工业微生物菌种保藏技术(ppt52).pptx
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6工业微生物资源的保藏-PPT课件
（二）菌种的复壮（rejuvenation）
1. 定义
狭义的复壮：
是指菌种已发生衰退后，通过纯种分离和测定典
型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选 出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性 状的相应措施。
是一种消极的措施
广义的复壮：
在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经
常有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作， 以期从中选择到自发的正变个体。
是一项积极的措施
1. 复壮的方法
（1）纯种分离法（pure culture isolation）
通过纯种分离把退化菌种的细胞群中仍保持 原有典型性状的单细胞分离出来，扩大培养，就 可恢复正常。
纯种分离的方法
粗放
“菌落纯”水平（pure culture in colony lever）
“菌株纯”水平（pure culture in strain lever） 精细
低温可减缓生长速度，单细胞仍有一定的活动条件， 一般4～6个月必须传代一次。
优点：方便，不受条件限制，各类微生物均可。 缺点：时间短、传代多、易退化。
（2）液体石蜡法 操作方法：
生长完全的斜面上覆盖无菌的液体石蜡， 液面高于斜面1cm，普通冰箱保藏。
加上石蜡可防止培养基水分蒸发，也可隔氧， 保藏时间1～2年，除石油发酵微生物外，各类 微生物均可使用。
6. 西德 发酵工业研究所微生物收藏馆（MIC）
例如，外源DNA插入到质粒pBR322中，重组质 粒转化入E. coli中，使其含有Ampr和Tetr，因此 在培养基中加入Ampicillin（氨苄青霉素）和 Tetacyclin（四环素），即可选出含有质粒 pBR322的细胞。
由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保 藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能 被证明对所有的微生物均适宜。因此，在具体选择保 藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特 点及现有条件等进行综合考虑。对于一些比较重要的 微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进 行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。
菌种保藏的原理和方法.ppt
2.沙土管干燥保藏法（略）
3.真空冷冻干燥保藏法
是目前常用的较理想的一种方法。其基本原理是在较低温度 下，（-18℃），快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后 在真空中使水分升华。在这样的环境中，微生物的生长和代谢 都暂时停止，不易发生变异。一般可保存5~10年左右。
4.液氮保藏法
是适用范围最广的微生物保藏法，其保存期最长。因为液氮的温度 可达-196℃，远远低于菌种新陈代谢作用停止的温度（-130℃）， 故此时代谢活动已停止。保藏期一般为2~3年，长的可达9年之久。
种时，先将原种制成若干管液氮菌种作为长期保藏用菌种，然后 再制一批冷冻保藏菌种作为用户分发用。约经5年后，假定第一 代（原种）的冷冻干燥保藏菌种已分发完毕，就再打开一支液氮 保藏原种制备大量冷冻保藏菌种，这样下去，至少在20年内，凡 获得该菌种的用户，至多只是原种的第二代，从而保证了保藏菌 种与分发菌种的高质量标准。
保藏斜面活化斜面来自2、复壮：使微生物活性恢复的同时，恢复其优良的生产性能。
保藏斜面 平板分离（自然分离，剔除退化菌种） 活化斜面
六、菌种保藏机构
菌种保藏机构的任务是：在广泛收集生产和科研菌种、菌株的基 础上，把它们妥善保藏，使之达到不死、不衰、不乱和便于交换使 用的目的。国际上很多国家都设立了菌种保藏机构。
