泛采用。
碱变性法抽提质粒DNA的基本原理是根据染色体DNA和质粒DNA分子量的巨大差异而达到分离的。
首先用含一定浓度葡萄糖的缓冲液（溶液Ⅰ）悬浮菌体，再加入溶液II（NaOH、SDS）后，碱性环境下菌体的细胞壁裂解，而使质粒缓慢释放出来，并且碱性条件使DNA的氢键断裂，宿主染色体双螺旋结构解开而变性，而闭合环状的质粒DNA的两条链不会完全分离，当加入溶液III中和后，宿主染色体DNA相对分子质量大，还没来得及复性，就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分子量的RNA等缠绕在一起而沉淀下来，而质粒DNA由于能够迅速配对恢复原来的构型而溶解在上清液中。
然后用酚、氯仿多次抽提进一步纯化质粒DNA 。
氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。
再用两倍体积的无水乙醇洗涤沉淀，以去除残留的氯仿。
最后用75％乙醇溶液洗涤沉淀，以去除残留的盐离子。
最后获得的质粒DNA储存在TE溶液中，-20℃保存。
用于下一步凝胶电泳鉴定。
三、仪器设备、材料与试剂仪器设备恒温培养箱恒温摇床台式离心机高压灭菌锅制冰机电子天平pH计量筒（10 mL，100 mL，500 mL，1 000 mL）烧杯（50 mL，100 mL，500 mL，1 000 mL）一次性手套无粉乳胶手套（光明牌，大、中、小三种号码）玻璃棒称量勺微量移液器（1 000 μL，200 μL，20 μL）酒精灯灭菌的1.5 mL 离心管（eppendorf管）灭菌吸头（1 000 μL，200 μL），相应的吸头盒吸水纸250mL三角瓶材料：含pKS质粒或pUC系列质粒的大肠杆菌。
碱裂解法提取质粒DNA的实验原理和操作步骤
碱裂解法提取质粒DNA的实验原理和操作步骤碱裂解法是一种常用的方法，用于提取质粒DNA（plasmid DNA）纯化。
以下是具体的实验原理和操作步骤。
实验原理：碱裂解法利用碱性溶液将细菌细胞的细胞壁和细胞膜溶解，使细菌细胞内的质粒DNA被释放出来。
接着，使用中性化剂中和碱性溶液，使DNA带正电荷，而细胞中的蛋白质则带负电荷，从而能够通过离心将DNA与蛋白质分离。
最后，通过浓缩、洗涤和纯化，得到高质量的质粒DNA。
操作步骤：1.培养细菌：选取含有质粒DNA的细菌菌株，如大肠杆菌。
在含有适当抗生素的培养基中培养细菌菌株。
2.收获细菌：当菌液呈现较稠的浑浊状态时，收取细菌培养物。
使用离心机将菌液离心，分离菌体沉淀和上清液。
将上清液倒掉，保留菌体沉淀。
3.碱裂解：将菌体沉淀溶解于碱性溶液中，如盐酸和十二烷基硫酸钠（SDS）溶液。
轻轻混合并将溶液放入水浴中加热，使细菌细胞壁和细胞膜被溶解。
4.中和：使用中性化剂，如醋酸，使溶液中的酸性物质中和。
这样可以确保DNA带正电荷，而蛋白质和其他污染物则带负电荷。
5.离心：将溶液离心，在离心过程中，DNA会与细胞内其他分子分离，形成一个DNA沉淀。
上清液中含有蛋白质和其他污染物。
6.洗涤：使用洗涤缓冲液，如乙酸盐缓冲液，洗涤DNA沉淀，去除残留的污染物。
7.纯化：用去离子水溶解DNA沉淀，使其溶解在水中。
将溶解的DNA沉淀通过滤纸等过滤装置过滤掉残余杂质。
8.浓缩：通过酒精沉淀法或其他方法，将DNA溶液浓缩到所需的浓度。
9.检测：使用紫外分光光度计等方法，测定提取的质粒DNA的纯度和浓度。
注意事项：1.在实验过程中保持操作环境和仪器无菌。
2.碱裂解法中使用的溶液需准备新鲜，并避免受到污染。
3.操作过程中需要低温处理和离心操作，以保护DNA的完整性。
4.质粒DNA的提取可以根据实验目的进行进一步的扩增、测序或转染等应用。
总结：通过碱裂解法，可以从细菌中提取纯化的质粒DNA。
质粒提取原理及碱法
质粒提取原理及碱法质粒提取原理质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。
作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。
在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。
从宿主细胞中提取质粒DNA，是DNA重组技术中最基础的实验技能。
分离质粒DNA 有三个步骤：培养细菌使质粒扩增，收集和裂解细菌，分离和纯化质粒DNA。
在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。
所以，多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状DNA（cccDNA）：质粒的两条链没有断裂；超螺旋开环DNA（ocDNA）：质粒的一条链断裂；松弛的环状分子线形DNA（lDNA）：质粒的两条链均断裂；线性分子质粒DNA的分子构型。
