细胞增殖毒性实验步骤cck8知识讲解
CCK_8操作说明及检测步骤
CCK_8操作说明及检测步骤CCK-8是一种常用的细胞增殖和细胞毒性检测方法，该方法通过评估细胞内脱氢酶的活性来间接反映细胞的代谢活性。
其操作步骤如下：1.常规细胞培养选择要测试的细胞系，并在合适的培养基中进行培养。
通常使用细胞培养瓶或培养皿，并在37摄氏度的培养箱中保持恒定的温度。
确保培养基中含有足够的养分和补充物，以支持细胞的正常生长和代谢。
2.细胞计数和均匀分布细胞生长到适当的密度后，使用显微镜和细胞计数板计数细胞数目。
根据需求，将细胞以适当比例分装到不同的瓶中，再将细胞以适当比例分装到96孔板中，以保证每个孔中的细胞数量和均匀分布。
3.平台适应性试验在进行正式的实验前，可以进行平台适应性试验。
为此，将不同细胞浓度的细胞悬液加入到96孔板中，并使用CCK-8试剂进行处理。
根据CCK-8处理后的细胞的吸光度读数，选择适当的浓度范围和时间点进行后续实验。
4.细胞处理在进行CCK-8实验之前，确保细胞在适当的生长条件下。
将上一步骤中准备好的细胞悬液加入到96孔板中，使每个孔中的细胞数目均匀分布。
可以提前设计不同实验组的处理方式，如对照组、实验组和阴性对照组等。
K-8处理按照CCK-8试剂说明书的建议将CCK-8试剂加入到96孔板中的每个孔中。
通常建议每个孔中加入10%的CCK-8试剂，并与细胞悬液充分混合。
注意避免气泡的产生。
6.孵育将96孔板放置在37摄氏度的培养箱中，孵育一段时间。
孵育时间可以根据实验要求设定，通常为1-4小时。
7.吸光度测量使用酶标仪或多功能板读取器测量每个孔的吸光度值。
通常使用450纳米的波长进行测量。
根据吸光度值的变化，可以评估细胞的代谢活性，并进行细胞增殖或毒性分析。
通过以上步骤，可以使用CCK-8试剂评估细胞的增殖和毒性。
这种方法快速、简单且灵敏，被广泛应用于细胞实验中。
需要提醒的是，在进行实验前要仔细阅读CCK-8试剂的使用说明，并根据实际情况进行操作。
CCK_8操作说明及检测步骤
CCK_8操作说明及检测步骤CCK-8是一种常用的细胞增殖和细胞毒性检测方法，可以评估药物、毒物和其他试剂对细胞增殖的影响。
本篇文章将介绍CCK-8实验的操作说明及检测步骤。
实验材料：1.细胞培养物：包括细胞培养基和要检测的细胞系。
K-8试剂盒：包括CCK-8试剂和添加剂（如无血清培养基）。
实验步骤：1.细胞预处理：a.将细胞接种在培养皿中，使其达到对数生长期。
b.用PBS洗涤细胞，以去除培养基中的血清和其他杂质。
c.加入细胞培养基（如无血清培养基）孵育一天以适应新的生长条件。
K-8溶液的制备：a.从CCK-8试剂盒中取出所需量的CCK-8试剂。
b.按照试剂盒说明书中的方法，将CCK-8试剂溶解于适当的溶剂中，以获得CCK-8溶液。
3.细胞处理：a.在细胞培养皿中加入适量的处理组（含药物/毒物/试剂）和阴性对照组（不含处理）。
b.孵育细胞以使其与处理组接触，一般孵育24小时。
c.如果需要在不同时间点进行测量，可以设置不同的处理时间。
4.检测步骤：a.将培养皿从孵育器中取出，加入CCK-8溶液。
一般将CCK-8溶液与培养基混合，使浓度为10%。
b.返回孵育器中继续孵育15至60分钟，以使CCK-8溶液充分与细胞相互作用。
c. 使用酶标仪测量细胞的吸光度。
一般使用450nm波长进行检测。
d.记录各处理组的吸光度值。
5.数据分析：a.根据实验要求，选择合适的数据分析方法。
常用的包括比较各示踪实验组与阴性对照组之间的吸光度差异，或者使用半数抑制浓度（IC50）来评估样品对细胞增殖的影响。
b.绘制呈现实验结果的图表和图形。
c.进行统计分析，如t检验或方差分析，并计算显著性水平。
注意事项：1.操作前应严格按照实验室安全规定进行，佩戴实验室所需的个人防护设备。
2.在各步骤中，应尽量避免细胞暴露在环境中的时间过长，以减少细胞的应激反应。
3.操作时要注意使用无菌环境和无菌操作，以防止细胞污染。
4.实验中的所有操作必须根据实验室方法进行，避免任何操作的偏差。
CCK8检测细胞增殖毒性的原理、方法及注意事项.pptx
高
很高
很高
高
检测时间
较长
较短
较短
最短
检测波长 细胞毒性
560-600nm 420-480nm 420-480nm 430-490nm
高，细胞形态 很低，细胞形 很低，细胞形 很低，细胞形
完全消失
态不变
态不变
态不变
试剂稳定性
一般
较差
一般Байду номын сангаас
很好
批量样品检测
可以
非常适合 非常适合 非常适合
便捷程度
一般
便捷
便捷
4
CCK8 检测细胞增殖/毒性的原理、方法及注意事项
一、CCK8 检测细胞增殖/毒性的原理
Cell Counting Kit-8（ 简 称 CCK-8） 试 剂 可 用 于 简 便 而准 确的 细胞 增 殖 和 毒 性 分 析 。 其 基 本 原 理 为 ：该 试 剂 中 含 有 WST-8【 化 学 名 ：2-(2-甲 氧 基 -4-硝 基 苯 基 )-3-(4-硝 基 苯 基 )-5-(2,4-二 磺 酸 苯 )-2H-四 唑 单 钠 盐 】， 它 在 电 子 载 体 1-甲 氧 基 -5-甲 基 吩 嗪 鎓硫 酸 二甲 酯 （1-Methoxy PMS） 的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物 （ Formazan dye）。生 成 的 甲 瓒 物 的 数 量 与 活 细 胞 的 数 量 成 正 比 。因 此 可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
