质粒提取常见问题解析
分子生物学实验中常见的问题与对策-9
分⼦⽣物学实验中常见的问题与对策-9⼀、质粒提取常见问题分析与策略1.⽤试剂盒未提出质粒或质粒得率低有哪些原因？1）细菌⽼化请凃布平板培养后，重新挑选新菌落进⾏液体培养。
2）细菌培养物⽣长过度或不新鲜不要于37℃培养超过16⼩时，分离质粒前长时间存放培养物是不利的。
3）质粒拷贝数低由于使⽤低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的⾼拷贝数载体。
4）菌体中⽆质粒有些菌体本⾝不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。
例如柯斯质粒在⼤肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应该接种单菌落。
另外检查筛选⽤抗⽣素使⽤浓度是否正确。
5）菌体过量，碱裂解不充分取样时菌液过多，导致菌体裂解不充分，可减少菌体⽤量或增加溶液悬浮液、裂解液、中和液的⽤量。
对低拷贝数质粒，提取时可加⼤菌体⽤量并加倍增加溶液悬浮液、裂解液、中和液的⽤量（应保持1：1：1.4⽐例）。
6）溶液使⽤不当溶液裂解液、中和液在温度较低时容易出现盐析，如出现，应将其放⼊37℃⽔浴⾄完全溶解、澄清，⽅可使⽤。
7）质粒未全部溶解（尤其质粒较⼤时）洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。
8）⼄醇残留洗涤液Ⅱ洗涤后应离⼼并静置数分钟尽量去除残留⼄醇后，再加⼊洗脱液洗脱回收。
9）洗脱液加⼊位置不正确洗脱液应加⼊吸附柱中膜的中央以确保洗脱液完全覆盖吸附膜的表⾯达到最⼤洗脱效率。
10）洗脱效率：洗脱效率与洗脱液PH值、洗脱液⽤量、洗脱次数、加⼊洗脱液后的静置时间和是否预热等因素有关。
PH7.0－8.5之间，洗脱液⽤量不得⼩于50µl，重复洗脱2-3次，增加室温静置时间及65℃⽔浴预热可以有效提⾼得率30%。
2.试剂盒提取质粒纯度不⾼，如何解决？1）有蛋⽩质污染应在加⼊去蛋⽩液后，以⾜够⾼的转速离⼼，使沉淀紧密，并⼩⼼地吸取上清液，避免吸⼊沉淀。
另外，不要使⽤过多菌体。
经悬浮液、裂解液、中和液处理，离⼼后溶液应为澄清的，如果还混有微⼩蛋⽩悬浮物可再次离⼼去除后再进⾏下⼀步骤。
质粒DNA提取实验常见问题解答
质粒DNA提取实验常见问题解答1.加入solution.III，经10分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，有的漂浮在液面，有的贴在离心管壁上，一摇晃即破碎脱落下来？细菌的用量太少，导致产生的沉淀主要是盐分的沉淀，因为缺少变性的细菌蛋白和细菌基因组DNA 的缠绕，沉淀就显得不结实。
解决方法：将细菌的用量增加。
2.加入soln.III，经10分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，呈大块的水泡状，上清较少？（1）使用了过多的细菌，导致菌体未被有效裂解。
解决方法：将细菌用量减半。
（2）细菌悬浮不充分,存留小菌块,导致菌体未被有效裂解。
解决方法：注意将细菌悬浮充分。
（3）加Solution III后中和不充分。
解决方法：如果细菌用量较多，请注意多翻转几次直至中和后的沉淀呈松散的豆腐花状(也可以稍用力混合直至沉淀呈松散的豆腐花状)。
（4）Solution II出现沉淀。
解决方法：如果实验室内温度低于15℃，使用试剂盒前请注意观察Solution II中是否出现沉淀。
如果出现沉淀，请于37℃水浴溶解沉淀后再使用。
（5）Solution II 长时间暴露于空气中被CO2中和，导致菌体未能被有效裂解。
解决方法：可用经典碱裂解法抽提质粒DNA方法中的II液替代Solution II使用。
3.出现严重的RNA污染？（1）未在Solution I中事先加入RNase A1。
解决方法：补加RNase A1。
（2）加入RNase A1的Solution I长期保存于室温，导致RNase A1活性下降。
（3）细菌过量,RNase A1不能有效降解RNA。
解决方法：将细菌用量减半或增加RNase A1在Solution I中的浓度。
4.抽提的质粒DNA电泳时怎么出现切口.断裂或降解现象？（1）使用的是收集后冷冻保藏的细菌。
解决方法：使用新鲜培养的细菌。
（2）宿主菌富含核酸内切酶。
解决方法：增加一步Rinse A洗涤步骤以彻底去除残留的核酸内切酶。
质粒提取简介及问题分析（最终5篇）
质粒提取简介及问题分析（最终5篇）第一篇：质粒提取简介及问题分析质粒提取简介及问题分析一、导论(一)质粒提取的原理：为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I，50 mM葡萄糖，25 mM Tris-HCl，10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH，1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾，2 M 醋酸。
让我们先来看看溶液I的作用。
任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-HCl溶液，是再自然不过的了。
那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言几乎没有任何影响，所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。
EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
在溶液I中加入高达 10 mM 的EDTA，就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。
如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。
如果手上正好缺了溶液I，可不可以抽质粒呢？只要用等体积的水或LB 培养基来悬浮菌体就可以了。
有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。
轮到溶液II了。
这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2%的SDS等体积混合后使用的。
