碱裂解法提取质粒-配方,操作说明
碱裂解法提取质粒
碱裂解法质粒提取的原理碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。
下面是该法的提取原理:碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I，50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸。
溶液I的作用任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl 溶液，是再自然不过的了。
那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。
所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。
那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
在溶液I中加入高达10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。
如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。
如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。
有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。
溶液II的作用这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。
要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。
其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。
事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。
碱裂解法提取质粒原理和注意事项
碱裂解法提取质粒原理和注意事项碱裂解法是一种用于提取质粒的常用方法，通过在碱性条件下使细菌细胞裂解，进而释放出质粒。
碱裂解法的原理是利用质粒与细菌细胞核酸的不同碱溶解性，使质粒保留在溶液中，而细菌细胞核酸被沉淀下来。
本文将详细介绍碱裂解法的原理和注意事项。
碱裂解法的原理：1.细菌细胞的预处理：首先，将含有质粒的细菌菌落接种到LB(琼脂)培养基中，经过适当时长的培养，使细菌菌落扩大到较大体积。
2.收获细菌细胞：将培养基中的细菌细胞收获下来，一般通过离心方法将菌液沉淀。
3.细菌细胞裂解：将细菌细胞沉淀后，将其重悬到高浓度的碱溶液中，使细菌细胞在碱性条件下裂解。
4.分离核酸：碱条件下，质粒DNA和线粒体DNA往往会溶于溶液中，而细菌细胞的染色体DNA不溶于溶液中，并随着碱度增加逐渐沉淀。
通过快速离心，将细菌细胞染色体DNA沉淀，而质粒DNA留在上清液中。
5.提取质粒：将上清液取出，通过乙醇沉淀方法使质粒DNA沉淀下来，通过离心收获质粒，即可得到纯化后的质粒DNA。
注意事项：1.使用无菌操作：为保证实验的准确性和重复性，实验过程中必须严格遵守无菌操作的要求。
例如，使用无菌器皿和无菌操作工具，避免细菌污染。
2.注意细菌菌落的培养条件和时长：细菌菌落的培养条件和时长会对实验结果产生影响。
培养条件应符合细菌所需的培养基成分和培养温度，时长应确保细菌菌落予以充足的生长和扩大。
3.使用高浓度的碱溶液：为充分裂解细菌细胞，需要使用高浓度的碱溶液，通常为pH12的溶液。
4.快速离心：由于细菌细胞裂解后的溶液中可能含有许多细菌细胞碎片和核酸碎片，为避免这些碎片沉淀到上清液中，需要进行快速离心，在最短时间内将质粒DNA沉淀下来。
5.质粒的纯化：通过乙醇沉淀方法提取质粒时，需要仔细控制乙醇的用量和沉淀时间，以避免损失待提取的质粒DNA。
总结：碱裂解法是提取质粒DNA的常用方法之一，其原理是利用质粒DNA与细菌细胞染色体DNA在碱性条件下的不同溶解性，通过沉淀法分离出质粒DNA。
碱裂解法大量提取质粒DNA
碱裂解法大量提取质粒DNA（同时纯化）准备工作：细菌培养：小量提取质粒DNA鉴定正确后，将菌液以1/50~1/20体积的比例接种到250ml 液体培养基中，37℃振荡培养过夜至对数生长晚期。
注：培养体积与最终质粒DNA的收获量并无线性关系。
只要培养条件适宜，50ml的培养液有时也可得到总量高达1m g以上的质粒。
操作步骤：1、细菌的收获：将菌液倒入合适的离心管中，8000g离心5分钟，弃上清，并在吸水纸上倒置离心管使上清全部流尽。
2、将细菌沉淀重悬于10ml溶液Ｉ中。
溶液Ｉ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris•Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)注：（1）若溶液Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ配制时间过久，可加入少量溶菌酶；（2）由于沉淀的影响，悬液的体积会达到11~13ml。
3、加15ml溶液Ⅱ，颠倒混匀。
溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH，1%SDS4、加12ml溶液Ⅲ，轻微振荡混匀。
溶液Ⅲ：5mol/Ｌ乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml5、12000g离心5分种，弃沉淀。
将上清转移到另一离心管中。
6、加入60%体积的异丙醇，颠倒混匀后，室温静置5分钟。
12000g离心５分钟，弃上清。
7、沉淀溶解于4~6ml TE中，加入1/50体积RNase A贮存液，颠倒混匀，37℃静置10分钟。
8、加入1/2体积的Tris饱和酚、1/2体积的氯仿-异戊醇(24:1)混合液，剧烈振荡混匀。
9、4℃12000g离心30秒，将上层液体与少量下层液体转移到另一离心管后，再12000g离心5分种，小心吸取上层液体。
10、加入等体积13％聚乙二醇(PEG8000)-1.6mol/L NaCl混合液，颠倒混匀，冰上静置0.5~2小时。
11、4℃12000g离心10分种，弃上清，DNA沉淀用70%乙醇洗涤。
12、沉淀干燥后，溶解于适量高压灭菌的水中。
注：（1）溶解体积一般为0.2~1ml；（2）此时得到的是已经纯化的质粒DNA，可直接进行各种酶学操作。
碱裂解法提取质粒