▲ I FO（发酵研究所，日本大阪. Institute for Fermentation, Osaka, Japan ） ▲ NCTC（国家典型菌种保藏中心,英国伦敦. National Collection of Type Culture. London, United Kingdom） ▲ NRRL（Northern Utilization Research and Development Division, U.S Department of Agriculture. Peoria, U.S.A. 美国农业 部、北方开发利用研究部，美国皮奥里亚市）
《菌种的传代与保藏》课件
微生物菌种的保藏。
04
CATALOGUE
菌种传代与保藏的注意事项
防止菌种污染与变异
01
02
03
严格控制传代过程
在菌种传代过程中，应采 取无菌操作，避免污染。
选择适当的培养基
选择适当的培养基，以保 证菌种的正常生长和代谢 。
避免频繁传代
频繁传代会导致菌种变异 ，因此应合理控制传代次 数。
保持菌种遗传稳定性
通过菌种传代，可以持续获得相同特 性的菌株，为科学研究、产品开发、 质量控制等提供可靠的实验材料。
菌种保藏的原理与重要性
菌种保藏是长期保存菌种的有效方法，其原理在于创造不适宜菌种生长的环境条 件，使其处于休眠状态，从而延长菌种的保存期限。
菌种保藏对于保护生物多样性、防止菌种丢失、保障实验结果的可靠性等方面具 有重要意义。
尊重他人的知识产权，不得侵犯他 人的合法权益。
05
CATALOGUE
菌种传代与保藏的应用前景
在生物科学研究中的应用
要点一
基础生物学研究
菌种传代与保藏技术对于基础生物学研究至关重要，如微 生物分类学、进化生物学和生态学等。通过菌种传代与保 藏，科学家可以深入研究微生物的生理生化特性、基因组 学和蛋白质组学等，以揭示微生物生命活动的奥秘。
03
CATALOGUE
菌种的保藏技术
低温保藏法
总结词
一种常用的菌种保藏方法，通过降低温 度来降低菌种的代谢活性，延长菌种存 活时间。
VS
详细描述
将菌种保存在低温环境下，如冰箱的冷藏 室或冷冻室内，使菌种处于休眠状态，降 低其代谢活性，减少菌种变异和污染的机 会。适用于大多数微生物菌种的短期保藏 。
业的发展。
生物农药和生物肥料
04
CATALOGUE
菌种传代与保藏的注意事项
防止菌种污染与变异
01
02
03
严格控制传代过程
在菌种传代过程中，应采 取无菌操作，避免污染。
选择适当的培养基
选择适当的培养基，以保 证菌种的正常生长和代谢 。
避免频繁传代
频繁传代会导致菌种变异 ，因此应合理控制传代次 数。
保持菌种遗传稳定性
通过菌种传代，可以持续获得相同特 性的菌株，为科学研究、产品开发、 质量控制等提供可靠的实验材料。
菌种保藏的原理与重要性
菌种保藏是长期保存菌种的有效方法，其原理在于创造不适宜菌种生长的环境条 件，使其处于休眠状态，从而延长菌种的保存期限。
菌种保藏对于保护生物多样性、防止菌种丢失、保障实验结果的可靠性等方面具 有重要意义。
尊重他人的知识产权，不得侵犯他 人的合法权益。
05
CATALOGUE
菌种传代与保藏的应用前景
在生物科学研究中的应用
要点一
基础生物学研究
菌种传代与保藏技术对于基础生物学研究至关重要，如微 生物分类学、进化生物学和生态学等。通过菌种传代与保 藏，科学家可以深入研究微生物的生理生化特性、基因组 学和蛋白质组学等，以揭示微生物生命活动的奥秘。
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CATALOGUE
菌种的保藏技术
低温保藏法
总结词
一种常用的菌种保藏方法，通过降低温 度来降低菌种的代谢活性，延长菌种存 活时间。
VS
详细描述
将菌种保存在低温环境下，如冰箱的冷藏 室或冷冻室内，使菌种处于休眠状态，降 低其代谢活性，减少菌种变异和污染的机 会。适用于大多数微生物菌种的短期保藏 。
业的发展。
生物农药和生物肥料
微生物的菌落形态观察平板菌落计数及菌种保藏PPT精选文档
37
三、平板菌落计数的表述及计算
▪ 因为微生物不易完全分散成单个细胞； ▪ 菌落的来源也并非完全为单个细胞； ▪ 因此其测定结果比实际菌数偏低； ▪ 引入菌落形成单位（colony-forming units，cfu）来表示，