质粒DNA琼脂塘凝胶电泳模式图可分为：松弛线性的DNA；松弛开环的OC构型；超螺旋的SC构型。
由于琼脂糖中加有嵌入型染料溴化乙锭，因此，在紫外线照射下DNA电泳带成橘黄色。
道中的SC DNA走在最前沿，OC DNA则位于凝胶的最后边；道中的L DNA 是经核酸内切限制酶切割质粒之后产生的，它在凝胶中的位置介于OC DNA 和 SC DNA 之间。
质粒小量提取之碱裂解法试验原理：碱裂解法是较常用的提取的方法。
其优点是收获率高，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。
十二烷基磺进行质粒的小量制备。
十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。
用SDS 处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒DNA和染色体DNA，两种DNA在强碱环境都会变性。
由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不分开；但后者完全变性分甚至出现断裂，因此，当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH 值，使溶液pH值恢复较低的近中性水平时，质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构，但是主染色体DNA则难以复性。
实验一-碱裂解法提取质粒DNA
实验一-碱裂解法提取质粒DNA
碱裂解法是一种常用的质粒DNA提取方法。
下面是进行碱裂
解法提取质粒DNA的实验步骤：
1. 培养细胞：选择所需的质粒含有目标基因的细菌，如大肠杆菌等，并在适当的培养基中培养细菌，使其达到对数生长期。
2. 收集细菌：将培养好的细菌菌液转移到离心管中，并进行离心，以沉淀细菌。
3. 溶解细菌：加入一定浓度的碱液（例如0.2N NaOH）使细
菌溶解。
通常使用细菌菌液总量的1/5体积的碱液，并轻轻摇
晃混合。
4. 添加中和液：将等体积的中和液（例如3M乙酸酸化乙酸钠
溶液）加入到溶解好的细菌溶液中，并迅速而轻轻地混合。
5. 离心：将混合液进行离心，以除去沉淀的细菌残渣和碱液。
6. 提取DNA：将上一步离心得到的上清液转移至新的离心管中，加入等体积的冷乙醇，并轻轻摇晃，使DNA沉淀。
7. 沉淀DNA：进行高速离心，使DNA沉淀。
8. 弃去上清液：弃去上清液，保留沉淀的DNA。
9. 洗涤DNA：使用70%乙醇洗涤沉淀的DNA，以去除残留的盐类和碱液。
10. 干燥DNA：使用洗涤干净的乙醇或空气干燥DNA沉淀。
11. 溶解DNA：用适当的缓冲液（如TE缓冲液）溶解DNA。
12. 储存DNA：将溶解好的DNA储存于适当的温度和条件下，用于后续实验。
实验一碱裂解法提取质粒DNA
实验一-碱裂解法提取质粒DNA 碱裂解法是一种常用的提取质粒DNA的方法。
质粒是一种裸露的、结构简单的小型环状DNA，它们存在于许多细菌细胞中，可以自主复制和表达。
质粒通常用于克隆和转化实验，是分子生物学实验中常用的工具之一。
一、实验目的通过碱裂解法提取质粒DNA，进一步了解质粒的基本性质和提取过程，为后续的分子生物学实验打下基础。
二、实验原理碱裂解法是一种利用细菌细胞壁和质粒DNA在不同pH值下稳定性的差异，将细胞壁和质粒DNA分离的方法。
在pH值高于7.5的环境下，细菌细胞壁的稳定性降低，而质粒DNA的稳定性相对较高。
通过加入碱液（如NaOH）并加热，可以破坏细菌细胞壁，使细胞内容物释放出来。
在pH值低于7.5的环境下，质粒DNA的稳定性降低，而细菌染色体DNA的稳定性相对较高。
通过加入高浓度的醋酸钾溶液并冰浴，可以沉淀出染色体DNA，而质粒DNA则留在上清液中。
三、实验步骤1.准备所需试剂和器材，包括细菌培养液、NaOH、KAc、冰浴、离心管、移液器等。
2.将细菌培养液倒入离心管中，用移液器加入适量NaOH，搅拌均匀。
3.将离心管放入沸水浴中加热5分钟，使细菌细胞壁破裂，释放出细胞内容物。
4.用移液器加入适量KAc，搅拌均匀，使pH值降低至7.5以下。
5.将离心管放入冰浴中冷却10分钟，使染色体DNA沉淀出来。
6.用离心机将上清液和沉淀物分开，收集上清液。
7.在收集的上清液中加入适量的乙醇，放在-20℃冰箱中冷冻1小时，使质粒DNA沉淀出来。
8.用离心机将沉淀物和上清液分开，收集沉淀物。
9.用适量的TE缓冲液溶解沉淀物，得到质粒DNA溶液。
10.用紫外分光光度计测定质粒DNA溶液的浓度和质量。
四、实验结果与数据分析1.实验结果：通过紫外分光光度计测定，得到质粒DNA溶液的浓度和质量。
通常，提取到的质粒DNA溶液需要有一定的浓度和质量才能进行后续的分子生物学实验。
