常用原代细胞培养方案
细胞培养的四个步骤
细胞培养的四个步骤细胞是组成生物体的基本单位，生物体由各种类型的细胞组成。
在显微镜下不同的细胞有不同的形态。
利用免疫荧光、流式荧光标记、免疫组化都能进行细胞观察。
培养细胞的最终目的：拿到细胞进行后续的下游实验WB、ELISA等蛋白检测DNA、RNA等分子检测凋亡、增殖、周期等功能检测原代细胞培养、冻存等细胞实验细胞培养几乎是所有细胞生物学实验的基础，细胞养得好，实验没烦恼！原代细胞培养，细胞的传代，冻存、复苏，细胞污染的防与治，我们的经验都在这篇文章里！一、细胞培养相关设备和试剂1、细胞培养的相关设备生物安全柜的安全保护等级>超净工作台，当涉及到病毒，需要使用生物安全柜。
生物安全柜：对柜内外的安全保护超净工作台：对工作台内部的安全保护超净工作台/生物安全柜的工作流程：2、细胞培养用相关试剂①培养基作用：人工模拟细胞体内生长的营养环境，维持细胞生长的营养物质，提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。
不完全培养基：直接购买或者配置的培养基。
完全培养基：不完全培养基+血清（提供营养物质）+双抗（保证无菌环境）+其他。
由于细胞种类和培养条件不同，适宜的合成细胞培养基也不同，在动物细胞培养中最常用基础细胞培养基有6～7种，如BME、MEM、DMEM、HAMF12、RPMI1640、199等。
②血清血清的功能：生长、分化必须的物质：生长因子、激素、基础培养基中没有的微量物质、小分子营养物转运维生素、脂类、金属离子和微量元素等；促进细胞贴壁、铺展；毒素灭活，蛋白质与有毒金属和热源物质结合；提供蛋白酶抑制剂；起酸碱度缓冲液作用。
血清的分类最常用的是胎牛血清。
胎牛还未接触外界，免疫系统激活最少，血清中所含的抗体、补体等对外来物质排斥最小，对细胞有害的成分最少。
③胰酶常用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA胰酶：胰脏中分离，选择性的水解蛋白质中有赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，最佳作用温度37℃，PH=8.0，常用浓度0.1%—0.25%，一般用不含Ca2+、Mg2+的平衡盐缓冲液配制（PBS或Hanks），可用含有血清培养基终止胰酶对细胞的作用（观察细胞的剥离状态确定终止时间）。
肿瘤细胞培养技术
EGF FGF NGF
5ng/ml 5ng/ml 5ng/ml
肿瘤细胞的培养
与常规细胞培养技术相同 一个细胞群体，存在多种亚群，复杂性 建株细胞较正常细胞易于培养
细胞分裂增殖的调控 （细胞周期）
多种基因的协同作用 调控因子：
基因：Cdc2、 cyclin 蛋白磷酸化 蛋白激酶的调控 胸苷激酶的调控 负调：DNA损伤与DNA修复：抑制抗性
体内：裸鼠或免疫功能抑制鼠，成瘤率、抑瘤 生长率、转移率、生存时间及死亡率
作用机理的研究：基因、蛋白、酶、标志、受体
肿瘤细胞培养的应用
肿瘤细胞的遗传特性：各种癌基因及抑 癌基因的分析、染色体定位（FISH法）
肿瘤细胞的生物学行为：细胞周期 （FACS)、信号传递
肿瘤细胞的标志与激素、受体变化（免 疫细胞化学、放射自显影、酶免疫、荧 光免疫、放射免疫、免疫印迹）
建株：生长半年以上，病理诊断、光镜及电 镜观察、生长特征、染色体分析、肿瘤标志、 致瘤及转移情况
注意：不是每一肿瘤组织都能建株
应用- 肿瘤治疗的研究
治疗药物敏感性的鉴定与筛选 肿瘤的多药耐药性的鉴定 各种新药治疗的实验研究
体外：肿瘤的生长（3HTdr掺入） 肿瘤的杀伤率（MTT、51Cr释放）
增生、吞噬碎片；第4~5天可见小堆 杂交瘤细胞生长。记录。 2. 融合后5~7天确认骨髓瘤细胞全部死亡， 毛细吸管吸出0.1ml ~ 0.15ml HAT， 换成同量HT培基。
单克隆抗体制备
七. 杂交瘤抗体检测： 培基变黄，杂交瘤细胞占孔底面积1/4、状
态好，可测上清液抗体（非分泌性比分泌性杂 交瘤长速快），及时测抗体及时克隆化，以免 目的杂交瘤丢失。
可溶性抗原：2~10g
细胞抗原：1 105
小鼠表皮细胞的原代培养细胞生物学
小鼠表皮细胞的原代培养细胞生物学综合设计性实验报告学院課程实验项目实验题目专业年级、班别姓名学号任课教师完成日期实验六细胞培养——小鼠表皮细胞的原代培养摘要目的探讨体外分离和培养小鼠表皮细胞的方法。
方法采用脱臼法处死新生小鼠，结合酶消化法和组织块法对新生小鼠表皮细胞进行了体外分离、培养。
（用眼科剪把新生小鼠表皮细胞组织剪成小于1mm3大小的植块，然后用胰蛋白酶消化5~10min，最后将组织块接种于培养瓶中进行体外培养。
）结果新生小鼠表皮细胞克隆2~3d后开始形成，细胞呈梭形，体外培养一个星期后仍能够保持良好的生长状态。
结论采用该方法能够实现对小鼠表皮细胞的体外原代培养，并且细胞贴壁生长的速度比单纯采用酶消化法和组织块法大大提高。