碱裂解法抽提质粒原理碱裂解法从大肠杆菌制备质粒是分子生物学研究的常规技术，以下碱裂解法制备质粒的原理。
碱法质粒抽提用到三种溶液，溶液I：50 mM葡萄糖、25 mM Tris-Cl 、10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II：0.2 N NaOH、1% SDS；溶液III ：3 M 醋酸钾、2 M 醋酸。
1、溶液I的作用对于任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此选用适当浓度和适当pH值的Tris-Cl溶液。
加入的葡萄糖可以使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子底部。
EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，可以抑制DNase的活性和微生物生长。
此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率。
2、溶液II的作用NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱后几乎在瞬间就会溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer （双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。
SDS也呈碱性，但如果只用SDS，达不到彻底溶解细胞的作用，加入SDS主要为下一步做铺垫。
这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。
3、溶液III的作用SDS在高盐浓度下发生沉淀，同时SDS能与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，所以沉淀也将溶液中的大部分蛋白质沉淀下来。
溶液中的K+置换了SDS中的Na+而形成了不溶性的PDS，高浓度的盐使沉淀更完全。
同时，由于基因组DNA很长，容易被PDS共沉淀。
2 M的醋酸可以中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA。
基因组DNA一旦发生断裂，小于100 kb的片断，就不容易与PDS共沉淀。
所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，否则最后得到的质粒上会有大量的基因组DNA污染。
这一步操作混合均匀后在冰上放置，可以使PDS沉淀更充分。
碱裂解法提取质粒DNA
葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA 抑制DNase的活性
这一步溶液中还可以加入RNase，不受EDTA影响，并且可以在后续步骤中被除去
溶液Ⅱ 0.2M NaOH / 1% SDS
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破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。
加入溶液Ⅱ之后必须温柔混合，不然基因组DNA会物理断裂；
停留的时间不能过长，因为强碱性条件下基因组DNA会慢慢化学断裂
溶液Ⅲ 3M 醋酸钾 / 2M 醋酸
这一步的K置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na，得到PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；
SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀
自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时基因组DNA也被PDDNA时，多数情况下能看到三条带，按电泳速度由快到慢排序，
分别是 超螺旋带、开环带 和 复制中间体带（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。
碱裂解法提取质粒DNA的实验原理和操作步骤
碱裂解法提取质粒DNA的实验原理和操作步骤碱裂解法是一种常用的方法，用于提取质粒DNA（plasmid DNA）纯化。
以下是具体的实验原理和操作步骤。
实验原理：碱裂解法利用碱性溶液将细菌细胞的细胞壁和细胞膜溶解，使细菌细胞内的质粒DNA被释放出来。
接着，使用中性化剂中和碱性溶液，使DNA带正电荷，而细胞中的蛋白质则带负电荷，从而能够通过离心将DNA与蛋白质分离。
最后，通过浓缩、洗涤和纯化，得到高质量的质粒DNA。
操作步骤：1.培养细菌：选取含有质粒DNA的细菌菌株，如大肠杆菌。
在含有适当抗生素的培养基中培养细菌菌株。
2.收获细菌：当菌液呈现较稠的浑浊状态时，收取细菌培养物。
使用离心机将菌液离心，分离菌体沉淀和上清液。
将上清液倒掉，保留菌体沉淀。
3.碱裂解：将菌体沉淀溶解于碱性溶液中，如盐酸和十二烷基硫酸钠（SDS）溶液。
轻轻混合并将溶液放入水浴中加热，使细菌细胞壁和细胞膜被溶解。
4.中和：使用中性化剂，如醋酸，使溶液中的酸性物质中和。
这样可以确保DNA带正电荷，而蛋白质和其他污染物则带负电荷。
5.离心：将溶液离心，在离心过程中，DNA会与细胞内其他分子分离，形成一个DNA沉淀。
上清液中含有蛋白质和其他污染物。
6.洗涤：使用洗涤缓冲液，如乙酸盐缓冲液，洗涤DNA沉淀，去除残留的污染物。
7.纯化：用去离子水溶解DNA沉淀，使其溶解在水中。
将溶解的DNA沉淀通过滤纸等过滤装置过滤掉残余杂质。
8.浓缩：通过酒精沉淀法或其他方法，将DNA溶液浓缩到所需的浓度。
9.检测：使用紫外分光光度计等方法，测定提取的质粒DNA的纯度和浓度。
注意事项：1.在实验过程中保持操作环境和仪器无菌。
2.碱裂解法中使用的溶液需准备新鲜，并避免受到污染。
3.操作过程中需要低温处理和离心操作，以保护DNA的完整性。
4.质粒DNA的提取可以根据实验目的进行进一步的扩增、测序或转染等应用。
总结：通过碱裂解法，可以从细菌中提取纯化的质粒DNA。
碱裂解法提取质粒原理
碱裂解法提取质粒原理
碱裂解法是一种常用的提取质粒的方法，其原理是利用碱性溶液将细菌细胞膜溶解，从而释放出质粒。
具体步骤如下：
1. 首先，培养含有目标质粒的细菌菌株，并收集足够数量的细菌细胞。
2. 将细菌细胞离心沉淀，去除上清液。
3. 使用含有碱性成分的溶液，如含有氢氧化钠和EDTA的碱
裂解液，将细菌细胞重悬。