2.数据分析：根据实验数据可以分析出提取到的质粒DNA溶液的质量和浓度是否符合要求。
实验一碱变性法抽提质粒DNA
03 实验步骤
准备实验材料
实验器材
离心管、离心机、移液器、磁力搅拌器、恒温水 浴锅等。
试剂
细胞培养基、细胞裂解液、质粒DNA洗涤液、TE 缓冲液等。
质粒DNA标准品
用于定量和验证实验结果。
细胞培养与收集
选择适当的细胞系进 行培养，确保细胞生 长旺盛。
将收集的细胞转移到 离心管中，离心去除 上清液，得到细胞沉 淀。
03
靠的结果。
实验注意事项
01
02
03
04
在操作过程中，要保持低温环 境，以防止DNA降解。
在加入试剂时，要保证试剂的 浓度和纯度，以避免对实验结
果的影响。
在操作过程中，要避免气泡的 产生，以免影响实验结果。
在操作过程中，要注意安全， 避免试剂溅出对皮肤和眼睛的
伤害。
实验总结与思考
01
通过实验，我们成功地使用碱变性法抽提了质粒 DNA，得到了较为纯净的质粒DNA。
质粒DNA的质量评估
总结词质量可靠
详细描述：通过质量评估，质粒DNA的质量可靠，可用于后续的PCR扩增和克隆实验。
05 注意事项与实验总结
实验注意事项
01
实验前确保所有仪器和器具已经消毒，并处于良好的工作状态。
02
在操作过程中，要避免DNA污染，尤其是来自细菌和PCR产物
的污染。
在加入试剂和操作步骤时，要保证准确性和一致性，以获得可
将裂解液转移到一个新的离心管中，加入等体积的酚-氯仿混合液，充分混合后离心， 取上层水相。
将水相转移到一个新的离心管中，加入适量的乙醇和盐溶液，充分混合后离心，去 除上清液。
用洗涤液洗涤沉淀，去除残留的盐离子和酚。
碱裂解法提取质粒-配方,操作说明
碱裂解法提取质粒一、基本概念1．质粒：质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。
现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。
在基因工程中质粒常被用做基因的载体。
许多细菌除了染色体外，还有大量很小的环状DNA分子，这就是质粒(plasmid)。
质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。
有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进细菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。
目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。
细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%～3%。
根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。
每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。
按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒;另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。
一般分子量较大的质粒属严紧型。
分子量较小的质粒属松弛型。
质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。
在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。
人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。
常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。
pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点。
如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。
碱抽提法提取质粒
EDTA：大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达10 mM的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。
用新鲜的0.4 N的NaOH和2%的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为 SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样），不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦，后面我再详细说明。