［1］关键词原代培养小鼠表皮细胞酶消化法组织块法21前言目的：初步了解动物细胞原代培养的基本方法、原理和基本操作过程，初步掌握无菌操作方法。
意义：细胞培养技术目前已经广泛地被应用于生物学的各个领域。
如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、病毒学等领域，已发展成为一种重要的生物技术。
为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的技术的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，并［2］对原代培养有一个基本概念。
方法：结合酶消化法和组织块法通过无菌操作培养新生小鼠细胞。
结果：运用这种方法成功并比较快速地培养出原代表皮细胞结论：这种方法为广泛开展表皮细胞原代培养奠定了基础。
2实验原理原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。
这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），用组织块培养法，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。
3实验用品3.1器材每小组：解剖剪、镊1套；眼科剪7把、眼科镊6把；吸管（如有条件，吸管最好由可消毒移液器及其Tip取代）：直、弯头各7支，2ml刻度吸管5支；吸管胶头：小18个、大6个；细胞培养瓶（或细胞培养皿）：小组人数+1个；青霉素瓶及瓶塞：小组人数+2个（其中一个用于分装胰酶液）；血细胞计数板1块,盖玻片;2～5ml注射器及注射针头1套；培养皿(用于解剖取材)：大、小各1套。
原代细胞培养：原代肝细胞
【嘉美生物】肝是生物转化和蛋白质合成的主要器官，也是药物毒性作用发挥的主要场所。
因此许多的体外测试都选用肝细胞来研究药物间的相互作用和其他一些生化过程。
嘉美生物用于培养原代细胞的组织采集于各大医院（包括协和医院、301医院、北三医院等），采集根据美国IRB 和HIPAA批准的方案进行。
这些原代细胞均来自新鲜组织，并采用公司专利的技术来优化目的细胞生长条件，降低杂细胞（如脂肪细胞、纤维细胞等）的污染。
分离的细胞经过短暂培养、传代，然后迅速冻存。
这些保持分化状态的细胞可以用于评估体外药物模型系统和调节特定基因的遗传功能。
嘉美生物原代肝细胞产品均经过严格的QA/QC检测，可以直接用于药物优化和筛选、基因克隆、表达图谱分析以及各种分子生物学和药物学实验的研究。
凭借着先进的技术设备和资深的专业经验，嘉美生物能为您提供高品质的原代细胞产品和特殊的定制服务：1、各种新鲜原代肝细胞嘉美生物除提供多种人、小鼠、大鼠、猴等新鲜肝细胞产品外，嘉美生物还可以为您提供特定动物、特定组织、特定年龄的新鲜肝细胞定制服务。
2、各种原代细胞提取物嘉美生物除提供的人、小鼠、大鼠、猴等四大类的肝微粒体、肝S9、CYP450酶和其他亚细胞提取物外，嘉美生物还可以为您提供专业的原代细胞提取物定制服务。
嘉美生物可以同时提供高质量的原代细胞产品和专业的个性化定制服务，为您的研究提供最新鲜优质的实验材料，提供其他原代细胞相关专业服务（原代肝细胞靶药分析服务、原代细胞靶药优化服务和原代细胞药物筛选等）。
嘉美生物能完美整合各类原代细胞类服务，是原代细胞分离，原代细胞提供，原代细胞实验课题服务中的佼佼者。
目前，嘉美生物可以提供180多种来自小鼠、大鼠、狗、猴和人（正常和病变）原代肝细胞，同时嘉美生物可以根据您的需求，为您提供专业的原代肝细胞定制服务。
嘉美生物提供的原代肝细胞定制服务具有以下优势：1)、定制服务周期短：正常情况下，一般需要4-6周。
2)、肝细胞种类广：一般为小鼠、大鼠、狗、猴、人等，还可以根据您的具体需求提供特定动物的肝细胞。
小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代
小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代之flamerking图文版[精华]很多战友发email或PM向我询问小鼠MSC的培养方法，我零零散散地一个个回复过几次，由于我平时时间不是很多，所以回答地时候有些内容写的不是很详细。
今天又有一个战友PM我，询问我培养方法。
看来做小鼠MSC的战友越来越多。
一遍遍地重复写很费时间（想粘贴复制又找不到上次写的在哪～惨！），所以我想还是发贴公布一下。
其实我小鼠MSC在我的课题中不是主角，只是起一个control的作用，因此我在这方面的经验可能没有一些专门做小鼠MSC的战友丰富，不过我还是很愿意把我的经验写出来供大家参考，希望能够起到“抛砖引玉”的作用。
欢迎各位同道对我的方案进行批评和指正，与大家一起分享你们的经验和智慧。
提纲一，简版主要步骤及操作要点。