4. 碱性溶液中的氢氧化钠会破坏细菌细胞膜的完整性，并且EDTA会螯合钙离子，进一步增强细菌细胞膜的脆弱性。
5. 经过一定时间的碱裂解作用，细菌细胞膜将被溶解，质粒被释放出来。
6. 使用中性化溶液，如盐酸或磷酸，可以调整溶液的酸碱度，使其接近中性，从而停止碱裂解的作用。
7. 利用离心的方法，将碱裂解液中的细菌残渣和其他杂质分离，得到含有质粒的上清液。
8. 最后，可通过柱层析等方法对上清液进行纯化，以获取纯净的质粒。
这种碱裂解法提取质粒的原理是利用碱性溶液破坏细菌细胞膜，从而释放出质粒。
与其他提取方法相比，这种方法简单易行，成本低廉，并且适用于大规模提取质粒。
碱裂解法提取质粒-配方,操作说明
碱裂解法提取质粒一、基本概念1．质粒：质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。
现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。
在基因工程中质粒常被用做基因的载体。
许多细菌除了染色体外，还有大量很小的环状DNA分子，这就是质粒(plasmid)。
质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。
有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进细菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。
目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。
细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%～3%。
根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。
每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。
按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒;另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。
一般分子量较大的质粒属严紧型。
分子量较小的质粒属松弛型。
质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。
在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。
人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。
常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。
pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点。
如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。
sds碱裂解法制备质粒dna
sds碱裂解法制备质粒dna
SDS碱裂解法是一种常用的质粒DNA提取方法。
该方法利用定量的SDS和NaOH对细菌细胞进行裂解，使DNA迅速释放。
接着，加入适当的中和缓冲液，使DNA回复其天然形态，并去除蛋白质等污染物。
最后，通过酒精沉淀法或硅胶柱层析法纯化DNA。
以下是该方法的具体步骤：
1.生长细菌
生长适量细菌菌株并收获细菌：可以选择不同种类、不同来源、不同
体积得到不同量的细菌。
2.裂解细胞壁
将细菌沉淀后加入缓冲液和SDS混合。
SDS能够破坏细菌的细胞膜，使细胞壁裂解，从而将DNA释放出来。
3.中和
加入NaOH将溶液pH值升高至12，使DNA形状发生改变，变得易于析出。
接着，加入Tris-HCl中和缓冲液降低pH值，恢复DNA天
然形态，并使DNA强度不受影响。
4.去除杂质
通过高速离心将DNA沉淀下来，将上清液与DNA分离。
可以采用氯仿提取法以去除蛋白质和其他杂质，专用的富集试剂和离心柱可做更细致的纯化。
5.精华DNA
通过酒精沉淀法或硅胶柱层析法纯化DNA。
酒精沉淀法适用于大量DNA纯化，但对于大片段、GC富集的DNA适用。
硅胶柱层析法适用于小规模、高质量、片段少的DNA纯化，但成本稍高，操作复杂。
总之，SDS碱裂解法是一种快速，简单的质粒DNA提取方法。
由于其便捷的操作和高质量的DNA回收率，它已被广泛应用于基因工程和分子生物学等领域。
提取质粒--碱裂解法打印版
碱裂解法碱裂解液1组分浓度：25mM Tris-HCl(pH8.0),10mM EDTA,50mM glucose配制量：1L配制方法：1、量取下列溶液，置于1L烧杯中1M Tris-HCl(pH8.0) 25ml0.5M EDTA(pH8.0) 20ml20% glucose(1.11M) 45mlaH2O 910ml2、高温高压灭菌后，4℃保存3、使用前每50ml的碱裂解液1中加入2mlRNase A(20 ug/ml)1M Tris-HCl(pH8.0)配制量：1L配制方法：1、称量121.1g Tris 置于1L烧杯中2、加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解3、加入浓盐酸调节所需pH值pH 8.0 约 42ml4、定容至1L5、灭菌，室温保存注意：应使溶液冷却了再调pH值0.5M EDTA(pH8.0)配制量：1L配制方法：1、称取186.1gNa2EDTA.2H2O于1L烧杯中2、加入约800ml的去离子水，充分搅拌3、用NaOH调节pH至8.0（约20gNaOH）注意：pH至碱裂解液2组分浓度：200 mMNaOH,1%(w/v)SDS配制量：500 ml配制方法：1、量取下列溶液，置于500ml烧杯中50ml10% SDS 50ml2N NaOH 50ml2、加灭菌水定容至500ml，充分混匀3、室温保存，此溶液保存时间最好不要超过1个月注意：SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌碱裂解液3组分浓度：3M KOAc,5M CH3COOH配制量：500ml配制方法：1、称量下列试剂，置于500ml烧杯中KOAc 147gCH3COOH 57.5 ml2、加入300ml去离子水后搅拌溶解3、加去离子水将溶液定容至500ml4、高温高压灭菌后，4℃保存Ⅰ1M Tris-HCl(pH 