回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来。这时候如果放到-20℃，时间一长反而会导致大量盐的沉淀，这点不同于普通的DNA酒精沉淀回收，所以不要过分小心了。高浓度的盐会水合大量的水分子，因此DNA分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。如果感觉发生了盐的沉淀，就用70%的乙醇多洗几次，每次在室温放置一个小时以上，并用tip将沉淀打碎，就能得到好的样品。得到的质粒样品一般用含 RNase（50 ug/ml）的TE缓冲液进行溶解，不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的。琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下你能看到三条带，但千万不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA，不信的话你用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样。其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。
01 质粒的提取.
实验仪器、材料、试剂
（一） 仪器 1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 高速台式离心机
5. 微量取液器
（二）材料
含重组质粒的大肠杆菌 DH 5α菌液。
（三）试剂 1. SolutionⅠ 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris.· Cl (pH 8.0) 10 mmol/L EDTA (pH 8.0)
4. 加400μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-10 次，室温放置5分钟。室温13,000 rpm离心10 分钟，小心取上清。 5. 将吸附柱安置于收集管上，加入500μl溶液 P4，室温13,000 rpm离心1分钟，弃滤液；将 上一步所得上清液加入吸附柱AC中（吸附柱 放入收集管中），13,000 rpm离心1分钟，弃 滤液。
如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏 低。
3．加250μl的溶液P2，温和地上下翻转6－10 次使菌体充分裂解，直到溶液变得清亮。
温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！ 所用时不应超过5分钟！以免质粒受到破坏。 此时菌液应变 得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步。
取出吸附柱ac放入一个干净的离心管中在放入一个干净的离心管中在吸附膜的中间部位加2025l洗脱缓冲液洗脱缓冲液eb洗脱缓冲液事先在6570水浴中加热效果更好室温放置水浴中加热效果更好室温放置11分钟13000rpm离心11分钟洗脱dna可立即用或或保于下游分子生物学实验或20
实验一 质粒ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ提取（碱法）
载体结构的三大要素： • • • 多克隆位点 选择标记（耐药性，LacZ） 独立的复制起点
手工碱裂解法抽提质粒试剂溶液I
质粒的复制型
质粒在细胞内的复制一般有两种类型: – 严谨型(Stringent control) ：只在细胞 周期的一定阶段进行复制，当细胞染 色体复制一次时，质粒也复制一次， 每个细胞内只有1～2个质粒 – 松弛型(Relaxed control) ：质粒在整 个细胞周期中随时可以复制，当染色 体复制停止后，质粒仍然能继续复制， 每个细胞中含有10-200个拷贝。
2. 柱平衡：向吸附柱中加入500ul的平衡液BL，将吸附柱置于收集管上 ↓ 10000 rpm，1min
倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于收集管上
3. 收集菌体： 取1.4ml菌液转入小离心管中
↓ 10000 rpm，1min
弃上清。将离心管倒置于纸巾上，以尽量去除上清。
4.悬浮： 加250ul溶液P1于细菌沉淀中，涡旋震荡（或用加样枪吹打），彻底 悬浮细菌沉淀。（注：一定要彻底悬浮，否则抽提质粒DNA的纯度及得率会 大大降低）。 ↓ 5. 裂解：加250ul溶液P2，立即轻柔颠倒离心管6-8次, （此时菌液应变得清亮粘
漂洗液PW
洗脱缓冲液EB 离心吸附柱 废液收集管 RNaseA （10mg/ml）
