生化分离工程 知识点
生化分离工程
错流过滤 研 磨 错流过滤 超 滤 吸 附 喷 干
憎 水 结晶
电泳
基本定义
生化分离工程的定义：
为提取生物产品时所需的原理、方法、技术及相 关硬件设备的总称，指从发酵液、动植物细胞培 养液、酶反应液和动植物组织细胞与体液等中提 取、分离纯化、富集生物产品的过程 (Downstream Processing)。
1）、在设计前，首先要掌握的产物物化性质，主要包括：
(1)、溶解度及影响因素，包括温度、pH值、有机溶剂和盐等； (2)、分子量和分子形状。对于高分子物质非常有意义； (3)、沸点和蒸汽压。对于热稳定的小分子物质非常有意义； (4)、极性大小； (5)、分子电荷及影响因素，包括pH值和盐等； (6)、功能团。功能团为萃取剂和特异性吸附的选择提供依据； (7)、免疫原性。设计亲和色谱； (8)、稳定性及其影响因素，包括温度、pH值、毒性试剂等(如青霉素
6)、提供产品竞争力的关键技术之一。WTO，降低生产成本、 提高产品标准。
7)、环境污染的治理（慢性铅中毒）
作业：检阅文献，谈谈分离科学的作用
刊原：
1)、纯分离分析期刊：Bioassay(IF = 6.227); Anal. Chem.(IF = 4.650); Separ. Purif Method(IF = 3.600); Electrophoresis(IF = 3.465); Adv. Chromatogr (IF = 3.067); J Chromatogr A(IF = 2.768); LC GC-Mag Sep Sci(IF = 2.393); J Chromatogr B(IF = 1.867)。调研论文数/月、本学科国际发展的速度
1）、凝胶 2）、亲和色谱 3）、离子交换
生化分离工程重点
第一章绪论1、生物工程学的概念，生物工程学的研究领域。
2、生物分离工程的概念。
3、生物分离加工过程按工艺流程顺序可分为四个主要阶段：发酵液的预处理、提取、精制和成品加工。
第二章发酵液的预处理1、发酵液的一般特征有哪些？发酵液预处理的目的和要求有哪些？2、发酵液预处理的方法有哪些？并简述各种方法的原理和特点？3、发酵液过滤的目的是什么？影响发酵液过滤速度的因素有哪些？第三章细胞分离技术1、常用细胞分离方法有哪些？并说明其原理。
2、什么是细胞破碎和细胞破碎率？细胞破碎的方法主要有哪些？其原理各是什么?3、什么是包含体？包含体形成的原因有哪些？包含体的溶解常用的试剂有哪些？4、蛋白质复性常用的方法有哪些?第四章沉淀技术1、沉淀的概念？2、常用的蛋白质沉淀的方法有哪几种（盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法），各自的作用机理是什么？第五章萃取技术1、萃取，萃取剂，萃取液，萃余液的概念？2、萃取法的分类。
3、分配定律内容及其适用条件。
4、简述液液萃取的一般操作过程。
5、影响有机溶剂萃取的主要因素有哪些？如何选择有机溶剂？6、什么是乳化现象？消除乳化现象常用的方法有哪些？7、简述双水相的形成？并说明其形成的原因？8、常用的双水相系统的类型有哪些？影响双水相分配系数的主要因素有哪些？9、什么是液膜？并简述液膜的组成、液膜体系、液膜的分类、液膜分离机理、。
10、试述液膜的分离过程。
并简述影响液膜分离效果的因素。
11、简述胶团及反胶团的形成。
12、简述反胶团萃取蛋白质的原理。
说明影响反胶团萃取蛋白的主要因素。
13、制备反胶团系统的方法主要有哪些？14、简述反胶团萃取蛋白质的过程。
15、什么是液固萃取？什么是超临界流体？第六章膜分离过程1、什么是膜分离过程？2、根据推动力本质的不同膜分离过程分为哪几类？各种分离过程的原理是什么？3、膜的概念及膜的特征?4、什么是浓差极化?5、什么是膜污染？膜污染的控制方法有哪些？膜清洗方法主要有哪些？第七章吸附与离子交换1、吸附的概念。
生化分离技术重点
一、凝胶的性质1、Gel的定义：含大量液体的具有三维网状开孔弹性结构的多聚体结构，一般制成球状颗粒。
2、Gel的要求⑴多孔、孔隙区大，Vi （内水体积）要大⑵亲水⑶惰性⑷稳定⑸色谱性能好2.凝胶介质性质（1）粒度：指溶胀后的凝胶水化颗粒的大小，粒度越小，分离效果越好，但能分离样品量减少，细颗粒介质适用于分析性分离；凝胶颗粒大，可分离样品量提高，适合于中小规模的制备型分离。
（2）交联度和网孔结构：交联剂的用量决定凝胶颗粒的交联度。
（3）机械强度：一方面取决于基质的种类，另一方面在基质相同的情况下，交联度越高，介质强度越大（4）物理和化学稳定性：物理稳定性——承受高温高压的情况、化学稳定性——首先是pH稳定性；要求介质在各种试剂中具有稳定性，包括去污剂，变性试剂；要求对有机溶剂具有耐受性膜分离（微滤，超滤，纳滤的比较范围）常用膜分离技术的基本特征不同操作类型膜的膜孔范围及操作对象三、沉淀的影响因素沉淀定义：溶液中溶质由液相变成固相析出的过程本质：通过改变条件使胶粒发生聚结，降低其在液相中的溶解度，增加固相中的分配率。
作用：分离、澄清、浓缩、保存盐析：纯一单蛋白质有公式：lgS = β－kS×IS为蛋白质溶解度（g/L）；β为I=0时lgS，它取决于溶质的性质；kS为盐析常数，主要决定于加入盐的性质及Pr性质。
I为盐浓度（mol/L）盐析影响因素：1． kSI的变化：盐、Pr一定，kS值一定，I升高，则蛋白质溶解度下降2．降低ββ与Pr、温度、pH有关β—pH：在Pr的pI时其溶解度较小β—温度：在保证Pr不变性下，温度升高，β下降，利于盐析。