8.0)配制量：1L配制方法：1、称量121.1gTris置于1L烧杯中2、加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解3、加入浓盐酸调节所需的pH值Ph 8.0 约42ml4、定容至1L5、灭菌，室温保存应使溶液冷却了再调PH值0.5M EDTA(PH 8.0)配制量：1L配制方法：1、称取186.1gNa2EDTA.2H2O于1L烧杯中2、加入约800ml的去离子水，充分搅拌3、用NaOH调节pH至8.0（约20g NaOH）PH至8.0时，EDTA才能完全溶解4、加入去离子水，定容至1L5、适量分成小份，高温灭菌6、室温保存20%（w/v）glucose配制量：100ml方法：1、称取20g glucose置于100—200ml烧杯中，加入约80ml去离子水，搅拌溶解2、加去离子水定容至100ml3、灭菌，4℃保存Ⅱ2N NaOH配量：100ml方法：1、量取80ml去离子水于100-200ml塑料烧杯中2、称取8gNaOH小心加入烧杯中，边加边搅拌3、待NaOH完全溶解后，用去离子水将溶液定至100ml4、室温保存10% SDS（PH7.2）配制100ml方法：1、称取10gSDS于100-200ml烧杯中，加入约80ml去离子水，68℃加热溶解2、滴加浓HCl调至7.23、定容100ml，室温保存提取质粒注意事项：1、将菌种接种到LB培养基上（3ml），含适当培养基2、在离心管中加入1.5ml培养液，离心2min(12000改为15000rpm)3、倒去上清，重复2次，用枪吸去上清4、将菌沉淀重悬于100ul冰预冷的溶液Ⅰ，再涡旋搅拌剧烈振荡，室温放置5min5、加入200ul溶液Ⅱ，盖紧管口快速颠倒（勿振荡）ep管5次，充分混合后，充分混合内容物后，放在冰上4min6、加入150ul冰预冷溶液Ⅲ，盖紧管口，倒置振荡10s，将溶液Ⅲ分散均匀后，置于冰上3-5min，离心5min，12000rpm，取上清7、加入等量酚：氯仿：异戊醇25:24:1,12000rpm离心2min，取上清8、加入2倍体积冰无水乙醇，1/10NaOAc，冰箱放置30min（-20℃ 2小时以上，-80℃20-30min）以沉淀DNA9、4℃,12000rpm，5min离心（改为15000,8min）10、小心吸取上清，将离心管倒放在纸巾上，以使所有液体流出，并将附于管壁上的液滴除尽11、用1ml70%乙醇在4℃离心5min(12000rpm)，去上清12、干燥30min(空气中)，加入20ug（2ul）10mg/mlRNA酶和50ulTE，37℃反应1-3h，-20℃保存。
革兰氏阳性菌质粒碱裂解法提取
革兰氏阳性菌质粒碱裂解法提取具体步骤：（1）将待检测菌株接种于3 mL LB或BHI培养基（含终浓度为170µg/mL的氯霉素）中，37℃培养过夜；（2）取1.5 mL上述菌液于2 mL离心管，12,000×g，离心0.5min，尽可能吸尽上清液，若菌体过少可重复一次；（3）加入1mL STE缓冲液（pH8.0），用旋涡振荡器充分悬浮菌体，再12,000×g，离心2min，尽可能吸尽上清液，重复1~2次以洗涤菌体；（4）加入150 µL冰预冷碱裂解液Ι，用旋涡振荡器充分悬浮菌体；然后，加入40 µL溶菌酶（10mg/mL），此时不得涡旋！上下颠倒离心管、混合均匀，然后37℃放置30~45min；（5）沿管壁加入300 µL现配碱裂解液Π，轻轻颠倒离心管4~ 5 次，混合均匀、不得涡旋，置于冰上5 min；（6）迅速加入200 µL冰预冷碱裂解液Ш, 轻轻颠倒离心管4~ 5 次, 混合均匀、不得涡旋，置于冰上3~5min;之后，12000×g，4℃离心8min（也可室温离心5 min）；（7）用移液器将上清液转移至新的1.5 mL离心管中，加入1倍体积酚/氯仿（1:1）抽提，12,000×g离心5 min，重复操作一次；（8）移取上清液移至新的1.5 mL离心管中，加入1倍体积冰预冷无水乙醇和0.1倍体积3M 醋酸钠，室温沉淀10min（或4℃沉淀过夜），12,000×g离心5 min，尽量去掉酒精；（9）用0.5 mL冰预冷70％酒精洗DNA沉淀一次，12,000×g，4℃离心2 min，小心地吸去上清液，室温风干10 ~15 min；（10）加50µLTE缓冲液（含终浓度为50µg/mL的RNaseA酶，pH8.0）溶解DNA沉淀，-20℃保存。
试剂配制:（1）LB培养液：Tryptone 10 gYeast Extract 5 gNaCl 10g双蒸水定容至1000mL，高压灭菌后4℃保存。
碱裂解法提取质粒DNA
碱裂解法
1、取1.5ml培养液倒入1.5ml离心管中，4℃下12000g离心30秒。
2、弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽。
3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中（需剧烈振荡），室温下放置5-10分钟。
4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl，盖紧管口，快速温和颠倒离心管数次，以混匀内容物（千万不要振荡），冰浴5分钟。
5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒，使沉淀混匀，冰浴中5-10分钟，4℃下12000g离心5-10分钟。
6、上清液移入干净离心管中，加入等体积的酚/氯仿（1:1），振荡混匀，4℃下12000g离心5分钟。
7、将水相移入干净离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下12000g离心10分钟。
8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1ml70％乙醇洗沉淀一次，4℃下12000g离心5-10分钟。
9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10分钟或室温干燥。
10、将沉淀溶于20μl STE缓冲液（pH8.0，含20μg/mlRNaseA）中，储于-20℃冰箱中。
[注意]1.提取过程应尽量保持低温。
2.提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要，采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好，要将蛋白尽量除干净需多次抽提。
3.沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。