• 金 属 对 CCK-8 显 色 有 影 响 ：当 终 浓 度 为 1 mM 的 氯 化 亚 铅 、 氯 化 铁 、硫 酸 铜 会 抑 制 5%、15%、90%的 显 色 反 应 ，使 灵 敏 度 降 级 。 如果终浓度是 10 mM 的话，将 会 100%抑制。
细胞增殖毒性实验步骤cck8知识讲解
如有侵权请联系网站删除细胞增殖-毒性实验步骤1、细胞传代、细胞计数、细胞增殖-毒性实验步骤：实验准备：用75%酒精擦生物安全柜台面2遍，紫外线消毒30分钟（枪、枪头、15ml及50ml离心管、剪刀、封口膜、记号笔、打火机、酒精灯、培养瓶），复温实验所需试剂［细胞培养液（DMEM、1640）、磷酸缓冲盐溶液（PBS、胰酶（0.25% Trypsin-EDT）胎牛血清（FBS、双抗］，所有的试剂、仪器放入生物安全柜前要用酒精喷洒消毒。
显微镜下看细胞生长状态，有无污染。
1、倒去培养瓶内的培养液；2）加入PBS 2ml洗涤培养瓶内细胞2次；3）加入胰酶500ul/0.5ml 2〜10min （具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脱落）；4）加入含10%FBS勺培养液1〜1.5ml［培养液：胰酶=（2〜3）:1］中和胰酶；5）轻轻吹打成单细胞悬液，吹打力度以不起气泡为宜；6）将单细胞悬液吸入10〜15ml离心管中，低速离心800rpm 3分钟，倒去上清液；7）加入含10%FBS ffl胞培养液1〜2ml吹打悬浮细胞至单细胞悬液；8）吸取20ul细胞悬液（10ul细胞悬液+10ul台盼兰液：给坏死细胞染色，判断细胞活力）至细胞计数板，进行细胞计数；CCK-8实验：9）在96孔板中，给每孔加100卩L （约7000个）的细胞悬液，将培养板放在培养箱预培养24-72 小时（37 C，5%CO2,使细胞贴壁；10）向培养板中加入10卩L不同浓度（5、10、20、40、80、160ug/ml）的待测药物；11）将培养板在培养箱孵育一段适当的时间24小时（例如：6、12、24或48小时）（药物起作用）；注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。
当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
实验专栏丨一文掌握CCK-8细胞增殖与毒性检测法，你值得了解！
实验专栏丨一文掌握CCK-8细胞增殖与毒性检测法，你值得了解！今天小编要为大家介绍的是：CCK-8实验的操作步骤和注意事项。
CCK-8，英文全称是Cell Counting Kit-8。
CCK-8试剂盒可用于简便而准确的细胞增殖和细胞毒性分析。
实验原理CCK-8试剂盒中，最主要化学药品是WST-8【化学名为2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）存在的情况下，能够被细胞线粒体内的一些脱氢酶还原成具有高度水溶性的橙黄色甲臜染料(Formazan)。
也就是说，活细胞数量越多，生成的甲臜量就越多，相应地颜色也就越深。
因此可以用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析：细胞增殖越快，颜色越深；细胞毒性越大，颜色则越浅。
（对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。
）使用酶标仪在450nm波长处测OD值，可间接性反应活细胞的数量。
是一种高灵敏度，无放射性的比色检测法。
（CCK-8实验原理）因此，CCK-8实验可用于细胞因子等诱导的细胞增殖检测，也可以用于抗癌药物等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测，或一些药物诱导的细胞生长抑制检测。
操作步骤（一）实验材料及试剂：酒精灯、移液枪、酶标仪（带有450nm滤光片）、96孔培养板、CO2培养箱、CCK-8、细胞计数板、PBS等。
（二）绘制标准曲线1.制备细胞悬液：选取生长状态良好的对数生长期细胞制作细胞悬液，并计数。
2.在96孔板中接种细胞悬液(100 μL/孔) ：按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做5-7个细胞浓度梯度（比如，稀释10倍，100倍......），每组4-6个复孔。
3.绘制标准曲线：接种后培养一定时间待细胞贴壁后，然后每100μL培养基加10μL（10%）CCK-8试剂培养一定时间后测定OD 值，制作出一条以细胞数量为横坐标，OD值为纵坐标的标准曲线。
CCK-8实验步骤
CCK8检测细胞增殖/毒性的原理
Cell Counting Kit-8
●原理：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝
基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。
生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。
因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
●方法
1、制备细胞悬液：细胞计数
2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数（每孔5000细胞），每孔约100ul 细胞悬液，同样的样本可做3个重复。
3、37℃培养箱中培养：24h-48h
4、加入10ul CCK8,孵育2-4h
5、测定450nm吸光度。
CCK8实验原理与步骤
CCK8实验原理与步骤CCK-8是一种常见的细胞活力检测方法，常用于评估细胞增殖和细胞毒性等生物学活性。
实验原理：CCK-8试剂是一种黄色噻唑-二苯基甲烷盐的溶液，它能够在有活细胞存在时被细胞内的酶还原成橙色水溶性的产物。