3蛋白质原始浓度：蛋白质原始浓度小，盐析所需I高，蛋白质浓度大，盐析所*对混合Pr的盐析，蛋白质浓度过高，会发生严重共沉作用，一般控制浓度为2.5～3%。
有机溶剂沉淀法影响因素：1. 温度: 低温，温差分级沉淀2. pH ：据等电点控制3. 浓度：蛋白0.5％～3％，黏多糖1％～2％4. 离子强度：高时，沉淀所需有机溶剂浓度大5. 有机溶剂的选择：常用乙醇、丙酮、甲醇6. 多价阳离子的影响：蛋白质与Zn2+、Ca2+等形成复合物，使蛋白质在水和有机溶液中的溶解度大大降低7. 溶剂用量V= V0（S2－S1）/（100－S2）等电点沉淀法影响因素：1杂质种类影响2离子强度的影响3溶质表面极性的影响：等电点沉淀一般适合于疏水性较大的蛋白质，因为其表面水化层较薄非离子多聚物沉淀法：PEG及其他非离子多聚物应用于生物大分子微粒病毒和细菌的沉淀时，沉淀效果除与本身的浓度分子大小有关外，还受离子强度、pH和温度等因素的影响。
生化分离工程第4讲 膜分离技术
Pont
业、造纸工业等
Enka/AKZO，Gambro，Asahi Chemical
血液渗析、工业 废液等
Amicon Corp.，Koch Eng.Inc.， 制药工业、乳品
Nittl Denko
工业等
Permea/Air Prod.，Ube Ind.， Hoechst/Celanese
医疗、燃烧过程 等
膜分离优点和缺点
➢ 在常温下进行 ➢ 有效成分损失极少，特别适用于热敏性物质，如抗生素等医药、果汁、酶、蛋白的分离与浓缩
➢ 无相态变化 保持原有的风味，能耗极低，其费用约为蒸发浓缩或冷冻浓缩的1/3-1/8
➢ 无化学变化 典型的物理分离过程，不用化学试剂和添加剂，产品不受二次污染
➢ 选择性好 可在分子级内进行物质分离，具有普遍滤材无法取代的卓越性能
10. 亲和膜分离技术概念及特点 • 11 . 电渗析的工作原理 • 12.膜的污染与处理？
膜科学的发展史
年代
科学家
主要内容
1748 1827
Abbe Nollet Dutrochet
水能自发地穿过猪膀胱进入酒精溶液，发生 渗透现象
名词渗透作用（Osmosis）的引入
1831
J.V.Mitchell 气体透过橡胶膜的研究
硝酸纤维膜的出现。
初次成功使用了人工肾 合成膜的研究，发明了电渗析，微孔过滤和血液透析等 分离工程 相转化法制出了非对称反渗透膜 发明了液膜 制出了界面反应聚合复合膜
膜工业的发展史
分离过程 年代
目前主要厂商
应用
微滤 电渗析 反渗透
渗析 超滤 气体分离 渗透汽化
1925 1960 1965 1965 1970 1980 1990
生化分离工程
生化分离工程复习资料第一章绪论1.生化分离工程的定义：为提取生物产品时所需的原理、方法、技术及相关硬件设备的总称，指从发酵液、动植物细胞培养液、酶反应液和动植物组织细胞与体液等中提取、分离纯化、富集生物产品的过程 (Downstream Processing)。
（生化物质主要包括氨基酸、蛋白质、多糖、核酸、抗生素、肽类物质、脂质和其他生化产品，其主要来源包括微生物、动物、植物和海洋生物等生物原料或者基因工程产物。
）2.生物分离技术在整个生物加工过程中的重要性可以从三个方面加以体现：第一，生物产物的特殊性；产物稳定性差(a 化学降解(pH , 温度); b 微生物降解（酶作用，染菌）[生物活性物质的稳定性差，对PH、温度、金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等十分敏感，易失活、变性]分批操作，生物变异性大第二，生物产物所处环境的复杂性；组分复杂(a 大分子;b 小分子;c 可溶物;d 不可溶物;e 化学添加物[除了产物外，还含有大量的细胞、代谢物、残留培养基、无机盐等；]产物浓度低的水溶液 (原因：a 氧传递限制；b 细胞量;c 产物抑制 ) 第三，对生物产品要求的严格性；质量要求高（药品或食品）[含目的产物的初始物料组成复杂，生化产品种类繁多，包括了大、中、小分子量的结构和性质复杂又各异的生物活性物质；生化产品的应用面广，许多产品用作医药、食品、试剂等，对含量和纯度要求高等。
]从而导致下游加工过程度成本往往占整个生物加工过程生产成本的大部分。
（教材中列出了若干生物制品生产过程中分离过程的成本）因此，下游加工过程的成本往往决定整个生物加工过程的成败，设计合理的下游加工过程可大大降低目标产品的生产成本，实现更大规模上的商业生产。
评价生化物质分离纯化技术的标准是纯度、收率和成本等三个因素，应从这三个方面进行综合考虑和优化才能决定最佳工艺技术。
3.下游加工技术的一般流程参照教材第3页图1.1强调如下几点：第一，流程图包括了本课程所涉及的大部分教学内容；第二，一个目标产物的获得需要进行多步处理，这样导致总收率的降低。
《生化分离工程实验》课件
CHAPTER
04
结果分析与讨论
数据记录与整理
数据记录的准确性
确保实验过程中所有数据都被准确记 录，包括但不限于温度、压力、流量 、重量等。
数据整理的规范性
将实验数据整理成表格或图表，便于 分析和对比。
结果分析
数据对比分析
将实验数据与理论值进行对比，分析 偏差产生的原因。
趋势分析
分析实验数据的变化趋势，预测未来 可能的结果。
根据选择的分离方法，设计合理 的分离流程。
控制分离过程中的温度、pH值 、浓度等参数，确保分离效果。
监测分离过程中的关键指标，如 目标成分的纯度和收率。