二，完整版1. 试剂及材料准备2. 动物手术及取材3. 原代细胞培养4. 细胞传代5. 讨论时间关系，今天先给个简版。
我先顶一下,由于我还是新手,故不能说是经验介绍,只好讲让你们指出缺点,谢谢斑竹1. 试剂及材料准备MEM,10%FCS,手术器械,培养瓶,200目滤网,5ml注射器2. 动物手术及取材CR小鼠1只,酒精浸泡5分钟,取股,胫,肱骨,用基培冲出骨髓,滤过,1000转离心,完培重悬,接种于25厘米培养瓶3. 原代细胞培养:,3天后首次换液,自己发现一周贴壁细胞就铺满达90%,自行传代4. 细胞传代:消化下来很少,能下来的增长很慢5. 讨论:没经验欢迎斑竹的继续讲解,希望有经验的老师们能不啬指教羽之无限版主,能有空再讲讲吗这几天,我的原代就是不长,42天了,25平方厘米的培养瓶还未铺慢,不能传代真是天天盼着你啊呵呵，不好意思，最近我的sony笔记本又坏了，上次坏了几次维修部修不好，给我换了台新的，结果以用了没2个月又不能启动了，真是麻烦，我的资料都在里面，最近实验又忙，没空去维修部……不过明天我就去了。
……呵呵，跑题了。
间充质干细胞分离及培养方案
取小鼠（C57）两只，脱颈（大镊子卡住颈部）窒息而死，75%酒精在平皿中完全浸泡10分钟
无菌条件下脱皮，取出双侧股骨，胫骨，弘骨，除去肌肉和骨膜
用含1%双抗（青霉素+链霉素）的Hanks’液冲洗三次（无菌操作）
用剪刀剪去股骨，胫骨，弘骨的骨骺端，露出骨髓腔（无菌操作）
0.5毫升的重悬细胞液+4.5毫升4%的冰乙酸（对细胞液10倍稀释，分解红细胞），进行细胞计数，根据细胞数再确定稀释倍数
以1x107的浓度进行接种与培养瓶（塑料，带透气），37℃，5%CO2培养，48小时后换液，之后每两天换液一次
用不含双抗的M199培养基5毫升冲出骨髓，再吸取培养液继续冲洗，直至骨髓腔发白为止（无菌操作）
用纱布（两层纱布）在漏斗中进行细胞液的过滤，过滤到100毫小瓶子中（无菌操作）
将细胞液分到10毫升的离心管，1000转离心10分钟（无菌操作）
10毫升的M199培养基（不含双抗）对离心后的细胞进行重悬，吹打细胞时要轻（无菌操作）
子宫内膜异位症原代细胞培养及纤维化相关蛋白检测
子宫内膜异位症原代细胞培养及纤维化相关蛋白检测张艳芹;吴迪;邓梦琪;常翔宇;苗劲蔚【摘要】目的检测在位子宫内膜组织、子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)异位病灶组织及正常人子宫内膜组织分离提纯子宫内膜间质细胞及相应间质细胞中纤维化相关蛋白表达水平及差异.方法在严格无菌条件下,刮勺刮取新鲜子宫内膜组织,冰盒运输,采用改良EMs原代细胞培养方法分离培养.并通过细胞爬片免疫组织化学方法,对分离提纯的细胞进行鉴定.蛋白免疫印迹方法检测对比分离提纯的细胞与相应组织纤维化相关蛋白表达的差异.结果 EMs在位内膜组织间质细胞原代分离12例均成功,成功率100％(成功指标:指细胞在培养瓶中贴壁生长并稳定传代).EMs异位组织分离培养12例成功11例,成功率为91.7％.正常人子宫内膜组织分离9例成功8例,成功率为88.9％.人子宫内膜异位症异位间质细胞(human ectopic endometrial stromal cells,HEcESCs)与人子宫内膜异位症在位间质细胞(human eutopic endometrial stromal cells,HEuESCs)及正常人在位子宫内膜间质细胞(human normal endometrial stromal cells,HEnESCs)普通光镜观察无明显差异.但免疫组织化学、蛋白免疫印迹结果表明:HEcESCs纤维化相关蛋白的表达水平明显高于HEuESCs及HEnESCs两者纤维化相关蛋白表达水平(P＜0.01),而HEuESCs与HEnESCs纤维化相关蛋白的表达差异无统计学意义(P＞0.05),各间质细胞纤维化相关蛋白的表达与其相应组织水平相一致.结论采用改良EMs间质细胞原代培养方法,可以降低EMs子宫内膜间质细胞培养难度,并保持较高的细胞培养成功率.HEcESCs较HEuESCs及HEnESCs纤维化相关蛋白表达明显增高,即子宫内膜异位症患者,异位病灶在组织水平出现了明确的纤维化.【期刊名称】《首都医科大学学报》【年(卷),期】2019(040)004【总页数】7页(P602-608)【关键词】子宫内膜异位症;原代培养;纤维化【作者】张艳芹;吴迪;邓梦琪;常翔宇;苗劲蔚【作者单位】首都医科大学附属北京妇产医院妇瘤科,北京100006;首都医科大学附属北京妇产医院妇瘤科,北京100006;首都医科大学附属北京妇产医院妇瘤科,北京100006;首都医科大学附属北京妇产医院妇瘤科,北京100006;首都医科大学附属北京妇产医院妇瘤科,北京100006【正文语种】中文【中图分类】R711.71子宫内膜异位症 (endometriosis，EMs)是指子宫内膜腺体和基质异位到宫腔以外的部分，以卵巢、子宫直肠陷凹、子宫骶韧带等部位最常见，是生育期女性常见病、多发病，发病率高达7%～10% [1]。