这种产物可以通过光度计测量，从而得到细胞的活力信息。
细胞活力高时，细胞内有较多的酶可以将CCK-8还原成产物，产生较高的吸光度；细胞活力低时，细胞内酶的活性降低，无法完全还原CCK-8，产生较低的吸光度。
实验步骤：1.细胞培养：将待测细胞株接种到含有适宜培养基的培养皿或孔板中，并在恒温、湿润、含有5%CO2的培养箱中孵育。
2.实验前处理：根据实验设计的需要，可进行细胞预处理，如给药、感染等。
预处理时间根据需要确定。
K-8试剂准备：将CCK-8试剂按照用户手册的要求溶解成适合实验设计的浓度。
注：部分实验可能需要调整试剂的浓度，应根据实验要求进行调整。
K-8试剂加样：对不同组的培养皿或孔板分别加入适量的CCK-8试剂，使其与培养基均匀混合。
一般情况下，加入的CCK-8试剂量为培养基总量的10%。
5.孵育CCK-8与细胞的反应：将含有CCK-8试剂的培养皿或孔板放回恒温、湿润、含有5%CO2的培养箱中继续孵育。
孵育时间根据实验需要确定，一般为1-4小时。
6. 吸光度测定：使用酶标仪或光度计测定吸光度（OD）值，一般在450nm波长下测定。
同时，记录对照组（如细胞温育组）的OD值作为参照。
7.数据处理与分析：根据实验设计，采用合适的统计学方法，比较各组的细胞活力差异，并将数据结果进行图表展示。
注意事项：K-8试剂对皮肤、眼睛、呼吸道等有刺激性，请注意安全操作；2.实验前需进行细胞的适宜密度的培养，以保证其在实验过程中的稳定生长状态；3.在实验中注意培养条件的一致性，如温度、湿度、CO2浓度等；4.参照组的选择要慎重，需要与实验对象具有相同的培养条件；5.准备稀释CCK-8试剂时，避免过长时间暴露于光线和空气中，以免降低其效力。
CCK8实验原理与步骤
CCK8实验原理与步骤CCK8实验是一种常用的细胞增殖和生存能力检测方法，可以用来评估其中一种物质对细胞生长的影响。
其原理是利用CCK8（Cell Counting Kit-8）荧光染料，通过还原因子将细胞内的NAD+ 还原为NADH，形成有色溶液，并使用分光光度计检测其吸光度，从而判断细胞的增殖和生存能力。
下面将详细介绍CCK8实验的步骤和原理。
实验材料和设备：1.细胞培养基（例如DMEM）K8试剂3.96孔板4.分光光度计5.无菌移液器和组织培养器具6.细胞类型需要的培养器具实验步骤：1.将细胞悬液以适当的浓度移植到96孔板中，使每个孔中有约10,000个细胞。
每个组设置至少3个重复。
2.孔板放入细胞培养箱中，使细胞与培养基充分接触，以37°C、5%CO2条件下培养一定的时间，使细胞附着并生长。
3.在培养一定时间后，取出培养板，将培养基倒出，用PBS洗涤细胞1-2次，使细胞处于无血清的状态。
4.加入含有CCK8试剂的培养基，使其与细胞接触，通常含有CCK8的培养基的体积约为培养基的10%。
5.将孔板放回培养箱中，继续孵育15-30分钟，以确保细胞充分反应。
6. 使用分光光度计检测每个孔的吸光度值（一般在450 nm波长处读取），得到吸光度值（OD值）。
7.通过比较吸光度值，得到不同处理组与对照组之间的生长差异，以评估物质对细胞的生存与增殖能力的影响。
实验原理：CCK8荧光染料是一种由WST-8 （Water-Soluble Tetrazolium Salt-8）还原剂构成的形式。
当CCK8溶液与细胞相互作用时，细胞内的细胞呼吸负责NADH的还原作用，将CCK8还原为可溶性的有色产物，形成橙红色溶液。
还原作用的化学方程式为：NAD++C12H7N4O2S·H2O→NADH+H++C12H8N4O2S在反应后的溶液中，由于产生的橙色产物在450 nm波长处具有明显的吸光度，可通过分光光度计测量。
cck8具体操作流程
cck8具体操作流程
以下是使用CCK8试剂盒进行细胞活力检测的步骤：
1. 准备细胞：取生长状态良好的细胞制备成一定浓度的细胞悬液。
如果是贴壁细胞，需要37℃培养箱进行预培养2-6小时等细胞贴壁后再开展实验，
如果是悬浮细胞，不需要预培养。
2. 制备培养基：在无酚红DMEM高糖培养基中加入双抗、谷氨酰胺和血清。
3. 准备96孔板：根据实验需求，准备适当数量的96孔板。
每孔加入
100ul细胞悬液，通常细胞增殖实验每孔加入2×10³个/100ul 细胞，细胞
毒性实验每孔加入5×10³个细胞/100ul。
如果是贴壁细胞，可以直接在96
孔板中进行实验，如果是悬浮细胞，需要离心后取沉淀进行实验。
4. 加药处理：根据实验需求，在各组细胞中加入不同浓度的药物或对照组不加药。
5. 孵育：将96孔板放入37℃培养箱中孵育一定时间，通常为24小时。
6. 检测：在检测前，将CCK8试剂加入96孔板中，轻轻混匀后继续孵育1-4小时。
然后使用酶标仪测定各孔在450nm处的吸光度，记录数据并计算
细胞活力。
以上步骤仅供参考，具体操作请根据实验需求和实际情况进行调整。
CCK-8操作说明和检测步骤
DOJINDO操作说明细胞活性检测1.在96孔板中接种细胞悬液(100 ml /孔)。
将培养板放在培养箱预培养(在37℃，5% CO2的条件下)。
2.向每孔加入10 ml的CCK- 8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响值的读数)。
3.将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
4.用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。
5.如果暂时不测定值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10 ml M HCl溶液或者1% w/vSDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。