而不以绝对菌体数量来表示样品的活菌含量。
▪ 计算公式：
CFU/g
所取平均菌落数 稀释倍数 所加样品量
15
三、菌落特征描写方法
▪ ① 大小 大、中、小、针尖状。可先将整个平 板上的菌落粗略观察一下，再决定大、中、小的 标准，或由教师指出一个大小范围。
▪ ② 颜色 黄色、金黄色、灰色、乳白色、红色、 粉红色等。
▪ ③ 干湿情况 干燥、湿润、粘稠
▪ ④ 形态 圆形、不规则等
▪ ⑤ 高度 扁平、隆起、凹下
③一般在斜面培养基上以 “之”线划接种（充分利 用斜面，得到最大量的菌 体）；
④有时也进行直线接种划 线（斜面培养特征观察）
24
25
说明：
▪ 注意试管斜面的拿法（手掌向上，斜面 向上），与接种工具的配合使用；
▪ 记号笔标记时，过火烤一下，字不容易 掉；
▪ 挑取单菌落于相应斜面，管口标记学号， 橡皮筋捆扎（三支）；
十分多样
相同
一般不同
可见球状，卵圆状或假 丝状细胞
有时可见细丝状细胞
较快
慢
多带酒香味
常有泥腥味或抗生素气 粗丝状细胞 一般较快
往往有霉味 6
二、细菌菌落形态的多样性（示意图）
7
8
9
10
11
12
13
延展性较强的一些霉菌菌丝（松散）
14
平板中菌落形态
10-2
2
3 平均 1
三、平板菌落计数的表述及计算
▪ 因为微生物不易完全分散成单个细胞； ▪ 菌落的来源也并非完全为单个细胞； ▪ 因此其测定结果比实际菌数偏低； ▪ 引入菌落形成单位（colony-forming units，cfu）来表示，
而不以绝对菌体数量来表示样品的活菌含量。
▪ 计算公式：
CFU/g
所取平均菌落数 稀释倍数 所加样品量
15
三、菌落特征描写方法
▪ ① 大小 大、中、小、针尖状。可先将整个平 板上的菌落粗略观察一下，再决定大、中、小的 标准，或由教师指出一个大小范围。
▪ ② 颜色 黄色、金黄色、灰色、乳白色、红色、 粉红色等。
▪ ③ 干湿情况 干燥、湿润、粘稠
▪ ④ 形态 圆形、不规则等
▪ ⑤ 高度 扁平、隆起、凹下
③一般在斜面培养基上以 “之”线划接种（充分利 用斜面，得到最大量的菌 体）；
④有时也进行直线接种划 线（斜面培养特征观察）
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说明：
▪ 注意试管斜面的拿法（手掌向上，斜面 向上），与接种工具的配合使用；
▪ 记号笔标记时，过火烤一下，字不容易 掉；
▪ 挑取单菌落于相应斜面，管口标记学号， 橡皮筋捆扎（三支）；
十分多样
相同
一般不同
可见球状，卵圆状或假 丝状细胞
有时可见细丝状细胞
较快
慢
多带酒香味
常有泥腥味或抗生素气 粗丝状细胞 一般较快
往往有霉味 6
二、细菌菌落形态的多样性（示意图）
7
8
9
10
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延展性较强的一些霉菌菌丝（松散）
14
平板中菌落形态
10-2
2
3 平均 1
微生物菌种的保藏_PPT幻灯片
低温定期移植法：
• 把培养好的斜面菌种放在低温干燥处保存， 定期移植，一般3～6个月移植一次(视菌种 特征而定)。也可以用穿刺培养，定期移植 法保藏细菌，其效果也较好。
• 穿刺培养是将含0.6％～0.8％的琼脂培养 基装试管灭菌后直立冷凝后，用接种针尖 挑取少量菌体，垂直刺入琼脂培养基中心， 放在适当温度下培养，待菌长好后即可放 低温保存，此法较斜面保存有利，大肠杆 菌可保藏2年以上不发生明显变异。
• 甘油管保藏法：是利用微生物在甘油中 生长和代谢受到抑制的原理达到保藏目 的。其方法是，将40%的甘油高压蒸汽灭 菌待用。将培养好的斜面菌种用无菌种 用 无 菌 水 制 成 高 浓 度 的 菌 悬 液 (108 ～ 1010/ml)。取1ml灭菌甘油放入与甘油充 分混匀，使甘油浓度约为20%，于-20℃ 下冻存。
菌种菌种保藏
伤细胞。 在缓慢冷冻时，胞外基质一般较快结冰而 形成冰晶使基质浓度增高，造成细胞水分 外渗而大量脱水，可能使细胞死亡。如快 速降温，胞内也很快形成冰晶，胞内外渗 透压基本平衡，同时胞内冰晶较小，对细 胞及原生质膜的损伤也较小，菌株不易死 亡，影响也较小。
• 菌种是从事微生物学及生命科学研究的 基本材料.