沉淀DNA也可用异丙醇（一般使用等体积），且沉淀完全，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。
大肠杆菌质粒提取 碱裂解法
大肠杆菌质粒提取碱裂解法大肠杆菌质粒提取是一种用于从大肠杆菌中提取质粒的方法。
碱裂解法是其中一种常用的方法，该方法利用碱性条件下DNA的不稳定性，将细胞壁溶解，并使质粒DNA从细胞中释放出来。
本文将介绍碱裂解法的步骤、原理以及优缺点。
碱裂解法的步骤如下：1.大肠杆菌培养：首先从保存在琼脂板上的大肠杆菌菌落中挑取一株菌，接种到含有适量抗生素的LB培养基中，培养过夜，直到菌液呈现较浓的悬浮液。
2.收取大肠杆菌：将培养液离心，除去上清。
用冷凉的纯水冲洗沉淀两次，将菌沉淀重悬于50 mM Tris-HCl缓冲液中，pH 8.0。
3.制备碱性溶液：在50 mM Tris-HCl缓冲液中加入0.2 M NaOH 和1% SDS，混匀制成碱性溶液。
4.碱性裂解：将菌悬液与等体积的碱性溶液混匀，使菌细胞在碱性条件下裂解。
孵育数分钟至十几分钟，直至溶液变为粘稠状。
5.酸性中和：加入等体积的3 M醋酸，酸性中和碱性溶液。
此步骤中，质粒DNA会从溶液中析出沉淀。
6.离心：用高速离心将沉淀离心下来，除去上清。
7.溶解：用适量的纯水将沉淀溶解，可以通过轻轻摇动溶液使其充分溶解。
8.纯化：通过离心或其他纯化方法，如柱层析、琼脂糖凝胶电泳等技术，纯化目标质粒DNA。
碱裂解法的原理是利用碱性条件下DNA的不稳定性。
当细胞处于高pH环境中时，碱性条件会破坏大肠杆菌的外膜，使细胞壁失去完整性。
此时，细胞内的DNA易于释放出来，包括质粒DNA。
然后，通过酸性中和反应将质粒DNA沉淀下来。
最后，通过纯化步骤，可以得到高纯度的质粒DNA。
碱裂解法的优点是简单易行，不需要较昂贵的设备和试剂，并且可以在相对短的时间内提取到目标质粒DNA。
此外，这个方法适用于大多数质粒类型和质粒大小。
碱裂解法适用于小规模提取或初步提取，用于大规模提取时效率较低，不推荐使用。
然而，碱裂解法也存在一些缺点。
首先，该方法提取到的DNA含有RNA、蛋白质和其他污染物。
质粒的提取
质粒的提取（碱裂解法）（1）挑取单菌落，接种于含有抗生素的LB培养基中，于37℃摇床培养过夜；（2）将菌液置于EP管中，12000rpm离心1min，收集菌体，弃去上清液（可重复进行此步）；（3）往EP管中加入100μl预冷的Solution Ⅰ，剧烈振荡后，静置5min；（4）往EP管中加入200μl新配的Solution Ⅱ，缓慢颠倒混匀，冰上静置5min；（5）往EP管中加入150μl预冷的Solution Ⅲ，点到混匀，冰上静置10min；（6）12000rpm离心5min，取上清液于新的EP管中；（7）往上清液中加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，混匀，室温中静置10min以上；（8）12000rpm离心8min，弃去上清液，加入80μL 75%乙醇，洗涤沉淀；（9）12000rpm离心3min，倒尽上清液；（10）倒扣晾干沉淀；（11）加入适量的ddH2O溶解沉淀。
质粒的提取（Omiga的Plasmid Mini KitⅠ（50）D6943-01试剂盒）（1）将菌液置于EP管中，12000rpm离心1min，收集菌体，弃去上清液（可重复进行此步）；（2）往EP管中加入250μl 的Solution Ⅰ（Rnase A）重悬菌液；（3）往EP管中加入250μl的Solution Ⅱ，轻轻颠倒混匀你，室温中静置2min；（4）往EP管中加入350μl的Solution Ⅲ，立即颠倒混匀；（5）13000g离心10min；（6）加上清液与HiBind柱中，下套收集管，10000g离心1min；（7）弃收集液，往柱中加入500μl的Buffer HB，10000g离心1min；（8）弃收集液，往柱中加入200μl的DNA Wash Buffer，10000g离心1min；（9）重复第八步一次；（10）弃收集液，10000g空转离心1min；（11）把柱子放在新的EP管中，加入30-50μlddH2O，13000g离心1min，回收液体。
实验一-碱裂解法提取质粒DNA
实验一-碱裂解法提取质粒DNA
碱裂解法是一种常用的质粒DNA提取方法。
下面是进行碱裂
解法提取质粒DNA的实验步骤：
1. 培养细胞：选择所需的质粒含有目标基因的细菌，如大肠杆菌等，并在适当的培养基中培养细菌，使其达到对数生长期。
2. 收集细菌：将培养好的细菌菌液转移到离心管中，并进行离心，以沉淀细菌。
3. 溶解细菌：加入一定浓度的碱液（例如0.2N NaOH）使细
菌溶解。
通常使用细菌菌液总量的1/5体积的碱液，并轻轻摇
晃混合。
4. 添加中和液：将等体积的中和液（例如3M乙酸酸化乙酸钠
溶液）加入到溶解好的细菌溶液中，并迅速而轻轻地混合。
5. 离心：将混合液进行离心，以除去沉淀的细菌残渣和碱液。
6. 提取DNA：将上一步离心得到的上清液转移至新的离心管中，加入等体积的冷乙醇，并轻轻摇晃，使DNA沉淀。
7. 沉淀DNA：进行高速离心，使DNA沉淀。
8. 弃去上清液：弃去上清液，保留沉淀的DNA。
9. 洗涤DNA：使用70%乙醇洗涤沉淀的DNA，以去除残留的盐类和碱液。
10. 干燥DNA：使用洗涤干净的乙醇或空气干燥DNA沉淀。
11. 溶解DNA：用适当的缓冲液（如TE缓冲液）溶解DNA。
12. 储存DNA：将溶解好的DNA储存于适当的温度和条件下，用于后续实验。
碱裂解法提质粒原理详解
碱裂解法提质粒原理详解碱裂解法是一种常用的提取质粒的方法。
它利用高碱性溶液对细菌的细胞壁和膜进行破坏，释放出细胞内的质粒。
下面将详细介绍碱裂解法的原理及其步骤。
碱裂解法的原理基于细菌细胞壁和膜对碱性条件的敏感性，而质粒较为稳定，可以在高碱性溶液中存活。
在碱性条件下，细菌的细胞壁和膜会发生严重的破坏，释放细胞内的质粒。
此外，高温和刺激性离子（如氢氧根离子）也可以增加细胞壁和膜的破坏效果。
碱裂解法的步骤如下：1.首先，从含有目标质粒的培养基中取得细菌菌落，将菌落转移到含有适当抗生素的培养基中进行培养。
这是为了确保获得含有目标质粒的细菌。
2.将培养好的细菌转移到含有高盐浓度的溶液中。
高盐浓度可以破坏细菌细胞壁的结构，促进质粒的释放。
3.加入碱性溶液，通常使用0.2MNaOH或0.1MNaOH。
高碱性条件可以破坏细菌细胞膜，释放质粒。
此外，高温还可以增加细胞壁和膜的破坏效果。
4.在碱性条件下，轻轻搅拌混合物，以促进细胞壁和膜的破坏，并使质粒更易于释放。
5. 加入中和缓冲液（例如Tris-HCl），以中和溶液的pH值。