产物检测与鉴定
利用生化分析方法（如光谱分析、质谱分析、电泳等）对分离得到的产物进行检测 与鉴定。
比较实验结果与预期目标，评估实验的分离效果。
分析实验误差来源，提出改进措施，优化实验方案。
有机溶剂
用于提取和纯化目标产物 的有机溶剂。
实验器具与设备
发酵罐
用于进行微生物发酵的容器。
离心机
用于分离和纯化目标产物的设备。
层析柱
用于进行色谱分离的柱状设备。
CHAPTER
03
实验方法与步骤
样品处理与制备
样品收集
样品纯化
选择具有代表性的样品，确保样品新 鲜、无污染。
去除样品中的杂质，提高目标生化成 分的纯度。
误差分析
系统误差分析
分析实验过程中由于仪器、设备等因素导致的误差。
随机误差分析
分析实验过程中由于环境、操作等因素导致的误差。
CHAPTER
05
实验结论与总结
实验结论
实验结果分析
对实验过程中收集的数据进行分析，对比实验结果与预期结果的差异，评估实验 的准确性和可靠性。
生化分离工程概论共74页
3.2 生化分离工程的重要性
传统发酵工业 占60% 基因产品 占80~90%
3.3 生化分离工程的研究现状
生物领域瓶颈 产业化制约技术
4 生化分离工程的特点
系统多相性 非牛顿性流体 低浓度 稳定差 生物变异性大
5 生化分离工程的原则
时间短 温度低 pH适中（生物物质的稳定性问题） 勤洗消毒 三废处理（BOD和COD问题） 生物安全问题(对基因工程产品)， 防止菌体扩散
现代生物技术 1953年 美Watson、英Crick DNA双螺旋结构
3 生化分离工程在生物技术中的地位
生物技术、生物工程的重要组成 生化产品制备的关键步骤 单位操作同化学工程
3.1 生物技术的最新进展
(1) 基因工程方面 试管婴儿、细胞融合、蛋白质序列分析，人参培养
(2) 生物反应器 连续式，柱式、固定化酶、固定化细胞反应器
枇杷
枇杷叶
枇杷核
枇杷花
枇杷果
三萜酸、苦杏仁苷、皂苷
淀粉
膳食纤维
抗癌药
保健食品
化痰、止咳、平喘药
特种淀粉添加剂
香精香料
化妆品 gnoing
果酒
饮料
不同蛋白质的溶解度与硫酸铵浓度关系
2 生物技术的总论
2.1 生物技术树 2.2 生物技术所涉及的行业种类 2.3 美国生物技术产品销售预测 2.4 美国工业化生物技术研究与发展基金分布图 2.5 生物技术的概念
R=C15H29 (C15:1) R=C17H33 (C17:1)
聚戊烯醇
n
OR
聚戊烯醇：R＝H，n＝10～20 聚戊烯醇乙酸酯：R=Ac,n=10～20
②“柚子全组分综合利用技术”项目
生化分离工程知识点总结归纳
生化分离工程知识点归纳第一章绪论1、生物物质分离工程：在工业规模上，通过适当的分离纯化技术与装备并消耗一定的能量和分离介质来实现生物物质（产品）制备的过程，是生物产业的一个重要组成部分。
2、生物工程下游加工过程的特点：（1）成分复杂：固体成分、液体成分（2）悬液中的目标产物浓度低（3）稳定性差：化学（温度和pH值）或微生物引起的降解（4）生物产品质量要求高：纯度、卫生、生物活性3、下游加工过程的一般流程（4个阶段）：发酵液的预处理与固液分离、初步纯化（提取）、高度纯化（精制）、成品加工。
4、某一具体产品的分离提取工艺设计中应考虑的问题：①产物本身的性质；②是胞内产物还是胞外产物；③原料中产物和主要杂质浓度；④产物和主要杂质的理化特性及差异；⑤产品用途和质量标准；⑥产品的市场价格；⑦不同分离方法的技术经济比较及废液的处理方法等。
第二章发酵液的预处理与过滤1、发酵液的预处理发酵液的预处理的方法：（1）加热：最简单、最经济的预处理方法是加热，降低料液黏度，也可以对其进行灭菌。
但加热变性的方法只适合于对热稳定性的产物。
（2）调节料液的pH值：促进全细胞聚集。
（3）凝聚和絮凝：凝聚是指通过加入简单电解质降低了胶体粒子间的排斥电位，从而使得范德华引力起主导作用，聚合成较大的胶粒，粒子的密度越大，越易分离。
常用凝聚剂多为阳离子型如明矾、三氯化铁。
絮凝是指预处理时加入絮凝剂（通常指天然或合成的生物大分子聚电解质）既能降低排斥电位，又吸附了周围的微粒，形成桥架作用，促使胶粒形成粗大，密度低的絮凝团。
这些絮凝团很容易被过滤得到。
主要絮凝剂：聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、多聚胺衍生物。
（4）使用惰性助滤剂：硅藻土、珍珠岩。
2、真空过滤器的优点：连续自动操作,节省人力，生产能力大。
真空过滤器的缺点：附属设备多，投资费用高，推动力小适用于量大易过滤的料液。
3、压滤器的优点：过滤推动力大，过滤面积大。
压滤器的：缺点：板框压滤机劳动强度大，投资、维护费用高。
生化分离工程基本概念复习要点
生化分离工程基本概念复习要点生化分离工程基本概念复习要点一类1、过滤是指利用多孔介质（滤布）截留固液悬浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法。
速度和质量是过滤操作的指标，滤饼阻力是关键，故先多对滤液絮凝或凝聚处理，或加助滤剂如硅藻土等。
2、广泛用于生化实验室及生化工业的分离设备是离心机，根据其离心力大小可分为:低速离心机、高速离心机和超离心机。
细胞的分离一般可用低速离心机或高速离心机，蛋白质的分离一般要用超离心机。
3、膜在分离过程中功能：①物质的识别与透过；②相界面；3、反应场。