• 微生物具有生命活力，在传代过程中易 发生变异甚至死亡，因此菌种保藏是一 项重要的基础工作，是微生物学基础工 作的一项重要内容，也是药品微生物工 作中的一项常用技术。
• 工业微生物菌种保藏，是要使菌 种生产能力和与生产工艺相适应 的优良性状保持稳定，当然做不 到绝对不变，只是力求把这种衰 退现象推迟减缓到最低限度。
第二章发酵工业微生物菌种ppt课件
2019
-
7
(1) 曲霉属(Asprgillus)：曲霉种类繁多、分布 广泛，工业上利用曲霉生产各种酶制剂和有机 (2) 青霉属（Penicillium）：j既是使果实腐 酸。如米曲霉（ Asp. oryzae）用于酿酒和L败和实物变坏的有害菌，又是青霉素后葡萄 乳酸生产。制酱油用的酱油曲霉以及制造柠檬 糖酸的产生菌。 酸、草酸、葡萄糖酸和糖化酶、酸性蛋白酶、 (3) 根霉属（Rhizopus）：用于米酒、黄 果胶酶、单宁酶等的黑曲霉 (Asp. niger)。 酒生产。此外，广泛用作淀粉糖化菌、有机 酸发酵以及甾体转化等许多方面。 (4) 毛霉属（Mucor）：产生蛋白酶，有分 解大豆蛋白的能力。腐乳、酱油、转化甾族 化合物。土曲霉：衣康酸
11
连续培养菌种的筛选 比生长速率(u):每克菌体每小时增长的 菌体量.u=1/XdX/dt.
2019
-
12
比生长速率u
A B
r
2019 -
基质浓度
13
限 制 性 基 质
当进行流加时基质浓度<r 时,A菌先被洗出; 当进行流加时基质浓度>r 时,,B菌先被洗出;
培养液
固体培养法
2019 14
2.随机分离方法 （1）.抗生素产生菌筛选 试验菌的灵敏性，以及与抗生素有关的酶、 酶的抑制剂（例如棒酸）、激活剂、抗体 等建立起来的高灵敏度、专一的检测技术。 （2）.药理活性化合物的筛选 （3）.生长因子产生菌的筛选 （4）.多糖生产菌的筛选 （5）.免疫激活剂产生菌的分离
2019
-
3
(3) 乳酸菌：由糖类生成乳酸的一类细菌总称为乳 酸菌，有乳链球菌和乳酸杆菌之分，主要用来制 造乳制品。凡发酵产物中只有乳酸者，称为同型 乳酸发酵；凡发酵产物中除乳酸外还有乙酸等和 CO2者，称为异型乳酸发酵。肠膜状明串珠菌属 于乳酸菌族，是制药工业生产有旋糖酐的重要菌。 (4) 大肠杆菌：工业上利用大肠杆菌的谷氨酸 脱羧酶，进行谷氨酸定量分析。还可以利用 大肠杆菌制取天冬氨酸、苏氨酸和缬氨酸等。 医药方面用它制造治疗白血症的天冬酰胺酶。 另外，在研究细菌遗传变异方面，以及构建 基因工程菌时，大肠杆菌是理想的研究材料。
第二节 工业微生物菌种选育
1.选择出发菌株
• 出发菌株是指用于诱变的原始菌种。 • 选择原则：菌种对诱变剂的敏感性强、变 异幅度大、产量高。 • 获得途径： （1）从自然界的土样或水样中分离出来的野 生型菌种； （2）生产中正在使用的菌种； （3）从菌种保藏机构购买
2.同步培养
• 培养中的细胞不处于同一生长阶段，它们 的生理状态和代谢活动也不完全一样。 • 同步培养法：使培养的微生物比较一致， 生长发育在同一阶段上的培养方法。 • 在诱变育种前，最好选用生理状态一致的 单细胞或单孢界直接分离筛选菌种的步骤
• 1.采样： （1）选择采样地点 中性偏碱：细菌和放线菌多 酸性红土壤及森林土壤：霉菌多 果园、菜园、野果生长区（富含碳水化合物）和沼泽池：酵母和霉 菌多。 （2）确定采样时间 秋初好：温度适中，雨量不多。 夏季或冬季土壤微生物存活量少，暴雨后显著减少。 （3）采样 5cm~15cm处取土。放在牛皮纸袋或玻璃屏或聚乙烯袋中，标明 样品种类、采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等 采集的样品应及时处理，暂不处理应放在4℃保存。
机械法 （选择法） 离心沉降分离法
同步培养方法 诱导法 温度调整法
膜洗脱法
营养条件调整法
特点：同步生长只能维持几代
机械法
膜洗脱法
通过大小不同 的微孔过滤器
离心沉降分离法
小细胞 沉淀慢
• 主要通过控制环境条件：如温度、营养物质等来诱导同步生 长。 • （1）温度调整法 • 将温度控制在接近最适温度条件下一段时间，缓慢进行新陈 代谢，但不进行分裂。然后再将温度提高到最适生长温度， 大多数细胞进行同步分裂。 • （2）营养条件调整法 • 控制培养基的浓度或培养基的组成以达到同步生长。例如限 制碳源或其他营养物，使细胞只能进行一次分裂而不能继续 生长，从而获得刚分裂的细胞群体，然后转入适宜的培养基 中，它们便进入了同步生长。 • 另外有在培养基中加入某种抑制蛋白质合成的物质（如氯霉 素）诱导一定时间后再转到另一种完全培养基中培养；或用 紫外线处理；对光合行微生物的菌体可采用光照与黑暗交替 处理法等。 • 总之：不管采用哪种诱导因子，都必须具有以下特性：不影 响生物的生长，但可特异性地抑制细胞分裂，当移去（或消 除）该抑制条件后，微生物又可立即同时出现分裂。