这是为了避免碱性条件对质粒产生不利影响。
6.将混合物进行离心，以分离细胞碎片和质粒。
离心过程中，较大的碎片会沉淀在离心管底部，而质粒会悬浮在上层液体中。
7.将上层液体转移到新的离心管中，并进行再次离心。
这是为了进一步净化质粒，去除可能残留的细胞碎片。
8.倒掉上清液，并用含有合适抗生素的培养基再次进行培养。
这是为了筛选出仍然带有目标质粒的细菌。
总的来说，碱裂解法通过破坏细菌的细胞壁和膜，释放出细胞内的质粒。
该方法简单、快速，并且适用于大多数质粒的提取。
然而，需要注意的是，碱裂解法也会破坏部分目标蛋白质的结构，因此在选择提取方法时需要综合考虑。
大肠杆菌质粒提取 碱裂解法 -回复
大肠杆菌质粒提取碱裂解法-回复大肠杆菌质粒提取是分子生物学研究中常用的一个实验步骤。
通过提取质粒，可以进一步研究质粒中的目标基因或功能蛋白。
本文将主要介绍其中的一种提取方法，即碱裂解法，并一步一步解释各个步骤的操作方法及原理。
一、实验准备在进行大肠杆菌质粒提取之前，需要准备实验材料和设备。
实验材料包括含有目标质粒的大肠杆菌菌落、无菌离心管、无菌培养基、无菌PBS缓冲液、TE缓冲液、碱液（如NaOH/SDS溶液）、中性化液和以太。
实验设备包括超低温离心机、高速离心机、加热鼓摩挂计、水浴锅、pH 计等。
二、菌落培养与扩增1.从存有目标质粒的大肠杆菌菌落中挑取一小块菌落，接种入无菌培养基中，进行预培养。
预培养条件为37、200rpm、12-16小时。
2.将预培养好的菌液取1mL，用无菌离心管离心2-3分钟，去除上清，留下细胞沉淀。
三、细胞沉淀裂解1.加入1mL的无菌PBS缓冲液，轻轻将菌沉淀悬浮均匀。
2.将悬浮的菌沉淀加入无菌离心管，用超低温离心机离心10分钟（4、8000rpm）。
3.将上清去除，留下细胞沉淀。
四、碱裂解1.加入200μL的TE缓冲液，用吸管将细胞沉淀悬浮均匀。
2.加入200μL的碱液，用吸管轻轻混匀，置于室温静置5分钟。
五、中和1.加入300μL的中性化液，用吸管轻轻混匀。
2.将离心管置入热水浴锅中，温度设为70，恒温10分钟。
六、离心沉淀1.将热水浴锅中的离心管取出，加入600μL的以太。
2.用手掌将离心管摇匀，使其混合均匀。
注意不要用力摇动，以免产生过多的泡沫。
3.将离心管离心5分钟（4、12000rpm）。
七、提取质粒1.将上清（含有目标质粒）转移到另一个无菌离心管中。
2.加入等体积的冷乙醇，用吸管轻轻混匀。
3.用高速离心机离心10分钟（4、12000rpm）。
4.将上清去除，留下沉淀。
八、沉淀洗涤1.加入1mL的70乙醇洗涤沉淀，用吸管轻轻混匀。
2.用高速离心机离心5分钟（4、12000rpm）。
实验二 碱裂解法抽提质粒DNA-2
实验一、碱裂解法抽提质粒DNA
质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在 基因操作中具有重要作用。 质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。 质粒的提取方法很多，大多包括 3 个主要步骤：细菌的培养、 细菌的收集和裂解、质粒 DNA 的分离和纯化。
3、乙醇沉淀：是从水溶液中回收核酸的标准方法。乙醇能够消除核酸的水
化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。Na+之类的平衡离子能够与这 些带电基团结合，在沉淀形成部位降低多核苷酸链之间的排斥作用。因
此，只有在阳离子的量足以中和暴露的磷酸残基的电荷时才会发生乙醇
沉淀。
思考题（质粒抽提）
1、为什么真核生物的基因组DNA不能用碱法抽提？
本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。
一、实验目的
1、掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用； 2、掌握常用分子生物学试剂的配制；
3、掌握无菌操作技术；
4、掌握大肠杆菌的培养、保存及液体培养物OD值测定的方法； 5、掌握移液器、分光光度计、离心机的正确使用方法；
6、学会根据实验需要选择合适的大肠杆菌菌株和质粒载体。
7、离心几秒钟，用移液器尽可能除去酒精，风干（或热板上烘干1 min）。
8、根据DNA沉淀的大小加20~50 l 1× TE 溶解DNA沉淀，并在65℃热板上温育 10分钟（可使DNase失活），之后于 -20 ℃保存备用。
质粒抽提方法即去除 RNA，将质粒与细菌基因组 DNA分开，去除蛋白质及 其它杂质，以得到相对纯净的质粒。 使用相对过量的试剂 — 这是适合所有核酸抽提的建议。试剂相对过量的好处 是：稳定性好，纯度高，操作更简单。 关注溶液I、溶液II和溶液III的比例！
01碱裂解法抽提大肠杆菌质粒
1、实验目的 ： 学习与掌握碱裂解法抽提大肠பைடு நூலகம்菌质 粒DNA的原理与方法
2、实验原理：
碱裂解法抽提质粒DNA是基于染色体DNA与 质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。
3、实验步骤及各步注意事项
1. 取1.4ml大肠杆菌培养液12000rpm离心 2min，弃上清，收集菌体。 注意点：上清为培养基，必须尽量倾倒 干净，并在吸水纸上吸干，如有较多培 养基残留可能会影响后续实验。
6. 取上清，加等体积（400µ l）的酚/氯仿/ 异戊醇，充分混匀，室温，12000rpm离 心5min。
注意点：酚氯仿有腐蚀性，盖严离心管 盖，避免接触酚氯仿，如接触立即用水 冲洗。
7. 吸上层水相，再加1ml(约2.5倍体积）预 冷的无水乙醇，混匀。 注意点：一定避免吸到中间沉淀及下层 酚氯仿。宁可损失一定上清。
2. 加100µl的溶液 I，使菌体充分悬浮，室 温静置3min。 注意点：必须充分混匀至看不见沉淀， 可用移液器吹打或者用混匀器振荡。
3. 加入200µl溶液II，温和上下颠倒2-3次， 溶液转变为澄清透明。 注意点：不可剧烈振荡。
4. 加入150µl溶液III，上下颠倒混匀数次， 静置2-3min。 注意点：不可剧烈振荡，此时应出现白 色沉淀。 5. 12000 rpm离心5min。
8. 4℃，12000rpm离心10min。
9. 弃上清，加入0.5 ml 70％乙醇，4℃， 12000 rpm离心5 min。
10. 弃上清，沉淀自然干燥10 min后，加 20µ l无菌水溶解。 注意点：弃上清时尽量将酒精倾倒干净， 但注意不要将沉淀弃去。
碱裂解法提取质粒实验报告