要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。
很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。
事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer(双层膜)结构向micelle(微囊)结构的相变化所导致。
质粒提取有关问题及注意点
质粒提取常见问题解析涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死？参考见解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。
蘸了酒精后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒。
建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再涂。
同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。
原先测序鉴定没有问题的细菌，37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常?参考见解：这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。
解决办法：1、降低培养温度，在20～25℃下培养，或室温培养可明显减少发生概率。
2、使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使得质粒复制更加稳定。
3、质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH浓度过高造成的，请大家注意一下！【有两种方法可以在提质粒前判断菌生长是否正常：1、利用你的嗅觉。
只要平时做实验仔细点就能闻出大肠杆菌的气味，新鲜的大肠杆菌是略带一点刺鼻的气味，但不至于反感。
而在泥水状的菌液中你只要一凑过去就感觉到其臭无比或者没有气味，可以和正常菌液对照。
2、肉眼观察活化菌株。
对于生长不正常的菌液进行划板验证或者稀释到浓度足够低涂板，第二天观察单克隆生长情况，LB平板生长的DH5A正常形态在37℃16h后直径在1mm左右，颜色偏白，半透明状，湿润的圆形菌斑，如果观察到生长过快，颜色又是泛黄的话基本上不正常了。
】未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？参考见解：1、大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。
2、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。
3、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。
例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。
另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。
4、碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液的用量。
质粒提取常见问题
4．为什么用无水乙醇沉淀DNA？
用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。
DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15－30分钟即可。
保存在冰箱中的酚，容易被空气氧化而变成粉红色的，这样的酚容易降解DNA，一般不可以便用。为了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羟基喹琳至终浓度为0.1％。8-羟基喹琳是带有淡黄色的固体粉末，不仅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金属离子的弱螯合剂。用Tris pH8.0水溶液饱和后的酚，最好分装在棕色小试剂瓶里，上面盖一层Tris水溶液或TE缓冲液，隔绝空气，以装满盖紧盖子为宜，如有可能，可充氮气，防止与空气接触而被氧化。平时保存在4℃或－20℃冰箱中，使用时，打开盖子吸取后迅速加盖，这样可使酚不变质，可用数月。
3. 溶液III--3mol／L NaAc（pH4.8）溶液：
NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol／L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。
分子生物学实验常见问题分析及对策-20
分子生物学实验常见问题分析及对策-20质粒的提取常见问题与对策Q1: 提质粒没有明显的沉淀，能说明是没有提出来吗？跑完电泳还是没有条带能证明质粒没提出来吗？A: 提质粒的时候没有明显的沉淀，也有可能是由于你加的乙醇量少或异丙醇量不足或质量有问题。
或者质粒太少了难以用肉眼看出。
跑完电泳还是没有条带也有可能是跑胶时配置胶出问题，或染色剂不够，或者你加的质粒量少。
要具体情况再分析Q2:质粒条带很暗而且通常只有一条带是什么问题？A:没有用试剂盒提取的话可能考虑技术问题。
如果常做质粒的提取，且用的是试剂盒，还出现这种情况，就要从质粒本身着手考虑了：首先做个PCR鉴定一下，确保有质粒的情况下，很可能质粒是低拷贝的，如此就要用大量的细菌来提取质粒。
一般的用可以用水煮法提(1ml菌液离心,沉淀加50μl DEPC 水,100度水煮3-4分钟,离心取上清夜,含有大量的质粒)用1-2μl作为模板跑PCR效果很好。
Q3: 用分光光度计测得的质粒浓度很高，但是跑出来的电泳却看不到条带，这是什么原因？A: 三种可能：1）可能EB有问题，应同时检查同一块胶上其它样品是否有条带。
2）计算OD260/280比例，有可能为蛋白污染所致。
3）稀释后上样的浓度过低。
Q4: 提质粒电泳显示应该几条带？哪种情况较好？A: 质粒在电泳时会出现三种情况的图谱：1）三条带，按照电泳泳动速度（快到慢）排列为：超螺旋、缺口闭环、开环。
经常会出现。
2）两条带，超螺旋/闭环/开环任意两种。