微生物菌种保藏原理与方法PPT文档共18页
培养
加石蜡油：以无菌吸管吸石蜡油加至菌种管中，加入量 以高出斜面顶端或直立柱培养基表面约1cm为宜。
收藏：面塞外包牛皮纸或用无菌橡皮塞，把菌种管直立 放置于4 ℃冰箱中。
放线菌、霉菌及产芽孢细菌一般可保2年，酵母菌及不 产芽孢细菌可保1年。
2 甘油保藏法
保护剂： 40%左右的甘油 机理：适当浓度甘油中，少量甘油分子进入细胞，
燥 收藏 恢复培养 麸皮保藏法—产孢子的丝状真菌。 制备麸皮培养基 培养菌种 干燥 收藏
恢复培养
4冷冻真空干燥保藏法
该法集中了菌种保藏中低温、缺氧、干燥和添 加保护剂等多种有利条件，是微生物代谢处于 相对静止状态。
该法可同时用于细菌、放线菌、丝状真菌、 （除少数不产孢子或只产生丝状体真菌外）、 酵母菌及病毒的保藏。
菌种培养物 保藏菌悬液的制备：液体法 菌苔法 -20 ℃保
藏 快速冷冻；乙醇-干冰 液氮 超低温保藏：-70 ℃ 一般细菌、酵母保存期为
3~5年。
3 干燥保藏法
基本原理：将微生物赖以生存的水分蒸发掉， 使细胞处于休眠和代谢停滞状态，从而达到较 长期保藏的目的。低温条件下，保藏期可达数 年至十几年之久。
贴标签：菌种 菌株 接种日期 接种：对数生长期后期 成熟的孢子 培养： 细菌—37℃，18~24h
酵母—28~30 ℃ ，36~60h 放线菌和丝状真菌—28 ℃ ，4~7d 收藏：管口面塞用牛皮纸包扎，或用融化的固 体石蜡封棉塞后置4冰箱保存。
1.2半固体穿刺保藏法
贴标签 穿刺接种：将菌种直刺入直立柱中央 培养：同传代保藏法 收藏：待菌长好后，用浸有石蜡的无菌软木塞
砂土管保藏法、明胶片保藏法、硅胶保藏法、 麸皮保藏法
3干燥保藏法
砂土管保藏法—产生芽孢的细菌及形成孢子的 霉菌和放线菌。
加石蜡油：以无菌吸管吸石蜡油加至菌种管中，加入量 以高出斜面顶端或直立柱培养基表面约1cm为宜。
收藏：面塞外包牛皮纸或用无菌橡皮塞，把菌种管直立 放置于4 ℃冰箱中。
放线菌、霉菌及产芽孢细菌一般可保2年，酵母菌及不 产芽孢细菌可保1年。
2 甘油保藏法
保护剂： 40%左右的甘油 机理：适当浓度甘油中，少量甘油分子进入细胞，
燥 收藏 恢复培养 麸皮保藏法—产孢子的丝状真菌。 制备麸皮培养基 培养菌种 干燥 收藏
恢复培养
4冷冻真空干燥保藏法
该法集中了菌种保藏中低温、缺氧、干燥和添 加保护剂等多种有利条件，是微生物代谢处于 相对静止状态。
该法可同时用于细菌、放线菌、丝状真菌、 （除少数不产孢子或只产生丝状体真菌外）、 酵母菌及病毒的保藏。
菌种培养物 保藏菌悬液的制备：液体法 菌苔法 -20 ℃保
藏 快速冷冻；乙醇-干冰 液氮 超低温保藏：-70 ℃ 一般细菌、酵母保存期为
3~5年。
3 干燥保藏法
基本原理：将微生物赖以生存的水分蒸发掉， 使细胞处于休眠和代谢停滞状态，从而达到较 长期保藏的目的。低温条件下，保藏期可达数 年至十几年之久。
贴标签：菌种 菌株 接种日期 接种：对数生长期后期 成熟的孢子 培养： 细菌—37℃，18~24h
酵母—28~30 ℃ ，36~60h 放线菌和丝状真菌—28 ℃ ，4~7d 收藏：管口面塞用牛皮纸包扎，或用融化的固 体石蜡封棉塞后置4冰箱保存。
1.2半固体穿刺保藏法
贴标签 穿刺接种：将菌种直刺入直立柱中央 培养：同传代保藏法 收藏：待菌长好后，用浸有石蜡的无菌软木塞
砂土管保藏法、明胶片保藏法、硅胶保藏法、 麸皮保藏法
3干燥保藏法
砂土管保藏法—产生芽孢的细菌及形成孢子的 霉菌和放线菌。
最新菌种的保藏方法课件ppt
• 用此方法可以维持若干微生物的活力1—2年。
10
• 应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用 来保藏。
• 保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管 应严格密封。
• 这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长 期保藏。
11
超低温保藏技术(-60∼-80℃)
• 要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60℃ 以下进行保藏。
不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高 产能力。 (3) 简便、经济，可广泛使用。
3
沙土管干燥保藏法
• 适用于产生孢子的丝状真菌和放线菌，或形 成芽孢的细菌。