4膜分离过程的实质是物质透过或被截留于膜的过程，按分离粒子大小进行分为微滤（MF）超滤（UF）反渗透（RO）透析（DS）电渗析（ED）和渗透气化（PV）等，其中传质推动力为压差和浓差，适合于有机物与水分离，共沸物分离的是渗透气化（PV）。
5、膜组件主要有管式、中空纤维、螺旋卷绕式、平板式，其共同的特点是尽可能大的膜表面积、可靠的支撑装置、可引出透过液、膜表面浓度差极化达到最小。
6、双水相萃取的特点为：平衡时间短、含水量高、界面张力低、为生物活性物质提供了温和的分离环境。
操作简便、经济省时、易于放大。
7、液膜根据结构可分为多种，但具有实际应用价值的主要有三种乳状液膜、支撑液膜、流动液膜。
8、在双水相系统中，影响分配系数的主要因素有，成相聚合物分子质量和浓度、盐的种类和浓度、PH值、温度。
9、溶质、溶剂、萃取剂、萃取相、萃余相10、超临界流体的密度接近于液体，这使它具有液体溶剂相当的萃取能力；超临界流体的粘度和扩散系数又于气体相近似，而溶剂的低粘度和高扩散系数的性质也是有利于传质。
11、离子交换树脂按活性基团不同可分为强酸性阳离子交换树脂在PH1~14范围内均可使用、弱酸性阳离子交换树脂、强碱性阴离子交换树脂、弱碱性阴离子交换树脂只能在PH<7的溶液中使用，按理化性质分类透明的凝胶型树脂，吸水后形成微细的空隙，失水后，孔隙消失。
生化分离工程
生化分离工程生化分离工程1. 生物工程的分支学科及相关定义：基因工程，细胞工程，酶工程，发酵工程2. 生化分离工程定义：为提取生物产品时所需的原理方法技术以及相关设备的总称，指从各种发酵液，培养液，反应液和动植物组织细胞中提取分离纯化富集生物产品的过程。
3. 生化分离所得产物特点：A:产物浓度低的水溶液，受氧传递限制，细胞量和产物抑制;B:组分复杂，可以使小分子，大分子，可溶或不可溶物，化学添加物等；C：产物稳定性差，化学降解或微生物降解；D：分批操作，生物变异性大；E：质量要求高，尤其是食品和药品。
4. 从工业发酵范畴来看，从发酵醪中获得的产物大致有三类：菌体，酶，代谢产物5. 生化产品后处理过程生化分离技术所要满足的条件：可答条件温和，专一性强，选择性好，产率高，快速生产之类，相当于生物反应的特点，写多少算多少。
6. 生化分离工程选择原则：步骤少；次序合理；产品规格的要求；生产规模，物料组成，产品形成及其稳定性等。
若为问答题再接着吹，每条后面补充点例子。
7. 适合生物小分子的单元操作：吸附，离子交换，沉淀，溶剂萃取，超滤，结晶；适合于大分子的单元操作：沉淀，双水相萃取，逆胶束萃取，超滤，层析。
8. 分离效率的评价：浓缩率，分离因子，回收率，纯化因子9. 生化分离工程发展趋势：往基础理论的研究，完善老技术，发明新技术，高效分离技术的工程化，环保化等方面胡诌。
10. 生化分离工程的单元操作按生产加工过程可分为四个阶段：发酵液预处理，分离提取，精致纯化，后期成品加工11. 发酵液预处理的作用：改变发酵液物理性质，产物转入液相中，除去发酵液中部分杂质12. 预处理方法：加热可使粘度降低，加入盐类可除去高价无机离子，调节PH。
13. 名词解释：凝聚：中性盐的作用下，双电层排斥电位的降低而使胶体体系不稳定的现象；絮凝：某些高分子絮凝剂的作用下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的物理集合过程；混凝：前两者集合的过程；凝聚值：使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度，用来表示电解质的凝聚能力。
《生化分离工程》整理
第一章绪论1、何为生化分离技术？其主要研究那些内容？生化分离技术是指从动植物组织培养液和微生物发酵液中分离、纯化生物产品的过程中所采用的方法和手段的总称。
第二章预处理、过滤和细胞破碎6、影响过滤的因素及改善措施？影响过滤性能的因素主要有:①混合物中悬浮微粒的性质和大小;②混合液的粘度;③操作条件：固液分离操作中温度、pH、操作压力、滤饼厚度等;④助滤剂的使用;⑤固液分离设备和技术改善过滤性能的方法:工艺上一般采用降低混合液粘度的方法、增大被分离颗粒的粒度或者在混合液中加入助滤剂的方法、提高离心机的转速或提高操作压力、增大真空度、降低滤饼层的厚度，或除去滤饼等方法以改善过滤性能。
1、机械法细胞破碎与非机械破碎相比有何特点？2、细胞破碎主要有那几种方法？10、何谓化学法破碎细胞？其原理是什么？包括那几种？细胞破碎技术:（一）机械法①珠磨法:在磨腔中装入小玻璃球或小钢球，由电动机带动搅拌碟片高速搅拌微生物细胞悬浮物和小磨球而产生剪切力，将细胞破碎，释放出内含物。
一般有立式或卧式两种珠磨机;②高速匀浆法:利用高压使悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎。
设备是高速匀浆器，由高压泵和均压阀组成;③超声破碎法:另一种液相剪切破碎法，常为实验室方法.当通过超声探头向悬浮液输入声能，大量声能转化成弹性波形式的机械能，引起局部的剪切梯度，使细胞破碎。
（二）非机械方法①酶法溶胞:利用酶分解细胞壁上特殊的化学键使之破裂。
②化学法:用某些化学试剂溶解细胞壁或抽提细胞中某些组分，改变细胞壁或膜的通透性，从而使内含物有选择性地渗透出来。
包括酸碱条件改变pH、有机溶剂法、表面活性剂法等。
③物理法如渗透压冲击法、冻融法、干燥法等。
11、何为包涵体？包涵体中分离产物一般包括哪几个步骤？所谓包涵体是指蛋白质分子本身及与其周围的杂蛋白、核酸等形成不溶性的，无活性的聚集体，其中大部分是克隆表达的目标产物蛋白。