3）一条带，超螺旋。
至于那种情况好，要看我们进一步实验的目的了。
1）进行分子克隆的操作，构建载体。
这随便那种情况都可以，不会影响你的后续实验。
所以在这种情况下，没必要评比谁好谁不好。
2）进行细胞转染。
因为转染必须要超螺旋，所以它们的质量好坏顺序是： 3）、2）、1）。
Q5: 如何降低质粒变性超螺旋的含量？A: 理论上，用碱裂解法抽提质粒，变性超螺旋的出现是不可避免的。
质粒提取常见问题
细菌太老，活力不够 质粒为严谨型 在 DNA 结合溶液中已经 形成沉淀
画线培养细菌使之活化。 使用 5-10ml 菌液但是不要超过 10ml 菌液。
将 DNA 结合溶液加热到 37℃混匀冷却到 30℃备用。
DNA 结合柱太干 用错试剂
步骤 7 之后立即用 DP 洗脱液洗脱。 请仔细核对试剂名称。
用自动 荧光 测序没 有结果
悬器或剧烈震荡
紫外测定 DNA 浓度 低于琼 脂糖 凝胶测 定浓度
微量的 污染物 同时 被洗脱 出来， 会影响 紫外 分光光 度计读数
用酚/仿抽提， 酒精沉淀，70%酒 精清洗后干燥， 水溶，重 新紫外定量。
质粒酶切效果不好
要优化
使用 TE 缓冲液 使用 EndA+菌株导致 DNA 在酶切时降解
总体积的 1/10，酶切时间不要超过 2 小时。 尽量使用 DP 洗脱液洗脱。 在步骤 5 之后用 1ml 40%异丙醇/4.2M 盐酸胍溶液清洗 DNA 胞 裂解溶 液后 使用涡 加细胞裂解溶液后不要剧烈震荡
测序反应体系中 DNA 的 量加得不够
使用 TE 洗脱
杂质多 内切酶 浓度和 酶切 时间需
提取的质粒要经过琼脂糖凝胶电泳定量。要使用新鲜的 LB 培养基和新活化的菌株摇菌。
最好使用 DP 洗脱液洗脱（TE 中的 EDTA 能降低测序反应 中 M g2+的有效浓度）。 重复步骤 6。 尽量使用内切酶 的最佳酶切 缓冲液；内 切酶浓度不 要超过
DNA 结合柱中酒精没有除 增加步骤 7 的离心时间，如果 DNA 已经洗脱出来，可以用
干净。
酒精沉淀 DNA 并风干，然后水溶。
摇细菌 时间太 长， 造成空 菌生长过量。
确认是否所有的 培养基都加 了抗生素， 不要培养细 菌超过 24 小时（固体/液体培养基），一般 12-16 小时已经足够。
质粒提取中常见的问题
质粒提取中常见的问题质粒DNA提取常见问题分析1.加入solution.III，经10分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，有的漂浮在液面，有的贴在离心管壁上，一摇晃即破碎脱落下来？细菌的用量太少，导致产生的沉淀主要是盐分的沉淀，因为缺少变性的细菌蛋白和细菌基因组DNA 的缠绕，沉淀就显得不结实。
解决方法：将细菌的用量增加。
2.加入soln.III，经10分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，呈大块的水泡状，上清较少？（1）使用了过多的细菌，导致菌体未被有效裂解。
解决方法：将细菌用量减半。
（2）细菌悬浮不充分,存留小菌块, 导致菌体未被有效裂解。
解决方法：注意将细菌悬浮充分。
（3）加Solution III后中和不充分。
解决方法：如果细菌用量较多，请注意多翻转几次直至中和后的沉淀呈松散的豆腐花状(也可以稍用力混合直至沉淀呈松散的豆腐花状)。
（4）Solution II出现沉淀。
解决方法：如果实验室内温度低于15℃，使用试剂盒前请注意观察Solution II中是否出现沉淀。
如果出现沉淀，请于37℃水浴溶解沉淀后再使用。
（5）Solution II 长时间暴露于空气中被CO2中和，导致菌体未能被有效裂解。
解决方法：可用经典碱裂解法抽提质粒DNA方法中的II液替代Solution II使用。
3.出现严重的RNA污染？（1）未在Solution I中事先加入RNase A1。
解决方法：补加RNase A1。
（2）加入RNase A1的Solution I长期保存于室温，导致RNase A1活性下降。
（3）细菌过量,RNase A1不能有效降解RNA。
解决方法：将细菌用量减半或增加RNase A1在Solution I中的浓度。
4.抽提的质粒DNA电泳时怎么出现切口.断裂或降解现象？（1）使用的是收集后冷冻保藏的细菌。
解决方法：使用新鲜培养的细菌。
（2）宿主菌富含核酸内切酶。
解决方法：增加一步Rinse A洗涤步骤以彻底去除残留的核酸内切酶。
质粒提取dna浓度很低的原因
质粒提取dna浓度很低的原因质粒提取DNA浓度很低的原因可以归结为实验技术问题和样本质量问题。
1.实验技术问题：a.细胞破裂条件不恰当：细胞破裂是质粒提取过程中的关键步骤。
若破裂条件不合适，细胞壁、细胞膜等难以有效破裂，导致DNA无法充分释放。
b.酶处理不完全：一些质粒提取试剂盒中含有各种酶，用于去除RNA、蛋白质等杂质。
若酶处理不完全，则会影响到最终的DNA提取效果。
c.DNA沉淀损失：在质粒提取的过程中，需要将DNA以乙醇或异丙醇的形式沉淀下来。
若操作不当，可能会导致DNA的沉淀损失，影响最终的DNA浓度。
2.样本质量问题：a.初始细胞数量不足：DNA的浓度与初始细胞数量有关。
若所得样本细胞数量较少，提取出的DNA浓度自然会较低。
b.样本存储问题：DNA在长时间的存储过程中容易降解。
若样本保存不当，例如长期暴露在高温、阳光、酶活等有害条件下，会导致DNA降解，从而降低提取出的DNA浓度。
c.PCR抑制物存在：在一些样本中可能存在抑制PCR的物质，例如多重抑制剂、碱金属离子等。
这些物质会影响到DNA提取过程中的DNA释放、纯化和扩增。
3.仪器设备问题：a.毛细管堵塞：在质粒提取过程中，一些步骤需要通过离心机或多通道吸头进行操作。
若这些仪器设备存在故障或堵塞，会导致样本流失、不完全吸取，从而降低DNA提取效率。
b.测量仪器不准确：DNA的浓度通常是通过分光光度计等仪器进行测量的。
若仪器不准确或校准不当，可能会导致DNA浓度的误差。
针对以上问题，可以采取一些措施来提高质粒提取DNA的浓度：1.优化破裂条件：选择合适的细胞破裂缓冲液、酶和破碎方式，确保细胞充分破裂，使DNA能够完全释放。
2.酶处理完全：严格按照试剂盒说明书中的操作步骤进行酶处理，确保RNA、蛋白质等杂质被充分去除。
3.注意DNA沉淀：在沉淀DNA时，要注意沉淀时间、温度和离心速度，确保DNA能够充分沉淀，并避免沉淀损失。
4.增加初始细胞数量：可以尝试增加样本量或提取较高浓度的细菌培养物，以获得更多的初始细胞数量。