[实验准备]
1. 使用本试剂盒之前，先在溶液P1中加入RNaseA。溶液 P1使用完毕后，请立即至于4℃保存。 2. 漂洗液PW在第一次使用前需加入无水乙醇，15ml的漂
洗液中需加入60ml的无水乙醇，混匀后方可使用。
手工碱裂解法抽提质粒
试剂： 溶液I ：50mM 葡萄糖， 25mMTris· HCl （pH8.0），10mM EDTA 作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活 溶液II： 0.2N NaOH， 1%SDS（新鲜配制） 作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质 变性。 溶液III： 5M KAC 作用：酸性条件下质粒DNA复性，变性蛋白－ SDS＋线性DNA沉淀， K＋可中和DNA
实验一碱变性法抽提质粒
分离质粒DNA的方法
1. 碱变性法；
2. 煮沸法；
3. SDS法；
4. 羟基磷灰石层析法等
一、实验目的
通过本实验掌握碱变性法提取质粒DNA。
二、实验原理
质粒DNA
分子量小 超螺旋
细菌染色体DNA
分子量大 线性双螺旋
• 在pH 12-12.5时，线性DNA被彻底变性，但共价闭环质 粒DNA虽然氢键也发生断裂，但两条互补链仍会紧密缠 绕结合在一起。 • 当在溶液体系中加入pH4.8的NaAC时，溶液恢复中性， 质粒DNA迅速复性，染色体DNA不能恢复，形成网状结构， 通过离心可以把变性的染色体DNA和蛋白-SDS复合物沉 淀分离出来。
重组dna技术的基本过程上午下午碱变性抽提质粒dna核酸浓度和纯度分析核酸电泳及分子量测定质粒dna的酶切感受态细胞的制备质粒dna的酶切产物电泳试剂盒回收dna目的基因与载体的连接重组子筛选鉴定方法蓝白斑筛选真核基因组dna抽提1连接子的转化真核基因组dna抽提2菌落的pcr鉴定pcr产物的电泳dnaplasmid质粒plasmid是一种染色体外的稳定遗传因子为双链闭环的dna分子并以超螺旋状态存在于宿主的细胞质中
重组子筛选、鉴定方法 蓝白斑筛选 真核基因组DNA抽提1 菌落的PCR鉴定 PCR产物的电泳
试剂盒回收DNA 目的基因与载体的连接
连接子的转化 真核基因组DNA抽提2
实验一 碱变性法抽提质粒DNA
质 粒（plasmid）
• 质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子, 为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于 宿主的细胞质中。 • 质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它 具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒 定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。
质粒的提取与纯化
溶液应该出现絮状物，但不会出现局部沉淀。
6. 于13,000rpm离心10 分钟。
如离心机转速不够可延长离心时间，直至形成紧密的白 色沉淀。
7. 将步骤6 离心后得到的上清液转移到Spin column 内。 于6,000rpm离心1 分钟，并弃去接液管内液体。
11. 向Spin column 内加20μl Elution Buffer、去离子水 或TE 溶液，并于室2. 于12，000rpm离心1 分钟，1.5ml 离心管内溶液中
含有质粒DNA。
13. 提取的质粒DNA 可直接用于各类下游分子生物学实 验，如果不立即使用，请保存于-20℃。
• 用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒 DNA。
实验仪器、材料与试剂
（一） 仪器 1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 高速台式离心机 5. 微量取液器
（二） 材料
含pBC KS质粒的大肠杆菌 DH 5α。 含重组质粒的大肠杆菌 DH 5α。
（三） 试剂
8. 向Spin column 内加650μl Wash Buffer，于12， 000g 离心30～60 秒，并弃去接液管内液体。
9. 重复第8 步一次。
10. 再次于12，000rpm 离心1 分钟，然后将Spin column 转移到无菌的1.5ml 离心管中。如不进行该步 离心，则无法保证离心柱内残液被彻底清除。
（pH 4.8）。 • 5. 氨苄青霉素（Amp）
用无菌水配制成100 mg/ml 溶液，置-20℃冰 箱保存备用。
6. 胰RNA酶