小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏细胞的原代培养2013
细胞工程综合实验报告小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏细胞的原代培养班级 xxxx姓名 xxxx学号 xxxxxxxxxx指导教师 xxxx实验时间 xxxx成绩小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏细胞的原代培养姓名学号班级一、实验目的1.了解细胞原代培养培养的基本方法和操作过程。
2.初步掌握培养过程中的无菌技术。
3.了解在相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况。
二、实验原理原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。
这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。
要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。
二是严格控制无菌条件。
巨噬细胞属天然免疫细胞，具有趋化运动、吞噬、分泌和参与免疫调节等功能，是科学工作者研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。
巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。
巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周多用做原代培养，不易长期生存。
巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。
目前，单核巨噬细胞株也有，比如RAW264.7，但价格比较贵，且保存也不方便。
培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，目前以小鼠腹腔取材法最为实用，而目前获取小鼠巨噬细胞的方法有两种，一种是直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞，还有一种方法向动物腹腔中注射刺激物（如牛血清，淀粉，糖原，脂多糖，矿物油，PRMI1640培养液等），这样使机体产生大量巨噬细胞后再腹腔灌洗，但由于许多刺激物能激活巨噬细胞，而被激活的巨噬细胞大量吞噬刺激物，有此得到的巨噬细胞培养用于培养时，细胞中的刺激物不能很快被消化而残留在细胞中，影响细胞代谢，同时也不能很好的模拟体内环境，所以我们直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞。
小鼠肝细胞的原代和传代培养的研究
小鼠肝细胞的原代和传代培养的研究作者：李维维来源：《学校教育研究》2021年第07期一、实验原理细胞培养是用无菌操作的方法，将动物体内的组织取出，模拟体内的生理条件，在体外进行培养。
培养过程分为原代培养和传代培养。
原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞，组织和器官，用无菌操作的方法，经销化，分散成为单个游离的细胞。
在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。
传代培养是指细胞自从一个培养瓶以1：2比例转移，接种到另一培养瓶的培养。
这次实验我所用的抗生素瓶和小玻璃珠便用于细胞的传代培养。
本来这次实验用小玻璃珠，这种模式融汇了扩大贴壁面积和便于观察的优点，并且重演性好。
二、材料（一）实验动物乳鼠10只，体质量7～8g，刚出生三天，保持室温20℃～25℃;（二）实验器材空的抗生素瓶玻璃珠眼科剪眼科镊试管吸管等（三）实验试剂磷酸缓冲液（PBS）;平衡盐液：Hank原液 Hank液;细胞消化液：0.5%胰蛋白酶和0.4%EDTA钠盐液。
以上溶液经包装，灭菌后备用三、实验步骤（一）试剂的配制1.Hank原液与Hank液的配制配制程序：（1）称取1.4g Hank原液，溶于30～50ml的蒸馏水中。
（2）取1000ml烧杯及容量瓶各一个，先放蒸馏水800ml于烧杯中，然后逐一称取药品，但必须在前一药品溶解后，方可加入下一药品，充分混匀后，分装，盖紧瓶盖，写好标签，置于4°C冰箱保存。
2.胰蛋白溶液的配制3.0.02%的EDTA鈉盐溶液的配制4.水解乳蛋白—Hank液的配制5.E-MEM营养液的配制6.104U/ml青霉素、链霉素的配制（二）实验营养液的配制1.原代细胞营养液的配制2.传代细胞营养液的配制（三）培养器皿1.玻璃漏斗式滤器玻璃漏斗式滤器将滤板与玻璃漏斗烧结成一体，适用于各种培养用液的过滤除菌，但不宜血清等粘稠液体。