• 原理是造成干燥和寡营养的保藏条件。 • 因此在抗生素工业生产中应用最广，效果亦
好，可保存2年左右，但应用于营养细胞效 果不佳。
7
• 对工业微生物生产菌种来说，建议保藏菌种的形态 学和生化特征(如代谢产物的产生、酶活力、遗传特 征及生化指标)应在保藏后加以检测和确定。
16
• 加速保藏试验可用于预测保藏过程中保藏培养物的 稳定性。在一个给定温度下通过对高温下短期活力 丧失程度检测，预测菌种的稳定性。
• 成功的菌种长期保藏方法之有价值的指标包括在保 藏6个月、1年或更长时间后存活百分率(或存活单 位)。细胞群体的形态学特征或一些特别的生化特征 应在菌种保藏前后保持同一性。
17
1、斜面冰箱保藏法
4 C ； 3-6个月
2、沙土管保藏法
产孢子或芽孢微生物，1年
3、菌丝速冻法
甘油或二甲基亚砜作为保护剂，-20 C
4、石蜡油封存法 1年左右
5、真空冷冻干燥保藏法 任何微生物；一般5年以上
6、液氮超低温保藏法 -196 C ；保护剂；保存期长
18
10
• 应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用 来保藏。
• 保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管 应严格密封。
• 这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长 期保藏。
11
超低温保藏技术(-60∼-80℃)
• 要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60℃ 以下进行保藏。
不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高 产能力。 (3) 简便、经济，可广泛使用。
3
沙土管干燥保藏法
• 适用于产生孢子的丝状真菌和放线菌，或形 成芽孢的细菌。
• 原理是造成干燥和寡营养的保藏条件。 • 因此在抗生素工业生产中应用最广，效果亦
好，可保存2年左右，但应用于营养细胞效 果不佳。
7
• 对工业微生物生产菌种来说，建议保藏菌种的形态 学和生化特征(如代谢产物的产生、酶活力、遗传特 征及生化指标)应在保藏后加以检测和确定。
16
• 加速保藏试验可用于预测保藏过程中保藏培养物的 稳定性。在一个给定温度下通过对高温下短期活力 丧失程度检测，预测菌种的稳定性。
• 成功的菌种长期保藏方法之有价值的指标包括在保 藏6个月、1年或更长时间后存活百分率(或存活单 位)。细胞群体的形态学特征或一些特别的生化特征 应在菌种保藏前后保持同一性。
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1、斜面冰箱保藏法
4 C ； 3-6个月
2、沙土管保藏法
产孢子或芽孢微生物，1年
3、菌丝速冻法
甘油或二甲基亚砜作为保护剂，-20 C
4、石蜡油封存法 1年左右
5、真空冷冻干燥保藏法 任何微生物；一般5年以上
6、液氮超低温保藏法 -196 C ；保护剂；保存期长
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微生物菌种保藏ppt课件
(四）－80℃冰箱冻结法
将菌种悬浮于保护剂中，在－80℃冰箱中冻结保 存的一种长期菌种保藏方法。
准备冷冻 管
准备保护剂（10%-15%甘油) 准备菌悬液（细胞、孢子或芽孢悬液） 制备冷冻管（取菌悬液和保护剂至冷冻管）
保藏（-80℃，2～5年）
方法总结
使用比较方便； 保藏时间较长； 对设备要求高(-80℃冰箱)； 运输不方便。
灌注石蜡
液面高出斜面顶部1cm
保藏
4～6 ℃，干燥处； 直立放置； 保藏时间1 ～2年。
方法总结
操作简单，使用比较方便；
对设备要求不高，对人员操作水平有一定要求； 工作劳动强度大，保藏成本较高；
菌种易退化、污染。
(三)真空冷冻干燥法
指将保藏的菌种细胞或孢子悬浮于保护剂中，经 预冻后在真空条件下使水分升华，再经真空封存 后保存的一种长期菌种保存方法。 安瓿管，又叫安瓿瓶，简称安瓿，指装注射剂用 的密封的小玻璃瓶，用药时将瓶颈的上端弄破。
（五）液氮超低温冻结法
指悬浮于保护剂中的菌种经程控降温后，移置于 －196℃的液氮或－150℃左右的液氮气相中保存 的一种长期菌种保藏方法。
（二)液体石蜡法
亦称矿物油保藏法，定期移植保藏法的辅助方法。 指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件 下培养至待得到健壮的菌体后注入灭菌的液体石 蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温（4～ 6℃）干燥处进行保存的一种菌种保藏方法。