在24小时内吸光度不会发生变化。
细胞增殖-毒性检测1. 在96 孔板中配制100 ml的细胞悬液。
将培养板在培养箱预培养24小时( 在37℃，5% CO2的条件下)。
2. 向培养板加入10 ml不同浓度的待测物质。
3. 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间(例如: 6,12, 24 或48小时)。
4. 向每孔加入10 ml CCK-8 溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响值的读数) 。
5. 将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
6. 用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。
7. 如果暂时不测定值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10 ml M HCl溶液或者1% w/vSDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。
在24小时内吸光度不会发生变化。
注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK-8之前更换新鲜培养基，去掉药物的影响。
当然药物影响比较小的情况可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
制作标准曲线1. 先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。
2. 按比例( 例如：1/2比例) 依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每组3-6个复孔。
3. 接种后培养2-4 小时使细胞贴壁，然后加CCK-8试剂培养一定时间后测定值，制作出一条以细胞数量为横坐标(X轴) ，值为纵坐标(Y轴) 的标准曲线。
细胞增殖毒性实验步骤cck8知识讲解
细胞增殖毒性实验步骤cck8知识讲解如有侵权请联系网站删除细胞增殖-毒性实验步骤1、细胞传代、细胞计数、细胞增殖-毒性实验步骤：实验准备：用75%酒精擦生物安全柜台面2遍，紫外线消毒30分钟（枪、枪头、15ml及50ml离心管、剪刀、封口膜、记号笔、打火机、酒精灯、培养瓶），复温实验所需试剂［细胞培养液（DMEM、1640）、磷酸缓冲盐溶液（PBS、胰酶（0.25% Trypsin-EDT）胎牛血清（FBS、双抗］，所有的试剂、仪器放入生物安全柜前要用酒精喷洒消毒。
显微镜下看细胞生长状态，有无污染。
1、倒去培养瓶内的培养液；2）加入PBS 2ml洗涤培养瓶内细胞2次；3）加入胰酶500ul/0.5ml 2?10min （具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脱落）；4）加入含10%FBS勺培养液1?1.5ml［培养液：胰酶=（2?3）:1］中和胰酶；5）轻轻吹打成单细胞悬液，吹打力度以不起气泡为宜；6）将单细胞悬液吸入10?15ml离心管中，低速离心800rpm 3分钟，倒去上清液；7）加入含10%FBS ffl胞培养液1?2ml吹打悬浮细胞至单细胞悬液；8）吸取20ul细胞悬液（10ul细胞悬液+10ul台盼兰液：给坏死细胞染色，判断细胞活力）至细胞计数板，进行细胞计数；CCK-8实验：9）在96孔板中，给每孔加100卩L （约7000个）的细胞悬液，将培养板放在培养箱预培养24-72 小时（37 C，5%CO2,使细胞贴壁；10）向培养板中加入10卩L不同浓度（5、10、20、40、80、160ug/ml）的待测药物；11）将培养板在培养箱孵育一段适当的时间24小时（例如：6、12、24或48小时）（药物起作用）；注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。
当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
同仁CCK8操作说明与检测步骤
同仁CCK8操作说明与检测步骤一、同仁CCK-8操作说明1.实验前准备a.所需试剂：CCK-8试剂（CCK-8粉末和生理盐水），细胞培养基。
b.试剂的保存：CCK-8试剂应存放在4℃的暗处，避免阳光直射。
c.培养细胞：根据实验需要，选择适当的细胞株，并根据细胞培养的常规方法进行培养。
2.实验步骤a.细胞预处理：将细胞种植于24孔板中，使其达到合适的细胞密度和培养状态。
b.添加CCK-8试剂：将CCK-8试剂溶解于适量的生理盐水中，使浓度达到所需浓度。
注意：CCK-8试剂的浓度会根据实验要求而有所不同。
c.添加CCK-8溶液：将CCK-8溶液均匀地滴加到细胞培养基中，注意不要形成气泡。
d.孵育细胞：将孔板放入培养箱中，以适当的温度和湿度进行培养，一般为37℃、5%CO2的条件下孵育1-4小时。
e. 读取结果：使用酶标仪测量吸光度，一般在450 nm波长下测量。
3.结果解读a.根据吸光度结果，在坐标轴上绘制细胞种植数与实验时间的曲线图。
b.横轴表示实验时间点，纵轴表示吸光度值。
c.通过绘制的曲线图可以判断细胞的活力和增殖能力。
二、同仁CCK-8检测步骤在使用同仁CCK-8进行细胞增殖和细胞毒性检测时，一般按照以下步骤进行操作：1.细胞处理：将细胞培养在96孔板中，以合适的细胞密度和培养状态进行处理。
2.试剂添加：将CCK-8试剂溶解于适量的生理盐水中，确保浓度达到所需的浓度。
3.试样添加：在每孔中加入适量的试样，使试样浓度一致。