2.手术器械主要用于解剖动物，取材和原代培养中切割组织。
各种器械至少需配置两套3.培养瓶用于原代培养的需要卡氏瓶10～15瓶，而传代培养需用12～25个卡氏瓶，另准备5瓶抗生素瓶，每次用完后，清洗时一定要彻底，以防下次用时污染。
人用狂犬病疫苗的免疫机制、毒株及质量标准：重庆狂犬抗体检测指南
人用狂犬病疫苗的免疫机制、毒株及质量标准一、人用狂犬病疫苗的免疫机制、毒株及质量标准狂犬病病毒RNA编码核蛋白（N）、M1、M2、病毒包膜糖蛋白（G）和L五种蛋白，其中G蛋白是狂犬病病毒最主要的抗原，可有效刺激特异性辅助性T细胞和细胞毒性T细胞（CTL）增生，并诱导机体产生特异性抗体。
G蛋白特异性抗体是狂犬病疫苗最重要的保护性抗体，免疫效果主要依赖其抗原表位、结构、蛋白折叠及糖基化等。
N蛋白也是一种有效的保护性抗原，能够刺激B细胞和Th细胞诱导产生细胞和体液免疫。
磷蛋白（P）可诱导CTL，但保护作用较弱。
机体在接种狂犬病疫苗约7天左右产生IgM抗体，在约14天后产生IgG抗体并迅速升高。
IgM和IgG抗体均具有中和病毒的能力，有些中和抗体能进入感染狂犬病病毒的神经细胞内抑制病毒复制。
CTL的高峰出现在免疫后12天，可清除中枢神经系统内的狂犬病病毒，Th细胞可增强抗核蛋白和糖蛋白抗体，也能增加保护效果。
但Suss的研究认为细胞免疫在狂犬病中的作用不明。
由于狂犬病病毒核蛋白序列高度保守，氨基酸同源性达78%至93%，故病毒之间在核壳体水平上存在着广泛的抗原交叉反应。
狂犬病病毒的主要抗原部位为G蛋白外功能区，当其氨基酸同源性>74%时，病毒之间能够交叉中和，为同一遗传谱系内的病毒；膜外区的氨基酸同源性<62%时，则无交叉中和反应。
目前疫苗株均属于遗传谱系I，对遗传谱系II中的病毒感染不具保护作用。
现已经有十余个种类或基因型的狂犬病病毒属病毒被描述为狂犬病的病原体。
目前为止，遗传谱系I的狂犬病病毒是引起人狂犬病的最常见的病毒型别，也是至今应用于狂犬病疫苗生产的唯一病毒种类。
故现有疫苗可能无法为遗传谱系I外的其他血清型病毒感染提供保护。
因此，用于疫苗的病毒种类必须慎重选择。
生产用毒种应是在实验室细胞培养适应和减毒，并具有稳定生物学特性的固定毒株，其历史和来源应确证清楚，并经过全面的特征性检定，符合国家相关文件的要求。
小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代
小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代之flamerking图文版[精华]很多战友发email或PM向我询问小鼠MSC的培养方法，我零零散散地一个个回复过几次，由于我平时时间不是很多，所以回答地时候有些内容写的不是很详细。
今天又有一个战友PM我，询问我培养方法。
看来做小鼠MSC的战友越来越多。
一遍遍地重复写很费时间（想粘贴复制又找不到上次写的在哪～惨！），所以我想还是发贴公布一下。
其实我小鼠MSC在我的课题中不是主角，只是起一个control的作用，因此我在这方面的经验可能没有一些专门做小鼠MSC的战友丰富，不过我还是很愿意把我的经验写出来供大家参考，希望能够起到“抛砖引玉”的作用。
欢迎各位同道对我的方案进行批评和指正，与大家一起分享你们的经验和智慧。
提纲一，简版主要步骤及操作要点。
二，完整版1. 试剂及材料准备2. 动物手术及取材3. 原代细胞培养4. 细胞传代5. 讨论时间关系，今天先给个简版。
我先顶一下,由于我还是新手,故不能说是经验介绍,只好讲让你们指出缺点,谢谢斑竹1. 试剂及材料准备MEM,10%FCS,手术器械,培养瓶,200目滤网,5ml注射器2. 动物手术及取材CR小鼠1只,酒精浸泡5分钟,取股,胫,肱骨,用基培冲出骨髓,滤过,1000转离心,完培重悬,接种于25厘米培养瓶3. 原代细胞培养:,3天后首次换液,自己发现一周贴壁细胞就铺满达90%,自行传代4. 细胞传代:消化下来很少,能下来的增长很慢5. 讨论:没经验欢迎斑竹的继续讲解,希望有经验的老师们能不啬指教羽之无限版主,能有空再讲讲吗这几天,我的原代就是不长,42天了,25平方厘米的培养瓶还未铺慢,不能传代真是天天盼着你啊呵呵，不好意思，最近我的sony笔记本又坏了，上次坏了几次维修部修不好，给我换了台新的，结果以用了没2个月又不能启动了，真是麻烦，我的资料都在里面，最近实验又忙，没空去维修部……不过明天我就去了。
……呵呵，跑题了。
医药行业生物制药技术方案