操作步骤：
液体石蜡预处理
斜面培养物制备
优质化学纯液体石蜡 灭菌： 121℃湿热灭菌30min，蒸发 水分； 160 ℃干热灭菌2h； 冷却至室温。
1、安瓿管的准备
清洗
选用中性玻璃材质的安瓿管； 2%盐酸浸泡8～10h，自来水冲洗至中性，蒸馏水冲洗2～3次； 置于烘箱中烘干。 棉塞 打棉塞，160℃定型2h； 标签 激光打印标签，标明菌株编号和保藏日期，大小约10×20mm。 喷码于安瓿管外，160℃固定20min。 灭菌 同一菌种安瓿管包在一起， 121 ℃湿热灭菌30min.
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应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再 用来保藏。
保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试 管应严格密封。
这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的 长期保藏。
二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃)
要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60℃以 下进行保藏。 在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是：
1．离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞； 2．用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞； 3．加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜； 4．混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超 低温冰箱中保藏。
如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含10％ 甘油的新配制液体培养基洗涤收获。超低温冰 箱的冷冻速度一般控制在1-2℃／min。若干细 菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活 力不受影响。
5.抗菌素菌种保藏管理中心(CACC) 中国医学科学院抗菌素研究所,北京(IA),100050 四川抗菌素工业研究所,成都(SIA),610051:新抗菌素菌种 华北制药厂抗菌素研究所,石家庄(IANP),050015:生产用抗菌素菌种
6.兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC) 农业部兽医药品监察所,北京(CIVBP),100081
7.林业微生物菌种保藏管理中心(CFCC)
中国林业科学院,北京(CAF),100091
二、工业微生物菌种保藏技术
(1)超低温或在液氮中冷冻保藏； (2)冷冻干燥或真空干燥保藏； (3) 转接培养或斜面传代保藏； (4)土壤或陶瓷珠等载体于燥保藏。
菌种保藏方法
暂时保藏法
斜面传代法 穿刺法
长期保藏法
三、液氮冷冻保藏技术
(一)冷冻保护剂
在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是 二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油 10％、二甲亚砜5％。所使用的甘油—般用高 压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。
(二)液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤
1．待冷冻保藏菌种悬液的制备
(1)从生长斜面制备菌悬液：每一斜面加入5ml含 10％甘油的营养液体培养；用巴氏吸管吹吸斜面制 成孢子及菌体细胞悬液；0.5～lml分装玻璃安瓿或 液氮冷藏专用塑料瓶。
液体石蜡法 甘油管法 砂管保藏法 砂土管保藏法 滤纸片保藏法 冷冻干燥保藏法 液氮冷冻法
2.1 冷冻保藏
冷冻保藏为保藏微生物菌种的最简单而有效的 方法。 通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言， 冷冻温度愈低，效果愈好。为了获得满意的冷 冻结果，通常应在培养物中加入一定的冷冻保 护剂。冷冻保藏时温度要求在-20℃以下，同 时应认真掌握好冷冻速度和解冻速变。 冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。
