质粒的小量提取(碱裂解法)

质粒的小量提取(碱裂解法)

材料与设备

E.coli 菌株；冷冻离心机，高压灭菌锅，恒温培养箱，超净工作台

试剂：

试剂与配制

1)质粒DNA碱裂解法试剂：

溶液I：葡萄糖50 mmol/L

EDTANa2 10 mmol/L

Tris-HCl （pH8.0）25 mmol/L

溶液II：（临用时新配制）（是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。）

NaOH 0.4 mol/L

SDS（w/v）2%

0.4mol/L NaOH 和2% SDS（w/v）对半混匀即可。

溶液III： 5 mol/L 醋酸钾60 mL

冰醋酸11.5 mL

DDW 28.5 mL

溶液I、III都须高压灭菌。

2) 氯仿:异戊醇=24:1

3) 无水乙醇；70%乙醇；异丙醇

4) TE（pH8.0）：10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA

操作步骤：

（1）取菌液1.5mL, 4000 rpm离心5min,弃上清。

（2）加入预冷的100μl 溶液I。震荡混匀。室温放置5min。

（3）加入200μl溶液II，盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管3-5次（不要剧烈震荡）, 冰浴放置5min。

（4）加入预冷的150μl 溶液III。温和震荡混匀，冰浴5min。

（5）12000rpm离心5min。

（6）取400ul上清至另一干净的EP离心管中，加入400μl 氯仿:异戊醇，混匀。12000rpm 离心5min。

（7）轻轻取350ul上清至另一干净的EP离心管中，加入700μl无水乙醇充分混匀后，室温静置沉淀5~10min。

（8）12000rpm离心5min，弃上清。

（9）用500μl 70%的乙醇漂洗沉淀1次，5000rpm离心5min。

（10）沉淀物自然干燥后加入30μl 含RNAase的TE(pH8.0)，以溶解质粒DNA。

（11）电泳检测实验结果。