从包涵体中分离产物的处理步骤为：收集菌体细胞→细胞破碎→离心分离→包涵体的洗涤→目标蛋白的变性溶解→目标蛋白的复性。
生化分离工程 知识点
一、沉淀法名解：沉淀与结晶：盐析和盐溶:在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。
有机溶剂沉淀法：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。
知识点：常用的蛋白质沉淀方法有哪些？盐析法，等电点沉淀法，有机溶剂沉淀法，非离子型聚合物沉淀法，聚电解质沉淀金属离子沉淀法防止蛋白质沉淀的屏障有蛋白质周围的双电层和水化合膜。
Cohn经验方程式。
在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱。
等电点沉淀的操作条件是蛋白质分子以两性离子形式存在和其分子净电荷为零(即正负电荷相等) 。
溶液的pH大于等电点时，蛋白质带负电荷，溶液的pH小于等电点时，蛋白质带正电荷。
有机溶剂沉淀时，蛋白质的相对分子质量越大，则有机溶剂用量越少；在溶液等电点附近，则有机溶剂用量越少。
在蛋白质颗粒和溶液界面之间的三种电位。
见下题请简述双电层理论。
在蛋白质颗粒和溶液界面之间存在有三种电位：①胶核表面的电位φ0，是整个双电层的电位或称Nernst电位；②Stern平面上的电位φs；③在滑动面上的电位ξ称ξ电位(或称电动电位)。
这三种电位中只有ξ电位能实际测得，所以认为它是控制胶粒间电排斥作用的电位。
它取决于Nernst电位和反离子的浓度及电荷大小，即随着溶液中离子浓度和价数的升高，ξ电位下降，从面使颗粒间斥力强度减小，溶液趋于不稳定，蛋白质也就会沉淀下来。
沉淀法分离蛋白质有哪些特点？①分离前期就可使原料液体积很快地减小10－50倍，从而简化生产工艺、降低生产费用，浓缩与纯化合二为一；②使中间产物保持在一个中性温和的环境；③可及早地将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合的溶液中分离出来，避免蛋白质的降解，提高产物稳定性；④用蛋白质沉淀法作为色谱分离的前处理技术、可使色谱分离使用的限制因素降低到最少。
生化分离考点
1. 生化分离过程的特点：（1）生物物质的生活活性大多是在生物体内的温和条件下维持并发挥作用的；（2）用作医药、食品和化妆品的生物产物与人类生命息息相关；（3）原料液中常存在与目标分子在结构、构成成分等理化性质上极其相似的分子及异构体，形成用常法难于分离的混合物；（4）原料液中目标产物的浓度一般很低，有时甚至是微量的。
2. 分离效率的评价（三个指标）：浓缩程度、分离纯化程度、回收率3. Stokes 沉降方程式中，d p 为固体颗粒径（m ），ρs 为固体密度（kg/m ³），ρL 为液体密度（kg/m ³），g 为重力加速度（kg/m ³），v g 为重力沉降速度（kg/m ³），μL 为液体黏度。
4. 区带分离法：是生化研究中的重要分离手段，根据立新操作条件不同，分为差速区带离心和平衡区带离心，两种区带离心法均事先在离心管中用某种低分子溶质调配好密度梯度，在密度梯度之上加待处理的料液后进行离心操作。
5. 离心分离设备：常用的有管式和碟片式两大类。
6. 革兰氏阴性和阳性的区别：革兰阳性菌的细胞主要由肽聚糖层组成，而革兰阴性菌的细胞壁在肽聚糖层的外侧还有分别由脂蛋白和脂多糖及磷脂构成的两层外壁层。
革兰阳性菌的细胞壁比较厚，约15-50nm ，肽聚糖含量占40%-90%；革兰阴性菌的肽聚糖层约1.5-2.0nm ，外壁层约8-10nm 。
因此，革兰阳性菌的细胞壁比革兰阴性菌坚固，较难破碎。
7. 习题：管式离心机的转筒内径为12cm ，筒长70cm ，转数为15000r/min 。
设离心机的校正系数为一，利用其浓缩酵母细胞悬浮液，处理能力为4.0L/min 。
（1）计算酵母细胞的重力沉降速度；（2）破碎该酵母细胞后，细胞碎片直径减小到原细胞的1/2，液体黏度上升3倍，在相同条件下离心浓缩该细胞破碎液，试计算此时离心机的处理能力。
(1)2222g Lr w Q v g π=,72222249.8 4.1810/1500022 3.140.70.12()60g Qg v m s Lr w π-⨯===⨯⨯⨯⨯⨯ (2)21212111,,216p p L L g g d d v v μμ=== 8. 盐析原理： 蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、发生沉淀的现象称为盐析(Salting-out)。
生化分离工程复习
生化产品的一般特点
1) 体系复杂：目的产物存在于非常复杂的体系中
组分复杂(a 大分子;b 小分子;c 可溶物;d 不可溶 物;e 化学添加物）
生物技术产品以粗料发酵为主，增加了下游操作成 本及废液处理成本
目前发酵或培养分批操作，各批差异，还有染菌发 酵液。
3
2） 目标产物浓度低、杂质含量高
许多工艺设计理论性不强，实验结果常带有很大经验成分。
7
分离效果的评价
1）浓缩率（富积率，concentration factor）
原料(Raw material)
分离器
产品(Product)
FW, VW, cT,W, cX,W
废液(Waste fluid)
如mT >1，则目标产物得到富积；
8
2）分离度
捣碎法 研磨法 匀浆法 超声法 温度差破碎法 压力差破碎法