质粒提取常见问题解析
其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱
缓冲液加热至60℃后使用有利于提高洗脱效率。
△ 洗脱体积太小
洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降
溶液，才能使用。
△ 吸附柱过载
不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若
用富集培养基，例如TB 或2×YT，菌液体积必须减少；若质粒或宿主菌是非常高
的拷贝数或生长率，则需调整LB培养液体积。
△ 质粒未全部溶解（尤其质粒较大时）
洗脱ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。
△ 混有RNA
RNase A处理不彻底，请减少菌体用量或加入溶液P3之后室温放置一段时间。如
果溶液P1已保存6个月以上，请在溶液P1中添加RNase A。
△ 混有基因组DNA
加入溶液P2和P3后应温和混匀，如果剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从
而混杂在质粒中。如果加入溶液P2后过于粘稠，无法温和混匀，请减少菌体用
应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。
△ 碱裂解不充分
使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液P1、
P2和P3的用量。对低拷贝数质粒，提取时，可加倍使用溶液P1、P2和P3，可能
有助于增加质粒提取量和质粒质量。
△ 溶液使用不当
溶液P2、P3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的
△ 大肠杆菌老化
请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。
质粒提取常见问题与解决方法参考
质粒提取常见问题与解决方法参考质粒提取常见问题与解决方法参考来源：易生物实验浏览次数：632 网友评论 0 条关键词：质粒质粒提取1. 细菌离心后，加入溶液I蜗旋振荡时，发现菌体呈絮状不易混匀，或成细砂样。
——很可能是细菌发生溶菌，可减少培养时间、降低培养温度试试看，通常降低培养温度会使细菌生长更加稳定；同时也可以试试平板培养，培养后，用PBS将菌落洗下，再进行质粒的提取，固体培养基上细菌生长的要好一些。
2. 加入溶液II，菌液浑浊度没有发生明显变化。
——裂解不完全，主要问题是发生在溶液II上。
确保10％SDS是澄清的，确认NaOH是有效的，如使用的是试剂盒，确认溶液II是澄清没有沉淀的。
如确认原因不是发生在溶液II上，而是细菌浓度比较高，可相应增加溶液I/II/III的体积。
此外，啤酒肚16059978战友还提出，有可能是“杂菌”污染。
3. 加入酚仿抽提，离心后在水相和有机相间没有变性蛋白层，但随后的乙醇沉淀发现大量的半透明沉淀，溶解后蛋白浓度高。
——乙醇沉淀时，较纯的质粒沉淀应该是白色（PEG纯化的沉淀是透明的，肉眼不易发现），如沉淀是半透明的凝胶状，则是蛋白含量高。
出现此类问题时确认两点：1. 平衡酚是否被氧化、pH是否是8.0。
2. 溶液I/II/III反应后，离心的上清pH是否在8.0左右。
有时，由于溶液III配置的问题，导致溶液I/II/III反应后离心的上清pH与8.0偏差较大，导致平衡酚抽提时没有有效的将蛋白抽提出来，有时，离谱的pH会导致水相和平衡酚互溶。
4.使用酚仿抽提方法，质粒A260/A280的纯度也很好，但酶切不能完全切开。
——1.确认酶的有效性；2. 平衡酚是否被氧化而呈现棕色，而非正常的黄色；3. 是否不小心吸入了痕量的酚；4.乙醇沉淀后，70%乙醇漂洗的是否充分，残留的盐类会影响酶切；5.乙醇漂洗后是否完全干燥，残留的乙醇会影响酶切；5. 提取质粒中RNA没有去除。
质粒提取常见问题解析
质粒提取常见问题解析质粒, 解析本帖引用网址：/thread-29246-1-1.html涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死？参考见解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。
蘸了酒精后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒。
建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再涂。
同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。
原先测序鉴定没有问题的细菌，37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常?参考见解：这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。
解决办法：1、降低培养温度，在20～25℃下培养，或室温培养可明显减少发生概率。
2、使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使得质粒复制更加稳定。
3、质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH浓度过高造成的，请大家注意一下！【有两种方法可以在提质粒前判断菌生长是否正常：1、利用你的嗅觉。
只要平时做实验仔细点就能闻出大肠杆菌的气味，新鲜的大肠杆菌是略带一点刺鼻的气味，但不至于反感。
而在泥水状的菌液中你只要一凑过去就感觉到其臭无比或者没有气味，可以和正常菌液对照。
2、肉眼观察活化菌株。
对于生长不正常的菌液进行划板验证或者稀释到浓度足够低涂板，第二天观察单克隆生长情况，LB平板生长的DH5A正常形态在37℃16h后直径在1mm左右，颜色偏白，半透明状，湿润的圆形菌斑，如果观察到生长过快，颜色又是泛黄的话基本上不正常了。
】未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？参考见解：1、大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。