医药行业生物制药技术方案第一章生物制药概述 (3)1.1 生物制药的定义与分类 (3)1.1.1 生物制品 (3)1.1.2 生物技术药物 (3)1.1.3 生物类似药 (3)1.2 生物制药的发展历程 (3)1.2.1 传统生物制药阶段 (3)1.2.2 生物技术制药阶段 (3)1.2.3 生物制药现代化阶段 (3)1.3 生物制药的行业现状 (4)1.3.1 市场规模不断扩大 (4)1.3.2 研发投入持续增加 (4)1.3.3 技术创新不断涌现 (4)1.3.4 政策支持力度加大 (4)第二章基因工程技术 (4)2.1 基因克隆与重组技术 (4)2.1.1 基因克隆方法 (4)2.1.2 基因重组技术 (4)2.2 基因表达与调控 (5)2.2.1 基因表达 (5)2.2.2 基因调控 (5)2.3 基因工程制药的关键技术 (5)2.3.1 目的基因的获取与优化 (5)2.3.2 重组载体的构建与筛选 (5)2.3.3 受体细胞的选择与优化 (5)2.3.4 基因表达调控与产物纯化 (6)2.3.5 药物评价与质量控制 (6)第三章细胞培养技术 (6)3.1 动物细胞培养 (6)3.1.1 动物细胞培养的原理 (6)3.1.2 动物细胞培养的方法 (6)3.1.3 动物细胞培养的注意事项 (6)3.2 植物细胞培养 (6)3.2.1 植物细胞培养的原理 (7)3.2.2 植物细胞培养的方法 (7)3.2.3 植物细胞培养的注意事项 (7)3.3 细胞培养条件的优化 (7)3.3.1 培养基的优化 (7)3.3.2 温度和湿度的控制 (7)3.3.3 氧气和二氧化碳的供应 (7)3.3.4 细胞密度和接种比例的调整 (7)3.3.5 搅拌和通风 (7)3.3.6 光照和黑暗周期的设置 (7)第四章生物反应器与发酵技术 (7)4.1 生物反应器的类型与选择 (8)4.2 发酵过程的优化与控制 (8)4.3 生物制药过程中的发酵技术 (8)第五章生物制药纯化技术 (9)5.1 蛋白质纯化技术 (9)5.2 核酸纯化技术 (9)5.3 生物制药产品的质量控制 (9)第六章生物制药工艺优化 (10)6.1 工艺参数的优化 (10)6.1.1 培养基的优化 (10)6.1.2 温度和pH的优化 (10)6.1.3 搅拌和溶氧的优化 (11)6.2 工艺流程的改进 (11)6.2.1 菌株筛选和改造 (11)6.2.2 上游工艺的改进 (11)6.2.3 下游工艺的改进 (11)6.3 生产成本的降低 (11)6.3.1 降低原料成本 (11)6.3.2 提高生产效率 (12)6.3.3 降低能耗 (12)6.3.4 提高设备维修保养水平 (12)第七章生物制药安全性评价 (12)7.1 生物制品的安全性评价方法 (12)7.2 生物制药产品的质量控制标准 (12)7.3 生物制药的安全性风险与防控 (13)第八章生物制药法规与政策 (13)8.1 生物制药的法规体系 (13)8.2 生物制药的审批流程 (14)8.3 生物制药行业的政策支持 (14)第九章生物制药市场分析 (15)9.1 生物制药市场的现状与趋势 (15)9.1.1 市场现状 (15)9.1.2 市场趋势 (15)9.2 生物制药市场的竞争格局 (15)9.2.1 市场竞争主体 (15)9.2.2 竞争格局分析 (15)9.3 生物制药市场的机会与挑战 (16)9.3.1 市场机会 (16)9.3.2 市场挑战 (16)第十章生物制药未来展望 (16)10.1 生物制药技术的发展方向 (16)10.2 生物制药行业的创新趋势 (16)10.3 生物制药行业的可持续发展策略 (17)第一章生物制药概述1.1 生物制药的定义与分类生物制药是指利用生物技术手段，通过对生物体的基因、蛋白质等生物大分子进行研究和开发，制备具有预防、治疗和诊断作用的生物药物。
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丁香园——常用原代细胞培养方案丁香园细胞技术讨论版zhaoqingshan、victoh、midas、Goodluck_XD、drake015丁香园——常用原代细胞培养方案丁香园细胞技术讨论版zhaoqingshan、victoh、midas、Goodluck_XD、drake015整理2005年第一版版权说明本电子图书由丁香园细胞技术讨论版制作出品。
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丁香园细胞技术讨论版：/bbs/post/page?bid=66&sty=1&age=0&tpg=1序言酝酿2个月之久的《丁香园——常用原代细胞培养方案》终于出炉了，在此，我们衷心地感谢丁香园战友对这项工作的参与和支持！也衷心地感谢丁香园管理阶层的领导们对细胞技术讨论版的关心和帮助！组织细胞培养技术，深入生物医学的每一个角落，其背景知识，实是渊深海阔，涉及的相关领域很多，如：组织学、胚胎学、解剖学、生理学、病理学等等；而作为研究手段和方法，组织细胞培养技术被广泛地应用于生物医学的各个领域，如：细胞生物学、微生物学、免疫学、肿瘤学、发育学以及临床医学等等。
因此，组织细胞培养技术是从事生物医学的研究人员应熟悉和掌握的基本技术。