有机溶剂： 表面活性剂： 酸碱 自溶法 外加酶制剂法
26
细胞壁的组成和结构
微生 物 壁厚
层次 主要 组成
革兰氏 阳性细菌
20-80 nm
革兰氏 阴性细菌
10-13 nm
单层
多层
肽聚糖(40-90%) 肽聚糖 (5-10%)
多糖
脂蛋白
胞壁酸
脂多糖(11-22%)
操作形式： A、离心沉降；B、离心过滤；C、密度梯度(超离心)。
25
细胞破碎技术
机械破碎 物理破碎 化学破碎 酶促破碎
通过机械运动产生的剪切力， 使组织、细胞破碎。
通过各种物理因素的作用，使组 织、细胞的外层结构破坏，而使 细胞破碎。
通过各种化学试剂对细胞膜的 作用，而使细胞破碎
通过细胞本身的酶系或外加酶制 剂的催化作用，使细胞外层结构 受到破坏，而达到细胞破碎
生化分离课堂教学的知识点、重点和难点汇总
课堂教学的知识点、重点和难点汇总1．生化分离过程概论知识点：生化分离工程在生物技术中的地位，传统生化产品和基因工程产品回收方法的比较，生化分离工程的特点，生化分离工程的一般流程和单元操作，生化分离工程的发展趋势。
重点：掌握生化分离工程的概念、特点及其操作的常规程序，生化分离工程的地位及其发展趋势。
难点：一般流程和单元操作。
2．发酵液的预处理和固液分离的方法知识点：发酵液的预处理，发酵液的过滤重点：发酵液中的几种杂质的去除方法和影响过滤的因素，并能在实际处理中灵活应用，凝聚技术的原理及改善过滤性能的方法。
难点：预处理方法的灵活运用。
3．微生物细胞的破碎知识点：细胞壁的组成和结构，微生物细胞的破碎技术，破碎率的测定。
重点：工业生产中常用的几种细胞破碎方法的原理，操作过程常用设备，并能就实际生产情况予以合理的选择。
难点：常用破碎方法的合理选用。
4．沉淀法知识点：盐析法，等电点沉淀法，有机溶剂沉淀法，选择性变性沉淀法，金属离子沉淀法。
重点：上述几种沉淀方法的概念、原理及其适用范围，盐析法的影响因素对沉淀效果的影响，并能据实际情况予以灵活应用和选择。
难点：常用沉淀方法的灵活运用。
5．膜分离过程知识点：膜分离过程的分类及定义，膜分离机理，表征膜性能的参数，膜分离传递理论，超滤速度的影响因素，超滤膜污染及再生，超滤的操作方式及设备，膜分离过程的应用实例。
重点：膜分离过程的分类，概念，实质及其适用范围。
超滤速度的四种影响因素的影响情况，超滤膜污染的三种常规处理方法，膜分离机理的两种模型（即毛细管流动模型和溶解扩散模型）,传递理论中过滤模型和浓差极化问题，超滤器的型式及其方式。
难点：膜分离机理和传递理论。
6．溶剂萃取法知识点：分配定律，溶剂的选择，水相条件的影响，乳化和去乳化，萃取方式的选择和效果的判断。
重点：分配定律的推导过程，水相条件的影响因素的影响情况，并能据实际生产情况予以选择应用，乳化和破乳化技术及萃取方式的选择，熟记所举的有关蛋白质，抗生素，中药制品的萃取例子。
《生化分离工程》课件
利用离心机的高速旋转产生的离心力 场，使不同密度的物质在离心管内分 层，从而实现分离。
生化分离工程的应用领域
制药工业
生化分离工程在制药工业中应 用广泛，涉及抗生素、蛋白质 、酶等生物药物的分离纯化。
食品工业
在食品工业中，生化分离工程 用于提取植物和动物中的营养 成分，如蛋白质、脂肪、糖类 等。
环保工程
DNA提取与纯化案例
要点一
总结词
通过化学裂解、离心分离和DNA吸附等技术，实现DNA的 提取与纯化。
要点二
详细描述
DNA提取与纯化是生化分离工程中的重要应用之一。化学 裂解和酶消化是常用的DNA提取方法，通过破坏细胞膜和 核膜，释放出DNA。离心分离用于去除细胞碎片和蛋白质 等杂质。DNA吸附技术如硅胶吸附和磁珠吸附等，能够高 效地去除其他杂质，获得高纯度的DNA样品。
将原料的pH值调节至适宜 的范围内，以便后续处理 。
加热与冷却
根据需要加热或冷却原料 ，以改变其物理性质或化 学性质。
细胞破碎
机械破碎
通过高速搅拌、研磨或高 压破碎等方法破坏细胞壁 ，释放细胞内的物质。
酶解破碎
利用酶分解细胞壁，实现 细胞内物质的释放。
化学破碎
利用化学试剂溶解或腐蚀 细胞壁，实现细胞内物质 的释放。
吸附法
利用吸附剂的吸附作用将目标物质从溶液中分离出来 。
浓缩与干燥
蒸发浓缩
通过加热蒸发溶剂，使溶液浓缩至一定体积。
冷冻浓缩
通过降低温度使溶液中的水分结冰，从而实现浓 缩。
干燥
将浓缩后的溶液进行干燥，得到固体产物。
04
生化分离工程设备
离心机
离心机是利用离心力对混合物进行分离的设备，根据其转速和分离原理，可以分为 多种类型，如普通离心机、高速离心机和超速离心机等。
生化分离讲义
一、绪论1、生化分离技术：生物技术下游加工过程（Downstream Processing）生化物质的提取分离精制，是生物化学工程的一个重要组成部分。
2、分离对象特点：多数是生物活性分子，如激素、蛋白质、酶、核酸、多糖等。
3、分离对象结构：单体大分子复合分子超分子复合物细胞器。
4、生化分离技术包括：层析分离，沉淀分离，电泳分离，超离心分离，膜分离技术。
5、生化分离的特点：（具经验性，均一性的相对性）（1）组分复杂：细胞细胞碎片、蛋白质、核酸、脂类、糖类、无机盐等；（2）浓度低：青霉素：3.6%，庆大霉素：0.2%，胰岛素：0.001%；（3）分离过程中容易失活：pH、离子强度、温度等变化；（4）性质不稳定：空气氧化、微生物污染、蛋白质水解等。
6、生化分离技术的分类：（1）制备技术：获得生物体内某一单纯组分。