4.添加CCK-8溶液：将CCK-8溶液均匀地滴加到每个孔中，避免产生气泡。
5.孵育细胞：将孔板放入培养箱中，在适当的温度和湿度下培养，一般为37℃、5%CO2的条件下孵育1-4小时。
6. 结果读取：使用酶标仪测量吸光度，在450 nm波长下读取结果。
7.数据分析：根据吸光度结果，绘制细胞种植数与实验时间的曲线图，进行结果解读和数据分析。
总结：同仁CCK-8操作简便，检测敏感度高，广泛用于细胞增殖和细胞毒性研究。
CCK8实验原理与步骤
CCK8实验原理与步骤CCK-8实验（Cell Counting Kit-8）是一种常用的细胞增殖和细胞毒性测定实验方法。
CCK-8试剂可以通过还原机制，测量细胞内的活性代谢物质水平，从而评估细胞数量和活力。
以下是CCK-8实验的基本原理和步骤。
实验原理：CCK-8试剂中含有一种缩合的四氢噻唑并噻吩偶吡啉（WST-8）和电子传递剂1-甲基噻唑盐（MTS）。
细胞内的代谢酶可以将WST-8还原成橙红色的形成物形成溶液。
这个形成物可以通过光度计检测，并与细胞数量和代谢活性成正比。
所以，通过测量形成物的光吸收度，可以获得细胞的增殖和毒性信息。
实验步骤：1.细胞培养准备：将待测细胞分散在完全培养基中，并按照常规方法培养至适当的细胞密度。
2.细胞悬液准备：将培养的细胞用PBS缓冲液洗涤一次，然后用PBS 缓冲液重新悬浮至适当的浓度。
3.细胞计数：使用仪器（如细胞计数器）计数细胞的数目。
如果没有细胞计数器，则可以使用显微镜和计数板手工计数。
4.细胞接种：将细胞分散在细胞培养板或96孔板中，使得每个孔的细胞数目相等。
通常可以根据实验需求设定各组的重复孔数。
5.处理组别：根据实验设计，在每个组中添加不同浓度的药物处理。
同时设置一个对照组（只添加培养基），以便比较。
6.增殖处理：将细胞培养在适当的条件下（如37°C，5%CO2）孵育一定时间。
孵育时间取决于具体实验需求和细胞类型。
K-8试剂处理：在孵育结束后，添加CCK-8试剂到每个孔中，使其最终浓度达到指定浓度。
通常浓度为1/10到1/100倍的CCK-8试剂：细胞悬液体积。
在这个步骤中，也可以添加几种不同的浓度以确定最佳浓度应用于未来的实验。
8.孵育：将试验板放回培养箱中，继续孵育一段时间。
孵育时间可以根据实验设计确定，通常为2-4小时。
9. 吸光度测量：在孵育结束后，使用酶标读板机或其他光度计测量每个孔中形成物的吸光度。
根据实验目的，可以选择470nm或450nm波长。
CCK8检测细胞增殖毒性的原理及注意事项资料讲解
CCK8检测细胞增殖/毒性的原理、方法及注意事项一、CCK8检测细胞增殖/毒性的原理Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。
其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。
生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。
因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
用途：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验CCK8的优点：•使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；•CCK-8法能快速检测；•CCK-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度；•CCK-8法的重复性优于MTT 法；•CCK-8法对细胞毒性小；•CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。
CCK8的缺点：•与MTT法相比，CCK8和XTT的价格比较贵。
•CCK8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。
与以往的增殖/毒性测定试剂相比较：二、CCK8检测细胞增殖/毒性的方法实验一：细胞增殖分析1、制备细胞悬液：细胞计数2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做3个重复。
3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。
4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。
或者直接配置含10%CCK8的培养基，以换液的形式加入。
5、培养1-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。
CCK8检测细胞增殖毒性的原理、方法及注意事项.pptx
• 使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂； • CCK-8 法 能 快 速 检 测 ； • CCK-8 法 的 检 测 灵 敏 度 很 高 ，甚 至 可 以 测 定 较 低 细 胞 密 度 ； • CCK-8 法 的 重 复 性 优 于 MTT 法 ； • CCK-8 法 对 细 胞 毒 性 小 ； • CCK-8 细 胞 活 性 检 测 试 剂 中 为 1 瓶 溶 液 ， 毋 需 预 制 ，即 开 即 用 。 CCK8 的缺点： • 与 MTT 法 相 比 ， CCK8 和 XTT 的 价 格 比 较 贵 。 • CCK8 试 剂 的 颜 色 为 淡 红 色 ，与 含 酚 红 的 培 养 基 颜 色 接 近 ，不 注
注：