2、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。
3、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。
例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。
另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。
分子生物学实验常见问题分析及对策 20
分子生物学实验常见问题分析及对策 20分子生物学实验常见问题分析及对策-20质粒提取常见问题及对策q1:提质粒没有明显的沉淀，能说明是没有提出来吗？跑完电泳还是没有条带能证明质粒没提出来吗？答：提高颗粒质量时没有明显沉淀，这可能是由于乙醇含量少或异丙醇含量不足或质量问题。
或者质粒太少，肉眼无法看到。
运行电泳后，仍然没有条带。
也可能是运行胶水时胶水的配置有问题，或者染料不够，或者添加的质粒量很小。
我们应该重新分析具体情况q2:质粒条带很暗而且通常只有一条带是什么问题？答：如果不使用工具包提取，可能会考虑技术问题。
如果经常提取质粒并使用试剂盒，则应从质粒本身考虑：首先，进行PCR鉴定，以确保如果存在质粒，则可能是低拷贝质粒，因此应使用大量细菌来提取质粒。
一般的用可以用水煮法提(1ml菌液离心,沉淀加50μldepc水,100度水煮3-4分钟,离心取上清夜,含有大量的质粒)用1-2μl作为模板跑pcr效果很好。
问题3：分光光度计测得的质粒浓度很高，但电泳时看不到条带。
原因是什么？答：有三种可能性：1）可能eb有问题，应同时检查同一块胶上其它样品是否有条带。
2）计算od260/280的比值可能是由蛋白质污染引起的。
3）稀释后的样品浓度过低。
q4:提质粒电泳显示应该几条带？哪种情况较好？a:质粒在电泳时会出现三种情况的图谱：1）根据电泳游动速度（快到慢）排列三条带：超级螺旋、缺口闭环和开环。
经常2）两条带，超螺旋/闭环/开环任意两种。
3）一条带，超螺旋。
至于那种情况，这取决于我们进一步实验的目的。
1）进行分子克隆的操作，构建载体。
这随便那种情况都可以，不会影响你的后续实验。
所以在这种情况下，没必要评比谁好谁不好。
2）进行细胞转染。
因为转染必须要超螺旋，所以它们的质量好坏顺序是：3）、2）、1）。
问题5：如何降低质粒变性超级螺旋的含量？a:理论上，用碱裂解法抽提质粒，变性超螺旋的出现是不可避免的。
之所以大家没有非常在意，一是因为它的存在似乎对酶反应没有任何影响，二是因为它的含量并不一定高到被用电泳观察到。
质粒提取问题与心得
质粒提取问题与心得质粒提取是分子生物学实验中常见的操作，用于从细菌中提取质粒DNA。
质粒是细菌细胞内的环状DNA分子，通常用于在细菌中传递外源基因。
质粒提取的过程涉及细胞破裂、DNA纯化和浓缩等步骤，下面我将从几个方面来谈谈质粒提取的问题与心得。
首先，质粒提取的关键步骤包括细胞破裂、DNA纯化和浓缩。
在细胞破裂过程中，使用适当的细胞破裂缓冲液和方法对细菌进行破裂，释放质粒DNA。
在DNA纯化过程中，通过离心、溶液添加和酚/氯仿提取等方法，将质粒DNA与蛋白质、RNA等杂质分离。
最后，通过乙醇沉淀等方法对DNA进行浓缩，得到纯净的质粒DNA。
其次，质粒提取过程中可能遇到的问题包括DNA污染、纯化不彻底、DNA浓度不足等。
为了解决这些问题，可以在细胞破裂缓冲液中添加蛋白酶等物质，提高DNA的纯化效果；在DNA纯化过程中，可以多次进行酚/氯仿提取和乙醇沉淀，提高纯化的彻底性；在最后的浓缩过程中，可以根据实际情况调整乙醇的浓度，以获得所需浓度的质粒DNA。
此外，质粒提取的心得体会包括操作技巧、实验条件和耐心。
在进行质粒提取实验时，需要熟练掌握各个步骤的操作技巧，尤其是在细胞破裂和DNA纯化过程中需要细心操作；实验条件也很重要，包括细菌培养的状态、破裂缓冲液的配制和储存等；此外，需要有耐心，因为质粒提取是一个细致而耗时的过程，需要耐心等待和细心操作。
综上所述，质粒提取是分子生物学实验中常见的操作，需要注意细节、耐心等。
在实际操作中，我们需要不断总结经验，积累心得，以期获得更好的实验结果。
希望以上内容能够对你有所帮助。
碱裂解法制备质粒的各种溶液的作用及提取中可能出现的问题
碱裂解法制备质粒的各种溶液的作用及提取中可能出现的问题一、质粒提取三种溶液的作用：为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I，50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸。
1、溶液I：任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。
那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。
所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。
那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
在溶液I中加入高达10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。
如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。
如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB 培养基来悬浮菌体就可以了。
有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。
2、溶液II：这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。
要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。
很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。
事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。
质粒提取常见问题解答
质粒提取常见问题解答在一代测序或者去内毒素大提质粒时经常会发生一些质粒提取得率很低影响测序或大提质粒得率的情况。
可从以下几种情况作出改善。