（2）分析技术：各组分分离后定性、定量、鉴定。
7、分离效率的评价评价一个分离过程的效率主要有三个标准：目标产物的浓缩程度，分离纯化程度，回收率。
8、下游加工过程遵循的原则（1）时间短；（2）温度低；（3）pH适中；（4）勤清洗、消毒二、发酵液预处理1、发酵液的过滤（1）助滤剂：悬浮液中的颗粒很细时，过滤时很容易堵死过滤介质的孔，或所形成的滤饼在过滤的压力差作用下，孔隙很小，阻力很大，使过滤困难。
（2）常用助滤剂：a、硅藻土：由硅藻土经干燥或煅烧，粉碎、筛分而得到粒度均匀的颗粒，其中主要成分为含80～95％SiO2的硅酸b、珍珠岩：珍珠岩粉末在1000℃下迅速加热膨胀后，经粉碎、筛分得到粒度均匀的颗粒，其主要成分为含70％SiO2的硅酸铝c、石棉：石棉粉与少量硅藻土混合而成d、炭粉、纸浆粉等（3）助滤剂的要求a、能形成多孔饼层的刚性颗粒；b、具化学稳定性；c、具不可压缩性：在过滤操作压强差范围；d、助滤剂的添加量，一般在固体颗粒重量的0.5%以下。
2、离心（1）离心：分离细胞，除去或回收菌体或细胞、血球细胞、细胞器、病毒、蛋白质的分离。
生化分离工程知识点二
生化分离工程分离复习总结第一章绪论1、生物物质和生物分离：（1）抗生素多采用有机溶剂萃取法，如青霉素采用乙酸丁酯法。
（2）有机酸采用中和沉淀法（Ca(OH)2形成钙盐沉淀，加浓硫酸析出有机酸溶液，浓缩，结晶。
）、低浓度采用离子交换树脂法。
（3）除蛋氨酸、胱氨酸、半胱氨酸外，18种氨基酸均可用直接发酵法制造。
氨基酸的分离多采用离子交换法。
（4）多糖主要采用酒精沉淀法提取，纯化采用层析法。
多糖中的黄原胶用于增稠，右旋糖酐用于代血浆。
（5）酶的分离多采用盐析沉淀法，纯化采用层析法。
最常用的盐析剂由（NH4）2SO4、卤水（MgCl2）、CaSO4（石膏）。
（6）有机溶剂主要采用精馏法。
脂类物质多用萃取法分离（有机溶剂萃取法、超临界流体萃取法）。
（7）核酸和核苷酸类物质多采用浓盐法、阴离子去污剂法（SDS）、苯酚抽提法、水抽提法。
注：任何物质都可采用层析法来纯化。
2、生化分离的一般流程：产物提取（isolation）——产物浓缩(concentration)——产物纯化(purification)——成品化（polishing）（1）提取：沉淀，萃取，膜分离（2）浓缩：蒸发，超滤，吸附，沉淀（3）纯化：层析，电泳（4）成品化：结晶，干燥，无菌过滤3、生物分离过程的特点：产品稳定性差、质量要求高、成分复杂、浓度低4、蛋白质的分离纯化：（分离用层析，纯化用色谱）（1）分离：超离心、泡沫分离、超滤、透析、双水相萃取、反胶团萃取、盐析沉淀、等电点沉淀、有机溶剂沉淀（2）纯化：色谱、电泳5、主要生物分离技术和分离机理：P7，表1-1第二章发酵液的预处理和固液分离1、发酵液杂质的去除：（1）、无机离子的去除：1）Ca2+，草酸、草酸钠，→形成草酸钙沉淀（注意回收草酸）2）Mg2+，三聚磷酸钠，→形成三聚磷酸钠镁可溶性络合物；3）Fe3+，黄血盐，→普鲁士蓝沉淀4）Fe2+，赤血盐，→滕氏蓝沉淀（2）蛋白质的除去： 1）Savage去除蛋白质2）三氯乙酸去除蛋白质3）蛋白质酶去除蛋白质2、改善培养液的性能：1）加热法2）调节pH值3）凝聚和絮凝3、凝聚和絮凝：（1）凝聚：中和电荷（通常细菌的表面都带有负电荷工业上常用阳离子型。
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一、沉淀法
名解：
沉淀与结晶：
盐析和盐溶:在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。
有机溶剂沉淀法：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。
知识点：
常用的蛋白质沉淀方法有哪些？
盐析法，等电点沉淀法，有机溶剂沉淀法，非离子型聚合物沉淀法，聚电解质沉淀
金属离子沉淀法
防止蛋白质沉淀的屏障有蛋白质周围的双电层和水化合膜。
Cohn经验方程式。
在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱。
等电点沉淀的操作条件是蛋白质分子以两性离子形式存在和其分子净电荷为零(即正负电荷相等) 。
溶液的pH大于等电点时，蛋白质带负电荷，溶液的pH小于等电点时，蛋白质带正电荷。
有机溶剂沉淀时，蛋白质的相对分子质量越大，则有机溶剂用量越少；在溶液等电点附近，则有机溶剂用量越少。
在蛋白质颗粒和溶液界面之间的三种电位。
见下题
请简述双电层理论。
在蛋白质颗粒和溶液界面之间存在有三种电位：①胶核表面的电
位φ0，是整个双电层的电位或称Nernst电位；②Stern平面上的
电位φs；③在滑动面上的电位ξ称ξ电位(或称电动电位)。
这三
种电位中只有ξ电位能实际测得，所以认为它是控制胶粒间电排斥
作用的电位。
它取决于Nernst电位和反离子的浓度及电荷大小，
即随着溶液中离子浓度和价数的升高，ξ电位下降，从面使颗粒间
斥力强度减小，溶液趋于不稳定，蛋白质也就会沉淀下来。
沉淀法分离蛋白质有哪些特点？
①分离前期就可使原料液体积很快地减小10－50倍，从而简化生产工艺、降低生产费用，浓缩与纯化合二为一；
②使中间产物保持在一个中性温和的环境；
③可及早地将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合的溶液中分离出来，避免蛋白质的降解，提高产物稳定性；