• 若 暂 时 不 测 定 OD 值 ，可 以 向 每 孔 中 加 入 10 μL 0.1M 的 HCL 溶 液 或者 1% w/v SDS 溶 液 ，并遮盖培养板避光保存在室温条件 下。 24 小时内测定，吸光度不会发生变化。
• 如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加 CCK8 之前更换新 鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新 的培养基）， 去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可 以 不 更 换 培 养 基 ，直 接 扣 除 培 养 基 中 加 入 药 物 后 的 空 白 吸 收 即 可 。
三、CCK8 检测细胞增殖/毒性的注意事项
• 当使用标准 96 孔 板时 ，贴壁 细胞 的最 小接 种量 至少 为 1,000 个 / 孔 (100 μl 培 养 基 )。检 测 白 细 胞 时 的 灵 敏 度 相 对 较 低 ，因 此 推 荐 接种量不低于 2,500 个/孔 (100 μl 培养基)。
CCK8实验原理与步骤
CCK8实验1、在96孔板中配置100μl的细胞悬液。
将培养板在培养箱预培养24小时（37℃，5% CO2）。
2、向培养板加入10μl不同浓度的待测物质。
3、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（例如：6、12、24或48小时）。
4、向每孔加入10μl CCK8溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。
5、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
6、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
7、若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μl 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。
24小时内测定，吸光度不会发生变化。
PS：1% w/v SDS溶液配制方法：组份浓度：10% (W/V)SDS配制量：100ml配制方法：1.称量10g高纯度的SDS置于100-200ml烧杯中，加入约80ml的去离子水，68℃加入溶解2.滴加浓盐酸调节pH值至7.23.将溶液定容至100ml后，室温保存。
注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。
当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
活力计算：细胞活力*（％）=[A(加药)-A（空白）]/[A（0加药）-A（空白）] ×100A（加药）：具有细胞、CCK8溶液和药物溶液的孔的吸光度A（空白）：具有培养基和CCK8溶液而没有细胞的孔的吸光度A（0加药）：具有细胞、CCK8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力CCK-8 可以用于细胞增殖和毒性分析。
其基本原理为:该试剂中含有WST-8，它在电子载体(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒染料，生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比,因此可以用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
完整版)CCK8实验原理与步骤
完整版)CCK8实验原理与步骤CCK8实验是一种常用的细胞增殖和毒性分析方法。
具体步骤如下：1.在96孔板中加入100μl的细胞悬液，并在培养箱中预培养24小时（37℃，5% CO2）。
2.向每个孔中加入10μl不同浓度的待测物质。
3.将培养板在培养箱中孵育一段适当的时间（例如6、12、24或48小时）。
4.向每个孔中加入10μl的CCK8溶液，注意不要在孔中生成气泡，因为它们会影响OD值的读数。
5.将培养板在培养箱中孵育1-4小时。
6.使用酶标仪在450nm处测定吸光度。
7.如果暂时不测定OD值，可以向每个孔中加入10μl的0.1M HCL溶液或1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。
24小时内测定，吸光度不会发生变化。
注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可以在加入CCK8之前更换新鲜培养基，去除药物影响。
如果药物影响比较小，可以直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
细胞活力计算公式为：细胞活力*（％）=[A(加药)-A（空白）]/[A（加药）-A（空白）]×100.其中，A（加药）为具有细胞、CCK8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度，A（空白）为具有培养基和CCK8溶液而没有细胞的孔的吸光度，A（加药）为具有细胞、CCK8溶液和药物溶液的孔的吸光度。
CCK-8试剂中含有WST-8，它在电子载体(1-MethoxyPMS)的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒染料，生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。
因此，可以用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