古训“博观而约取，厚积而薄发”，又曰“胸中有万卷书，笔底无半点尘者，始可著书”，古人治学态度之严谨令我们叹服！尽管如此，我们不揣鄙陋，整理了这份《常用原代细胞培养方案》稿件，希望战友们学习的过程中能取精去粕，扬长避短，从中能有所领会和收获，而贡献于祖国的医药生物学事业，那么我们的辛苦也是值得的！当然，因为时间仓促，而我们的知识和精力也是很有限的，文中肯定有很多疏漏之处，希望战友们批评指正！我们将予以修改和整理后，继续发表《丁香园——常用原代细胞培养方案》第二版！本文为丁香园电子文集，版权归丁香园网站所有，凡是不告而转载者，均以侵权追究！谨以此文献给我们亲爱的丁香园网站！献给我们热爱的并为之奋斗过的细胞技术讨论版！献给我们可爱的丁香园战友！丁香园细胞技术讨论版全体版主：zhaoqingshan、victoh、midas、Goodluck_XD、drake0152005年1月10日目 录目 录 (1)前 言 (3)第一章 成纤维细胞培养 (4)第一节小鼠胚胎成纤维细胞培养 (5)第二节大鼠肺成纤维细胞培养 (7)第二章 内皮细胞培养 (9)第一节大鼠脑微血管内皮细胞培养(之一) (10)第二节大鼠脑微血管内皮细胞培养(之二) (17)第三节人脐静脉内皮细胞培养 (19)第四节大鼠主动脉内皮细胞培养 (21)第三章 肌细胞的培养 (23)第一节新生大鼠心肌细胞培养 (23)第二节兔膀胱平滑肌细胞培养 (27)第三节人脐动脉平滑肌细胞培养(消化法) (31)第四节人脐动脉平滑肌细胞培养(贴块法) (32)第五节大鼠主动脉平滑肌细胞培养(贴块法) (33)第六节动脉粥样硬化患者血管平滑肌细胞培养 (34)第四章 骨类细胞培养 (35)第一节大鼠乳鼠成骨细胞培养 (35)第二节乳兔软骨细胞培养 (38)第三节家兔椎间盘细胞培养 (39)第五章 神经外胚层细胞培养 (41)第一节大鼠大脑皮层神经元细胞培养 (41)第二节神经胶质细胞培养 (43)第三节大鼠星型胶质细胞培养 (45)第四节大鼠视神经少突胶质细胞培养 (48)第六章 上皮细胞培养 (53)第一节小鼠肝细胞培养 (53)第二节大鼠胰岛细胞培养 (55)第三节猪甲状腺细胞培养 (56)第七章 其它类别的细胞培养 (58)第一节大鼠肝星状细胞培养 (58)第二节人滑膜细胞培养 (60)第三节小鼠腹腔巨噬细胞培养 (62)附录 (63)前 言原代培养是从供体中取得组织细胞后在体外进行的首次培养。
原代培养不仅是建立各种细胞系的第一步，也是从事组织培养工作人员应熟悉和掌握的最基本的技术。
原代培养的细胞具有很多特点，首先组织和细胞刚刚离体，生物学特性未发生很大变化，仍具有二倍体遗传物质，最接近和反映体内生长特性，很适合作药物测试、细胞分化等实验研究。
原代培养是获取细胞的主要手段，但原代培养的组织由多种成分组成，比较复杂，即使生长出同一类型细胞如成纤维样细胞或上皮样细胞，细胞间也存在很大差异。
如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差别也可以在细胞上反映出来。
因而原代细胞的部分生物学特征尚不稳定，如要做较为严格的对比性实验研究，还需要对细胞进行短期传代后进行(需要注意的是，正如前面已提到的，有些细胞在传代后可能会发生一些生物学特性的变化)。
一般，常采用2-5代的细胞进行实验。
当然，特殊情况和一些终末细胞如神经细胞、巨噬细胞、心肌细胞除外。
此外，原代细胞培养还需要做各种鉴定，如普通的形态学鉴定、表达蛋白质分子的免疫组织化学鉴定、生化鉴定以及电镜的鉴定等。
原代培养的方法很多，最基本和最常用的有两种，即组织块法和消化法。
这些方法，我们将在后面的各个章节分别介绍。
做好原代细胞培养需注意的事项很多：严格的无菌操作是成功的首要条件；选择合适取材组织、挑选合适的操作方案、操作手法的规范等等，都将影响到实验的成功与否。
以下，我们将要介绍一些常用原代细胞培养的方案，值得注意的是，这些方法都是来自丁香园中不同战友、不同实验室的方案，因为每个人、每个实验室可能会有不同的习惯和不同的经济情况，战友们采用这些方案(或者说引进这些方案)的时候，都必须根据个人的情况而加以选择，取其精华，去其糟粕！第一章 成纤维细胞培养成纤维细胞是来源于中胚层的细胞，很容易生长，一般不需要特殊条件，常规培养即可。
原代成纤维细胞培养，一般说来可以分为消化法和贴块法。
主要以消化法较为多用，一般用胰酶即可，只要注意不要消化过度，实验一般都可以成功。
原代成纤维细胞贴块法培养和常规的贴块法相同。
成纤维细胞对培养条件的要求不高，属于比较容易生长的细胞，培养液可以用DMEM或RPMI1640，血清则一般用10%的小牛血清就可以了。
至于细胞纯化方面，一般的杂质细胞在传代过程中可以采用差速贴壁法(见本章第二节2.7)去除，也可以以自然纯化法纯化而获得较纯的成纤维细胞。
目前已经有许多建立好的成纤维细胞系，可以传代50代左右。
自己原代培养的成纤维细胞一般可以传10代左右，与各个实验室的条件和实验方法有关。