碱裂解法提取质粒实验报告碱裂解法提取质粒实验报告引言：质粒提取是分子生物学研究中常用的技术手段之一，它可以将目标质粒从细胞中分离出来，为后续的基因克隆、基因测序等实验提供了重要的前提条件。
本实验旨在通过碱裂解法提取质粒，探究其原理及操作步骤，并评估提取质粒的纯度和浓度。
一、实验原理碱裂解法是一种常用的质粒提取方法。
其原理是通过高浓度的碱溶液和高温的条件，使细胞膜破裂，蛋白质变性，DNA解旋，从而将质粒分离出来。
碱裂解法的主要步骤包括细胞收获、细胞溶解、蛋白质沉淀、DNA沉淀、洗涤和溶解。
二、实验材料与方法2.1 实验材料（1）大肠杆菌E.coli菌株（2）LB培养基（3）质粒DNA提取试剂盒（4）离心管、显微管、PCR管等实验器材2.2 实验方法（1）培养大肠杆菌E.coli菌株至对数生长期。
（2）收获细胞，通过离心将菌体沉淀。
（3）将菌体重悬于碱溶液中，轻轻混匀后在冰上静置一定时间。
（4）加入中和溶液，混匀后离心。
（5）将上清液转移至新离心管中，加入异丙醇，混匀后离心。
（6）将异丙醇上清液转移至新离心管中，加入洗涤缓冲液，混匀后离心。
（7）将上清液转移至新离心管中，加入TE溶液溶解。
（8）测定质粒DNA的浓度和纯度。
三、实验结果与分析通过实验操作，成功提取到质粒DNA。
测定质粒DNA的浓度和纯度，结果显示浓度为X μg/μl，纯度（A260/A280）为X。
质粒DNA的浓度和纯度是评估提取质粒质量的重要指标，其高低直接影响后续实验的结果。
四、实验讨论本实验采用碱裂解法提取质粒，该方法操作简单、成本低廉，适用于小规模提取。
但是，碱裂解法提取的质粒DNA可能存在一定的污染物，如蛋白质、RNA 等。
此外，碱裂解法对于某些特殊的质粒可能效果不佳，需要根据实际情况选择合适的提取方法。
五、实验总结通过本实验，我们了解了碱裂解法提取质粒的原理和操作步骤，并成功提取到质粒DNA。
质粒DNA的浓度和纯度评估结果表明提取质粒的质量较好。
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碱裂解法提取质粒一、基本概念1．质粒：质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。
现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。
在基因工程中质粒常被用做基因的载体。
许多细菌除了染色体外，还有大量很小的环状DNA分子，这就是质粒(plasmid)。
质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。
有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进细菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。
目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。
细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%～3%。
根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。
每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。
按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒;另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。
一般分子量较大的质粒属严紧型。
分子量较小的质粒属松弛型。
质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。
在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。
人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。
常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。
pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点。
如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。
但是如果将DNA片段插入到HindIII、BamHI 或SalI切点，就会使抗四环素基因失活。
这时，含有DNA插入片段的pBR322将使宿主细菌抗氨苄青霉素，但对四环素敏感。
没有DNA插入片段的pBR322会使宿主细菌既抗氨苄青霉素又抗四环素，而没有pBR322质粒的细菌将对氨苄青霉素和四环素都敏感。
pSC101与pBR322相似，只是没有抗氨苄青霉素基因和PstI切点。
质粒运载体的最大插入片段约为10kb(kb表示为千碱基对)。
pGEX-4T1是pGEX载体系列的一种，载体图如图2所示，这类载体是溶蛋白表达、纯化和检测为一体的整合系统。
具有以下优点：有一个可以用化学物质（IPTG）诱导的高效表达的tac启动子；一个lacIq基因以便通用于所有E.coli 宿主中；一个AmpiR基因以便于阳性克隆的筛选。
pGEX-4T1载体示意图2．感受态细胞：重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。
在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。
所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。
cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。
细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。
3.转化:是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。
进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
转化的方法：化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞；电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。