将胰RNA酶（RNA 酶 A）溶于10 mmol/L Tris.Cl (pH 7.5)、15 mmol/L NaCl中， 配成10 mg/ml的浓度，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至 室温，分装成小份保存于-20℃。
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6、13000g离心10min取上清，加入等体积的苯酚 /氯仿/异戊醇，振荡混匀，4℃离心14000g10min。 -抽提掉剩余蛋白。 7、小心移出上清于一新微量离心管中，加入1倍 体积的异丙醇，混匀，4℃离心12000g，10min。 -可以用两倍体积的无水乙醇，室温放置2-5min 离心。不要沉淀太久。 8、1ml 75%乙醇洗涤沉淀1次，4℃离心，弃上清， 将沉淀在室温下晾干。-不要太干，否则不易溶 解。。 9、沉淀溶于20μ l TE（含RNase A 20μ g/ml）， 37℃水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存备用。 10、琼脂糖电泳检测。
原理
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1、挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的LB培养 基中，于37℃振荡培养14～18 h。-培养时间不 能太长，否则细菌老化，代谢产物太多。影响 质粒质量。 2、取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心 8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体 尽可能流尽。
3、将细菌沉淀重悬于200μ l预冷的溶液Ⅰ中，剧 烈振荡，使菌体分散混匀。
4、加200μ l新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀 （不要剧烈振荡），使细胞膜裂解,DNA变性。放置时间不能太长。因为在碱性条件下基因组 DNA会慢慢断裂 。混匀动作要轻柔,既保证细 菌沉淀在试剂中充分扩散又要避免机械剪切已 变性的质粒DNA和染色体基因组DNA 。
5、加入200μ l预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次 混匀，见白色絮状沉淀，放置5min。-中和溶液， 此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性， 形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。
实验目的
了解掌握碱法提取质粒的原理和方法。
掌握微量移液器、高速离心机等的正确使用。
染色体外的稳定遗传
因子,大小为1kb-200kb,双链,闭环,以超螺旋 状态存在于宿主细胞中 。 一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤： ①培养细菌，使质粒DNA大量扩增；②收集 和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA。 分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的 方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷 灰石层析法等。
实验步骤图解
实验思考题
在本实验中，溶液I，溶液II，溶液III的作用
分别是什么？
试剂准备 ：
1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖 平衡渗透压，调节PH值，有利悬
浮。
25mM Tris-HCl(pH 8.0) 调节PH值 10mM EDTA(pH 8.0） 高压灭菌15min ，贮存于4℃鏊和离子 抑制DNase 活性 2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS 裂解细菌，变性线性
DNA
3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）3M，pH 4.8 中和PH值，并与
SDS作用沉淀
4.苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）苯酚变性抽提蛋白;氯
仿防止苯酚与水互溶。异戊醇的作用是降低表面张力，可以减 少泡沫
5.异丙醇，乙醇（无水乙醇、70%乙醇）沉淀质粒 6.TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。 RNase A：10mg/ml