在细胞增殖试验中，需要在96孔板中加入100μl的细胞悬液，并在培养箱中预培养24小时（37℃，5% CO2）。
然后，在每个孔中加入10μl的CCK-8试剂。
最后，使用酶标仪在450nm处测定吸光度。
以上是CCK8实验的步骤和使用方法，希望对大家有所帮助。
1、确定种板数的方法是查阅文献，参考说明书，并稀释一系列浓度种板。
CCK8检测细胞增殖毒性的原理、方法及注意事项
CCK８检测细胞增殖/毒性得原理、方法及注意事项一、CＣK8检测细胞增殖/毒性得原理Cｅｌl Ｃouｎting Kiｔ—8(简称CCK－8)试剂可用于简便而准确得细胞增殖与毒性分析。
其基本原理为:该试剂中含有ＷSＴ—8【化学名:2—(２—甲氧基—４-硝基苯基)－3-(4-硝基苯基)-5—(2,4—二磺酸苯)－２H—四唑单钠盐】,它在电子载体1－甲氧基-5－甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(１—Ｍethｏxy PＭＳ)得作用下被细胞中得脱氢酶还原为具有高度水溶性得黄色甲瓒产物(Foｒmazａn dye)。
生成得甲瓒物得数量与活细胞得数量成正比。
因此可利用这一特性直接进行细胞增殖与毒性分析、用途:药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验ﻫCCK8得优点:•使用方便,省去了洗涤细胞,不需要放射性同位素与有机溶剂;•ＣCＫ-8法能快速检测;•CＣK—8法得检测灵敏度很高,甚至可以测定较低细胞密度;•ＣＣK－8法得重复性优于ＭTT法;•CCK－8法对细胞毒性小;•CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液,毋需预制,即开即用。
ﻫＣCＫ8得缺点:•与MＴT法相比,CCK8与XTT得价格比较贵。
•CCK8试剂得颜色为淡红色,与含酚红得培养基颜色接近,不注意得话容易产生漏加或多加。
ﻫ与以往得增殖/毒性测定试剂相比较:ﻫ检测方法MTT法XＴT法WST－1法CCＫ8法甲臢产物得水溶性差(需加有机溶剂溶好好好解)产品性状粉末2瓶溶液溶液1瓶溶液使用方法配成溶液后使用现配现用即开即用即开即用检测灵敏度高很高很高高检测时间较长较短较短最短检测波长560-６0０nm ４2０-48０nm４20-4８0nｍ4３0—490ｎm细胞毒性高,细胞形态完全消失很低,细胞形态不变很低,细胞形态不变很低,细胞形态不变试剂稳定性一般较差一般很好批量样品检测可以非常适合非常适合非常适合便捷程度一般便捷便捷非常便捷ﻫ二、CCK８检测细胞增殖/毒性得方法ﻫ实验一:细胞增殖分析1、制备细胞悬液:细胞计数2、接种到９6孔板中:根据合适得铺板细胞数,每孔约100ul细胞悬液,同样得样本可做3个重复。
CCK_8操作说明和检测步骤
DOJINDO操作说明细胞活性检测1.在96孔板中接种细胞悬液(100 ml /孔)。
将培养板放在培养箱预培养(在37℃，5% CO2的条件下)。
2.向每孔加入10 ml的CCK- 8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响O.D值的读数)。
3.将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
4.用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。
5.如果暂时不测定O.D值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10 ml 0.1 M HCl溶液或者1% w/vSDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。
在24小时内吸光度不会发生变化。
细胞增殖-毒性检测1. 在96 孔板中配制 100 ml的细胞悬液。
将培养板在培养箱预培养 24小时 ( 在37℃， 5% CO2的条件下 )。
2. 向培养板加入10 ml不同浓度的待测物质。
3. 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间 (例如: 6,12, 24 或48小时 )。
4. 向每孔加入10 ml CCK-8 溶液 (注意不要在孔中生成气泡，它们会影响 O.D值的读数) 。
5. 将培养板在培养箱内孵育 1-4小时。
6. 用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。
7. 如果暂时不测定O.D值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入 10 ml 0.1 M HCl溶液或者1% w/vSDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。
在 24小时内吸光度不会发生变化。
注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加 CCK-8之前更换新鲜培养基，去掉药物的影响。
当然药物影响比较小的情况可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
制作标准曲线1. 先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。
2. 按比例 ( 例如：1/2比例 ) 依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做 3-5个细胞浓度梯度，每组3-6个复孔。