④用蛋白质沉淀法作为色谱分离的前处理技术、可使色谱分离使用的限制因素降低到最少。
蛋白质沉淀的方法有哪些？（请列举5种蛋白质沉淀的方法）。
沉淀和结晶有何区别与联系？
在本质上同属一种过程，都是新相析出的过程．主要是物理变化，当然也存在有化学反应的沉淀或结晶。
沉淀和结晶的区别在于形态的不同，同类分子或离子以有规则排列形式析出称结晶．同类分子或离子以无规则的紊乱排列形式析出称为沉淀
影响盐析的因素有哪些？
（1）离子强度对盐析过程的影响
（2）蛋白质种类：一般而言组成相近的蛋白质，分子量越大，沉淀所需的盐的量越少；蛋白质分子不对称性越大，也越容易沉淀。
（3）不同种类的盐：对蛋白质溶解度的影响主要是对Ks的影响，Ks较大就意味着盐的盐析效果较好。
（4）温度和pH值对（β）盐析的影响
如何选择盐析用盐？列举常用的盐析用盐。
A 盐析作用要强
在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱
（Ks）磷酸钾>硫酸钠>硫酸铵>柠檬酸钠>硫酸镁
B 盐析用盐需有较大的溶解度
C 盐析用盐必须是惰性的
D 来源丰富、经济
据此，常用的盐析用盐有
#硫酸铵：溶解度大（767g/L）硫酸钠磷酸盐柠檬酸盐
在有机溶剂沉淀中，有机溶剂的选择应该注意哪些？
所选溶剂和水互溶，而和蛋白不起作用，乙醇、丙酮最常用。
蛋白分子量越大，有机溶剂用量越少。
例如丙酮作为沉淀剂时用量与蛋白分子量关系：丙酮用量＝1.8－0.12ln[蛋白分子量]
一般把蛋白质沉淀过程人为的分为几个步骤？
1）初始混合：蛋白溶液与沉淀剂在剧烈搅拌下混合
2）晶核生成：形成初始固体小颗粒－晶核
3）扩散限制生长：晶核在Brownian扩散作用下，形成亚微米的核
4）流动引起的生长：核在搅拌下，碰撞聚集成絮体
5）絮体的破碎：松软的絮体在溶液剪切力小，破碎
6）聚集体的陈化：在扩散－凝聚过程中，演变为密度高的、结实的沉淀
简述有机溶剂沉析的原理。
（1）降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。
（2）由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低了亲水性，导致脱水凝聚。
简述盐析Cohn方程中，β和Ks的物理意义。
据此用盐析法分离蛋白质时可以有哪两种方法？
β值为蛋白质在纯水中即离子强度为零时的假想溶解度对数值，是pH值和温度的函数，在蛋白质等电点(pI)时最小。
Ks与温度和pH值无关，但和蛋白质及盐的种类有关。
因此，用盐析法分离蛋白质时可以有两种方法：
①在一定的pH值及温度条件下，改
变盐的浓度(即离子强度)达到沉淀
的目的，称为“Ks”分级盐析法。
②在一定的离子强度下，改变溶液的pH值及温度．达到沉淀的目的，称为“β”分级盐析法
其中，Ks盐析法由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。
而β盐析法由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的纯化。
图示利用蛋白质沉淀大规模提出白蛋白与免疫球蛋白的工艺流程。
试举例利用沉淀技术分离一种生化产物。
二、离子交换
名解：
离子交换、大孔离子交换树脂、两性树脂、螯合树脂、交换容量、表观容量、工作容量、树脂再生
知识点：
根据修饰基团的不同，离子交换树脂可分为哪四大类？
离子交换树脂的网络骨架分为人工合成的高分子材料和天然多糖交联材料两大类，人工合成的高分子材料有聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等，天然多糖交联材料主要有葡聚糖、琼脂糖，天然多糖材料有亲水性强、交换空间大、对生物大分子物质致变性作用小等优点。
离子交换树脂在结构上由哪几部分组成？
离子交换树脂的选用要考虑哪些因素？
简述离子交换机理。
影响离子交换速度的因素有哪些？
影响离子交换选择性的因素有哪些？
强酸型离子交换树脂第一次使用时有哪些预处理步骤？
离子交换树脂洗脱的原则？
三、色层分离法
名解：
正相色谱法与反相色谱法、色谱技术、色谱图(色谱流出曲线)、基线、色谱峰、保留时间、保留体积、洗脱体积、相对保留值、分离度Rs、分离因素、分配色谱、薄层层析、离子交换色谱、分子筛凝胶色谱
知识点：
色谱法按分离机理可分为几种类型？纸层析是一种层析。
置换色谱要求样品组分及置换剂的吸附等温线应为Langmuir 型，而且置换剂相对于被分离的各组分应有最的吸附能力，其吸附等温线位于所有组分的吸附等温线的。
层析柱的理论塔板数越多，则溶质的分离度越。
层析操作必须具备相和相。
按照操作方式，洗脱方法有哪三种。
使用硅胶或氧化铝柱时，最常用的配对的展开剂是和。
色谱分离技术有哪些特点？
色谱分离技术对层析介质有哪些要求？
层析介质的种类并举例。
层析柱操作基本步骤有哪些？
色谱装置主要有哪几个部件组成？
层析柱装柱操作时有哪些要求或注意事项？
吸附色谱展开剂选择的原则？
一般吸附色谱的操作程序？
分配色谱有哪些优点？
薄层法有哪些优点？
薄层色谱条件选择的原则？
HPLC使用时应注意哪几个问题？
HPLC选择流动相时应注意哪几个问题？
凝胶使用前处理要注意哪几个问题？
简述凝胶排阻色谱（分子筛）的分离原理。
根据溶质与固定相作用原理的不同，色谱分离有哪几种技术？不同色谱技术的原理及应用，举1-2个例子。