二、碱裂解法质粒提取的原理碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。
下面是该法的提取原理:碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I，50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；(N相当于g/L，是当量浓度)溶液III，3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸。
溶液I的作用任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。
那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
在溶液I中加入EDTA是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。
溶液II的作用这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。
要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。
其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。
事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。
用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS 也无法有效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。
如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。
很多人对NaOH 的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。
有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。
这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。
基因组DNA的断裂会带来麻烦。
溶液III的作用溶液III加入后就会有大量的沉淀，与SDS的加入有关系。
十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）SDS遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。
溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。
大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。
这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。
2 M的醋酸是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。
基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。
所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。
很多人误认为是溶液III加入后基因组DNA无法快速复性就被沉淀了，这是天大的误会，因为变性的也好复性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。
NaOH本来是为了溶解细胞而用的，DNA分子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。
溶液III加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了PDS沉淀更充分一点。
酚/氯仿纯化不要以为PDS沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白质不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA，不然时间一长就会因为混入的DNase而发生降解。
这里用25/24/1的酚/氯仿/异戊醇是有很多道理的，这里做个全面的介绍。
酚（Phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。
至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。
回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来。
这时候如果放到－20℃，时间一长反而会导致大量盐的沉淀，这点不同于普通的DNA酒精沉淀回收，所以不要过分小心了。
高浓度的盐会水合大量的水分子，因此DNA分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。
如果感觉发生了盐的沉淀，就用70％的乙醇多洗几次，每次在室温放置一个小时以上，并用tip将沉淀打碎，就能得到好的样品。
得到的质粒样品一般用含RNase（50 ug/ml）的TE缓冲液进行溶解，不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的。
质粒检测琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下你能看到三条带，但千万不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。
碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA，不信的话你用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样。
其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。
如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。
非常偶然的是，有时候抽提到的质粒会有7－10条带，这是由于特殊的DNA序列导致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致。