第一种情况.没有提出质粒或者质粒收获量很低，可能原因如下：A菌种老化建议：对于甘油保存的菌种，需要先进行活化，涂布或者划线菌种，重新挑选单菌落进行液体培养，并对菌种进行初摇活化，按照1:500的比例进行菌种培养。
二次培养时间最好不要超出16小时（或者OD600不超过3.0）。
B低拷贝质粒建议：如果是由于低拷贝质粒引起的质粒收获量低，可以采用两倍的菌体量，并相应增加各种BUffer的用量。
C质粒丢失建议：某些质粒在次继代培养的过程中会出现丢失的想象，另外检查筛选抗生素的浓度是否正确。
D裂解不充分建议：如果采用超过推荐量的菌体进行质粒制备，会导致菌体裂解不充分。
可适当减少菌体的用量或者相应增大各种Buffer的用量。
并确保细菌混悬均匀。
EBUffer中有沉淀未溶解建议：BUfferBI和BUfferN1,BUfferC1在温度较低时会出现沉淀，使用前请检查是否有沉淀生成，如果有沉淀生成，请置于37°C温育片刻，待溶液澄清后使用。
FDNAWashBuffer中未加入要求量的乙醇建议：按照说明书要求加入要求量的无水乙醇，使用后旋紧瓶盖，防止乙醇挥发。
另外对于质粒中提，大提等，要求用70%乙醇洗涤，请确保乙醇的体积不小于70%。
G离心柱中乙醇残留建议：漂洗后，可适当延长离心时间，尽量去除残留的乙醇。
另外对于质粒大提，建议离心后，将柱子或大漏斗用吹风机冷风吹片亥∣J(或置于65℃烘箱)，以彻底去除残留的乙醇,便于洗脱和后续实验操作。
H洗脱液加入位置不正确建议：洗脱液应加在膜中央，已取得最好的洗脱效果。
I洗脱液PH值不正确建议：将DNA从柱子上洗脱下来的最适PH值在7.0∙8.5之间，如果洗脱液的PH超出此范围将会显著影响洗脱效果，请使用试剂盒配套的日UtionBUffer(PH8.5,1OmMTriS-HC1)进行洗脱，如果用ddH20进行洗脱，请确保PH在7.0-8.5之间。
质粒提取dna浓度很低的原因
质粒提取dna浓度很低的原因
1.质粒品质问题：质粒的质量可能不够好，可能会包含杂质，如蛋白质、RNA、碎片等，这些杂质可能影响DNA的纯度和浓度。
2.操作不当：在提取过程中，可能存在一些环节操作不当，如去除超
凝胶溶剂不彻底、离心不充分、洗涤溶液不足等，这些因素都会导致DNA
的损失和浓度降低。
3.样本问题：样本的质量也会影响DNA提取的浓度，样本不足、降解、污染、固化等都会导致DNA浓度低。
4.过度纯化：过度纯化可能导致DNA损失，也可能将DNA纯化到无法
检测的程度。
5.储存条件不当：DNA必须储存在适当的条件下，如低温、干燥，否
则会导致DNA降解和损失。
质粒小抽常见的几个小问题
质粒小抽常见的几个小问题1、 提不到质粒或质粒产量很低：b. 检查溶液II是否有沉淀。
溶液II在室温较低时特别是在冬天，容易产生沉淀。
如果有沉淀产生，一定要水浴（如37度水浴）加热溶解，并混匀后才能使用。
c. 检查溶液IV中是否已经按照说明书的要求加入适量的乙醇，并检查加入的乙醇质量。
我们发现有些有些厂家生产的所谓分析纯无水乙醇（可能是假冒的），轻轻闻一下，有乙酸的酸味，明显是劣质乙醇。
如果使用发酸的劣质乙醇，会导致质粒产量下降，甚至没有质粒。
d. 检查抗生素是否失效，如果抗生素失效，或浓度太低可能会导致杂菌大量扩增，从而得不到质粒或得到很少质粒。
e. 大肠杆菌生长时间过长或过短，也会导致抽提不到质粒或质粒产量很低。
一般对数期的细菌最适合质粒抽提。
DH5alpha，JM109等菌一般以37度摇过夜，约16小时比较合适，而TG1等生长较为快速的菌不宜摇过夜。
细菌量以加入裂解液后能裂解成透明容易为上限，适当多一些的菌量，可以得到更多的质粒，但是以质粒纯化柱的容量20微克为限。
f. 检查菌种本身是否有问题。
一方面，可以用抽提过的好的菌种作一个正对照用我们的试剂盒抽提看能否得到预期量的质粒。
另一方面，可以用其它方法，如常规的碱裂解方法抽提相同的菌，看菌本身及生长条件是否有问题。
g. 溶液I加入后一定要充分悬浮细菌，要保证看不到结块的菌，否则细菌不易被裂解，质粒产量会显著下降。
h. 洗脱液最好使用闪晶生物提供的洗脱液，不要使用重蒸水或MiliQ水洗脱，如用水洗脱，一定要保证水的pH值在8.0-8.5之间。
如果洗脱液使用时间较长，并且盖子经常不盖紧，由于空气中的二氧化碳的作用会使洗脱液酸化，使pH值低于8.0。
如发现洗脱液pH值低于7.5请不要再使用。
可以改用pH8.0的TE或pH值在8.0-8.5之间的水。
i. 在加入溶液IV（即洗涤液）后需离心15秒，倒弃收集管内液体后，需再离心1分钟。
千万不能把两次离心合并，仅离心一次，否则会因为洗涤液的污染，而导致产量下降或抽不到质粒。
质粒抽提常见问题与解答
1.没有提出质粒或者质粒收获量很低A菌种老化建议：对于甘油保存的菌种，需要先进行活化，涂布或者划线菌种，重新挑选单菌落进行液体培养，并对菌种进行初摇活化，按照1:500的比例进行菌种培养。
二次培养时间最好不要超出16小时(或者OD600不超过3.0)。
B低拷贝质粒建议：如果是由于低拷贝质粒引起的质粒收获量低，可以采用两倍的菌体量，并相应增加各种Buffer的用量。
C质粒丢失建议：某些质粒在次继代培养的过程中会出现丢失的想象，另外检查筛选抗生素的浓度是否正确。
D裂解不充分建议：如果采用超过推荐量的菌体进行质粒制备，会导致菌体裂解不充分。
可适当减少菌体的用量或者相应增大各种Buffer的用量。
并确保细菌混悬均匀。
EBuffer中有沉淀未溶解建议：BufferB1和BufferN1，BufferC1在温度较低时会出现沉淀，使用前请检查是否有沉淀生成，如果有沉淀生成，请置于37℃温育片刻，待溶液澄清后使用。
FDNAWashBuffer中未加入要求量的乙醇建议：按照说明书要求加入要求量的无水乙醇，使用后旋紧瓶盖，防止乙醇挥发。
另外对于质粒中提，大提等，要求用70%乙醇洗涤，请确保乙醇的体积不小于70%。
G离心柱中乙醇残留建议：漂洗后，可适当延长离心时间，尽量去除残留的乙醇。
另外对于质粒中提，大提和朝大量提取，建议离心后，将柱子或大漏斗用吹风机冷风吹片刻(或置于65℃烘箱)，以彻底去除残留的乙醇，便于洗脱和后续实验操作。
H洗脱液加入位置不正确建议：洗脱液应加在膜中央，已取得最好的洗脱效果。
I洗脱液pH值不正确建议：将DNA从柱子上洗脱下来的最适pH值在7.0-8.5之间，如果洗脱液的pH超出此范围将会显著影响洗脱效果，请使用试剂盒配套的ElutionBuffer(pH8.5，10mMTris-HCl)进行洗脱，如果用ddH2O进行洗脱，请确保pH在7.0-8.5之间。