CAF
中国林业科学院菌种保藏管 理中心
CICC
工业微生物菌种保藏管理中心
IFFI
轻工业部食品发酵工业科学 研究所
CMCC
医学微生物菌种保藏研究 所
NICPB
卫生部药品生物制品监察所
IV 中国医学科学院病毒研究所 CVCC 兽医微生物菌种保藏管理中心
CIVBP 中国兽医药品监察所
YM 云南省微生物研究所
中国微生物菌种保藏管理委员会组织机构
中国微生物菌种保藏管理委员会办事处(CCCCM): 中国科学院微生物研究所内,北京(AS),100080
1. 普通微生物菌种保藏管理中心(CCGMC) 中国科学院微生物研究所,北京(AS),100080:真菌、细菌 中国科学院武汉病毒研究所,武汉(AS-IV),430071:病毒
第九节 工业微生物菌种保藏技术
在生产发酵中，具有高产有重要经济价值 的某一期待代谢产物主能力的微生物菌种的保 存和长期保藏，对于一成功的工业发酵过程极 为重要。
一、理想的菌种保藏方法应具备 的条件
(1) 经长期保藏后菌种存活健在； (2) 保证高产突变株不改变表型和基因型，特别
是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的 高产能力。 (3)菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。
冷冻保藏种类
一、普通冷冻保藏技术(-20℃) 二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃) 三、液氮冷冻保藏技术
普通冷冻保藏技术(-20℃)
将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接 到试管或指管肉，然后贮藏于一冰箱的冷藏室中， 或于温度范围在-5～-20℃的普通冰箱(-20℃)中。 或者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待 生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同 上置于冰箱中保存。 用此方法可以维持若干微生物的活力1—2年。
名称
缩写
名称
中国农业微生物菌种保藏管
中国农业科学院土壤肥料研究
ACCC 理中心
ISF 所
SH
上海市农业科学院食用菌研 究所
CACC
抗菌素菌种保藏管理中心
IA
中国医学科学院抗菌素研究 所
SIA
四川抗菌素工业研究所
CCGM 普通微生物菌种保藏管理中 C心
AS
中国科学院微生物研究所
AS-IV 中国科学院武汉病毒研究所 CFCC 林业微生物菌种保藏管理中心
对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能 多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方 法的失败而导致菌种的丧失。
国际重要菌种保藏机构
缩写
名称
ATCC 美国标准菌种保藏所，美国马里兰州，罗克维尔市
CBS 真菌中心收藏所，荷兰，巴尔恩市
NCT 国立标准菌种保藏所，英国，伦敦 C
中国菌种保藏单位
缩写
一、微生物菌种保藏
基本要求：
在一定时间内使菌种不死、不变、不乱
基本方法：
生活态
培养基传代培养 斜面、平板 寄主传代培养
休眠态
冷冻 干燥
液氮、低温冰箱 沙土管、冷冻真空干燥
由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不 同的保藏方法有不同的适应性，因此，在具体选择 保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使 用特点及现有条件等进行综合考虑。
2.农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC) 中国农业科学院土壤肥料研究所,北京(ISF),100081
3.工业微生物菌种保藏管理中心(CICC) 轻工业部食品发酵工业科学研究所,北京(IFFI),100027
4.医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC) 中国医学科学院皮肤病研究所,南京(ID),210042:真菌 中国药品生物制品检定所,北京(NICPBP),100050:细菌 中国医学科学院病毒研究所,北京(IV),100052:病毒