常用的成纤维细胞培养有：胚胎成纤维细胞、胚肺成纤维细胞、肺成纤维细胞、心脏成纤维细胞的原代培养等。
本章我们探讨其中的胚胎成纤维细胞和肺成纤维细胞的原代培养。
第一节 小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)培养随风飘扬1 材料1.1 动物孕期14至16天的孕鼠(小鼠)。
1.2 试剂无Ca2+和Mg2+的PBS(D-PBS)、0.05%胰酶、0.53 mmol/L EDTA溶液、MEF生长培养基(高糖DMEM加10%FBS)。
1.3 器械眼科直剪3把、眼科直镊3把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套、200目尼龙滤网、50 ml和15 ml离心管和手术刀片。
以上物品均需要高压灭菌消毒处理。
2 方法2.1 处死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超净台中用剪刀和镊子将孕鼠皮肤剪开，用另外一组剪刀、镊子剪开腹部肌层，露出子宫，最后用第三组剪刀和镊子将子宫小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，冲洗去血。
2.2 用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30 ml D-PBS的50 ml离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉D-PBS，再重复此步骤一次，注意要留少许D-PBS，然后将胚胎转移到另一装有D-PBS的平皿中，并用手术刀片将其细细切碎。
2.3 用200 µl的移液枪反复、快速地吹打平皿中的液体，转移至15 ml离心管中，于4℃ 1500 rpm离心5分钟，倒掉上清，以10 ml胰酶重悬沉淀，放在37℃水浴中消化30分钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分消化。
2.4 将上层细胞悬液倒入一个装有10 ml MEF生长培养基的50 ml离心管中，用200目的尼龙网过滤后，以1500 rpm离心5分钟收集细胞，再用30 ml MEF生长培养基洗涤两次。
2.5 细胞沉淀用15 ml MEF生长培养基重悬后进行细胞计数(一般8只14天的胎鼠可获得2-3×107细胞)。
2.6 3×106细胞悬浮于15 ml MEF生长培养基中，接种到200 ml培养瓶中。
2.7 24小时后更换新鲜的MEF生长培养基。
2.8 细胞长满后，先用D-PBS冲洗，倒掉后加胰酶消化(此步时间不宜过长，作者一般不超过五分钟)，按1:5传代。
2.9 细胞再次长到覆盖率80-90%左右，将其消化后，常规冻存(冻存液要现配)[1]。
3 结果见下图：小鼠胚胎成纤维细胞(MEF 100倍)4 讨论4.1 原代培养，一定要避免污染。
4.2 MEF生存能力有限，如果不冻存，体外存活十代左右。
4.3 冻存后复苏的细胞只能传代一次，因为这些细胞繁殖能力有限。
4.4 消化细胞时间不要过长。
参考文献[1] D.L.斯佩克特. 细胞实验指南[M]. 第一版. 北京.科学出版社. 2001:49-50.第二节 大鼠肺成纤维细胞培养zhaoqingshan1 材料1.1 动物出生后1-4天的Wistar乳鼠1只。
1.2 试剂PBS、培养液(Hyclone的低糖DMEM，含Hyclone的10%新生牛血清、100 U/ml青链霉素]、1%明胶PBS、0.25%胰酶(含EDTA，GIBCO)，碘酒和酒精绵球。
1.3 器械眼科直剪2把、眼科弯剪2把、眼科直镊2把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套，25cm2塑料培养瓶(Costar)。
2 方法2.1 明胶包被培养瓶过夜(准备2-3个)，取出明胶，用2 ml培养液冲洗培养瓶一遍，置于超净台中。
2.2 解剖取肺：将乳鼠在酒精中浸泡后取出，转移至超净台上的玻璃培养皿中，用碘酒消毒胸部皮肤，再用酒精棉球脱碘。
左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手以眼科直剪剪开皮肤，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒，继而以另一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。
用眼科镊取出肺，置于盛有PBS(含有200 U/ml青链霉素)的玻璃平皿中，冲洗去血。
2.3 用眼科剪将肺分成几个肺叶，用镊子去除周边的血凝块及纤维组织，用眼科剪剪去肺门处的支气管和血管，再用含有双抗的PBS冲洗1遍。
2.4 用眼科弯剪将肺组织剪碎成1 mm3大小，加入含有双抗的PBS，将肺组织块吹打开，静置15 min 后，更换新的PBS。