J洗脱体积的选择建议：洗脱体积将会影响最终的收获量，洗脱体积越大，收获量越高，但是浓度将会降低。
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质粒提取常见问题解析涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死？参考见解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。
蘸了酒精后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒。
建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再涂。
同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。
原先测序鉴定没有问题的细菌，37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常?参考见解：这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。
解决办法：1、降低培养温度，在20～25℃下培养，或室温培养可明显减少发生概率。
2、使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使得质粒复制更加稳定。
3、质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH浓度过高造成的，请大家注意一下！【有两种方法可以在提质粒前判断菌生长是否正常：1、利用你的嗅觉。
只要平时做实验仔细点就能闻出大肠杆菌的气味，新鲜的大肠杆菌是略带一点刺鼻的气味，但不至于反感。
而在泥水状的菌液中你只要一凑过去就感觉到其臭无比或者没有气味，可以和正常菌液对照。
2、肉眼观察活化菌株。
对于生长不正常的菌液进行划板验证或者稀释到浓度足够低涂板，第二天观察单克隆生长情况，LB平板生长的DH5A正常形态在37℃16h后直径在1mm左右，颜色偏白，半透明状，湿润的圆形菌斑，如果观察到生长过快，颜色又是泛黄的话基本上不正常了。
】未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？参考见解：1、大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。
2、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。
??3、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。
例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。
另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。
4、碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液的用量。
对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液，可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。
5、溶液使用不当：溶液2和3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。
6、吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。
若用富集培养基，例如TB或2×YT，菌液体积必须减少；若质粒是非常高的拷贝数或宿主菌具有很高的生长率，则需减少LB培养液体积。
7、质粒未全部溶解(尤其质粒较大时) ：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。
8、乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。
9、洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。
10、洗脱液不合适：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB(10mM Tris-HCl, 1mMEDTA，或水。
洗脱效率还取决于pH值，最大洗脱效率在间。
当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。
洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用，有利于提高洗脱效率。
11、洗脱体积太小：洗脱体积对回收率有一定影响。
随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。
为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。
12、洗脱时间过短：洗脱时间对回收率也会有一定影响。
洗脱时放置1min可达到较好的效果。
细菌离心加入溶液I蜗旋振荡后，发现菌体呈絮状不均匀或呈细砂状？参考见解：1、很可能是细菌发生溶菌，可减少培养时间或者试试平板培养，质粒提取前用PBS将菌落洗下，相较来说固体培养基上细菌生长的要好一些。
2、质粒抽提过程很大程度上是受细菌生长情况决定的，刚活化的菌比负80℃保存菌种所培养出来的菌液状态好，保存久的菌株可能会造成质粒浓度低，质粒丢失等不明原因。
3、判断生长的菌液是否正常，可以用肉眼观察，在光线明亮处摇荡新鲜培养液，如果发现菌液呈漂絮状，情况很好。
如果发现呈泥水状，即看不到絮状，只是感觉很浑浊，则可能提不出好的质粒，或者没有质粒。
4、菌液不宜生长太浓，摇床速度不宜过高。
达到OD600 就可以了，（尤其是对于试剂盒提取要注意）另外如果只是简单的酶切验证根本无需酚氯仿抽提（安全考虑，慎重），只要溶液I/ II /III比例恰当，转管过程仔细吸取不会有太多杂志。