3. 接种后培养2-4 小时使细胞贴壁，然后加 CCK-8试剂培养一定时间后测定 O.D值，制作出一条以细胞数量为横坐标 (X轴) ，O.D值为纵坐标 (Y轴) 的标准曲线。
CCK-8操作说明和检测步骤
DOJINDO操作说明细胞活性检测1.在96孔板中接种细胞悬液(100 ml /孔)。
将培养板放在培养箱预培养(在37℃，5% CO2的条件下)。
2.向每孔加入10 ml的CCK- 8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响O.D值的读数)。
3.将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
4.用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。
5.如果暂时不测定O.D值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10 ml 0.1 M HCl溶液或者1% w/vSDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。
在24小时内吸光度不会发生变化。
细胞增殖-毒性检测1.在96孔板中配制100 ml的细胞悬液。
将培养板在培养箱预培养24小时(在37℃，5% CO2的条件下)。
2.向培养板加入10 ml不同浓度的待测物质。
3.将培养板在培养箱孵育一段适当的时间(例如: 6,12, 24或48小时)。
4.向每孔加入10 ml CCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响O.D值的读数)。
5.将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
6.用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。
7.如果暂时不测定O.D值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10 ml 0.1 M HCl溶液或者1% w/vSDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。
在24小时内吸光度不会发生变化。
注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK-8之前更换新鲜培养基，去掉药物的影响。
当然药物影响比较小的情况可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
制作标准曲线1.先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。
2.按比例(例如：1/2比例)依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每组3-6个复孔。
3.接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后加CCK-8试剂培养一定时间后测定O.D值，制作出一条以细胞数量为横坐标(X轴)，O.D值为纵坐标(Y轴)的标准曲线。
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细胞增殖■毒性实验步骤
1、细胞传代、细胞计数、细胞增殖■毒性实验步骤：
实验准备：用75%酒精擦生物安全柜台面2遍，紫外线消毒30分钟（枪、枪头、
15ml及50ml离心管、剪刀、封口膜、记号笔、打火机、酒精灯、培养瓶），复温实验所需试剂［细胞培养液（DMEM、1640）、磷酸缓冲盐溶液（PBS、胰酶
（0.25% Trypsin-EDT）胎牛血清（FBS、双抗］，所有的试剂、仪器放入生物安全
柜前要用酒精喷洒消毒。
显微镜下看细胞生长状态，有无污染。
1、倒去培养瓶内的培养液；
2）加入PBS 2ml洗涤培养瓶内细胞2次；
3）加入胰酶500ul/0.5ml 2〜10min （具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脫落）；
4）加入含10%FBS勺培养液1〜1・5ml ［培养液：胰酶二（2〜3） :1］中和胰酶；5）轻轻吹打成单细胞悬液，吹打力度以不起气泡为宜；
6）将单细胞悬液吸入10〜15ml离心管中，低速离心800rpm 3分钟，倒去上清
液；
7）加入含10%FBSffl胞培养液1〜2ml吹打悬浮细胞至单细胞悬液；
8）吸取20』细胞悬液（10ul细胞悬液+10ul台盼兰液：给坏死细胞染色，判断细胞活力）至细胞计数板，进行细胞计数；
CCK-8实验：
9）在96孔板中，给每孔加100卩L （约7000个）的细胞悬液，将培养板放在培养箱预培养
24-72小时（37 C, 5%CO2,使细胞贴壁；
10）向培养板中加入10卩L不同浓度（5、10、20、40、80、160ug/ml）的待测药物；
11 ）将培养板在培养箱孵育一段适当的时间24小时（例如：6、12、24或48小时）（药物起作用）；
注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。
当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
12）向每孔加入10让（约10%） CCK-8溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）；
13）将培养板在培养箱内孵育1〜4小时（半小时测一次OD值）；14）用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
精品资料。