为什么加了溶液Ⅱ后，菌体没有逐渐由混浊变澄清？提出来的条带几乎没有，但是RNA很亮（没加RNA酶）？溶液Ⅱ主要就是NaOH，如果菌液没有由混浊变澄清，参考见解：1、可能是因为溶液储存不当，或屡次操作没有及时盖好溶液瓶盖，导致其吸收空气中的CO2失效。
RNA在菌体中量较多，相对少量的菌体裂解，可有较DNA明显的条带。
2、可能是菌量大，加溶液Ⅱ后，菌体并不能完全裂解，所以没有变清，这也会导致质粒产率低下．3、可能是质粒的拷贝数不高，质粒产率不高．如果是使用自己配的试剂，建议做中提或大提；或者买试剂盒提．用自己配的试剂，不加RNA酶，最后RNA是很亮的，要去除干净就要用比较好的ＲＮＡ酶。
4、如果不是试剂的原因，可能是质粒表达的过程中使膜蛋白变化（数量变多），很难使用碱裂解法，可以尝试用其他比较剧烈的方法(比如高温或者低温研磨等),然后使用一般的发放。
5、可能质粒随乙醇一起倒掉了。
加入溶液II后，菌液仍然呈浑浊状态，或者混浊度没有明显的改变？裂解不完全,参考见解：1、问题可能是发生在溶液II上。
首先看看10％SDS是否是澄清的？NaOH是否是有效的？如果使用的是试剂盒，也要首先确认溶液II是否澄清没有沉淀？2、可能是细菌浓度很高，适当调整增加溶液I/II/III的体积。
3、可能是“杂菌”污染，如果菌液生长异常快，就有可能被杂菌污染。
这种情况一般表现为和目的菌有相同的抗性，生长速度异常，能够提出质粒，跑胶的条带也异常的亮，但产物不是自己想要的质粒，要特别注意一下。
抽提DNA去除蛋白质时，为什么要是酚/氯仿混合使用？怎样使用酚与氯仿较好？参考见解：酚与氯仿都是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。
经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA 分开。
而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。
??作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。
所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。
经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。
也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。
呈粉红色的酚可否使用？如何保存酚不被空气氧化？参考见解：保存在冰箱中的酚，容易被空气氧化而变成粉红色的，这样的酚容易降解DNA，一般不可以使用。
为了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羟基喹琳至终浓度为％。
8-羟基喹琳是带有淡黄色的固体粉末，不仅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金属离子的弱螯合剂。
用Tris 水溶液饱和后的酚，最好分装在棕色小试剂瓶里，上面盖一层Tris水溶液或TE缓冲液，隔绝空气，以装满盖紧盖子为宜，如有可能，可充氮气防止与空气接触而被氧化。
平时保存在4℃或－20℃冰箱中，使用时，打开盖子吸取后迅速加盖，这样可使酚不变质，可用数月。
为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊醇？参考见解：在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。
加入异戊醇能降低分子表面张力，可以降低抽提过程中的泡沫产生。
一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比。
也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。
加入酚/仿抽提，离心后在水相和有机相间没有出现变性蛋白相层，在随后的乙醇沉淀步骤中却出现大量的半透明沉淀，溶解后发现蛋白浓度很高？乙醇沉淀时，较纯的质粒沉淀是白色的（PEG纯化的沉淀是透明的肉眼不易发现），如沉淀是半透明的凝胶状，则应是蛋白含量高。
参考见解：首先看看平衡酚是否已被氧化？pH是否是？其次检测溶液III反应完成后的离心上清pH是否在左右？有时由于溶液III配置的问题，会出现溶液III反应后离心的上清pH与偏差较大的现象，这会降低平衡酚抽提蛋白抽的有效性，pH偏差过大也会导致水相和平衡酚互溶。
使用酚仿抽提方法，质粒的纯度很好，但酶切不能完全切开?参考见解：1、确认酶的有效性。
2、平衡酚是否被氧化（正常是黄色，而氧化后是棕色的）。
3、是否不小心吸入了痕量的酚。
4、乙醇沉淀后，70%乙醇漂洗的是否充分（残留的盐类会影响酶切）。
5、乙醇漂洗后是否完全干燥（残留的乙醇会影响酶切）。
碱裂解法提取的质粒DNA进行琼脂糖电泳进行鉴定时，看到的三条带分别是什么？参考见解：碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA，得到的三条带是以电泳速度的快慢排序的，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。
如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。
提取质粒中RNA没有去除？可能是RNase失效或效率不高。
参考见解：1、更换RNase A，并保证其储存条件是正确的2、手工提取质粒的，可单独增加一步去除RNA的步骤，溶液III反应后，在离心的上清中加RNase，室温下去除RNA 10min～30min（需要保证RNase A是经过失活DNase的），同时较高温度（如50℃）会更加快速完全的去除RNA，经验所得经过高温处理的质粒质量不是很高。
提取的质粒电泳后，为连续的一片火箭状？参考见解：1、质粒如果盐离子多，会有走胶变形的现象，如果提到的质粒不够纯，会有电泳条带不平齐的现象。
2、当电压太大时，容易出现火箭状，而降解应该是弥散状。
3、可能是宿主菌影响的，质粒抽提好后，用酚-氯仿处理一下再酶切，若有改善，则为宿主菌影响。
转化到其它宿主菌再切。
4、 NaOH的浓度过高，会出现火箭状的结果。
用碱裂解法提取质粒，裂解5分钟，没有用酚 / 氯仿抽提，最后用灭菌水溶解质粒DNA15min。
双酶切后跑胶一条带都没有，原因是什么？参考见解：1、溶解时间稍微短了点，但是根据各个实验室RNase不同，这个条件是不同的。