生化分离工程 知识点

一、沉淀法

名解：

沉淀与结晶：

盐析和盐溶:在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。

有机溶剂沉淀法：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。

知识点：

常用的蛋白质沉淀方法有哪些？

盐析法，等电点沉淀法，有机溶剂沉淀法，非离子型聚合物沉淀法，聚电解质沉淀

金属离子沉淀法

防止蛋白质沉淀的屏障有蛋白质周围的双电层和水化合膜。

Cohn经验方程式。

在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱。

等电点沉淀的操作条件是蛋白质分子以两性离子形式存在和其分子净电荷为零(即正负电荷相等) 。

溶液的pH大于等电点时，蛋白质带负电荷，溶液的pH小于等电点时，蛋白质带正电荷。

有机溶剂沉淀时，蛋白质的相对分子质量越大，则有机溶剂用量越少；在溶液等电点附近，则有机溶剂用量越少。

在蛋白质颗粒和溶液界面之间的三种电位。

见下题

请简述双电层理论。

在蛋白质颗粒和溶液界面之间存在有三种电位：①胶核表面的电

位φ0，是整个双电层的电位或称Nernst电位；②Stern平面上的

电位φs；③在滑动面上的电位ξ称ξ电位(或称电动电位)。这三

种电位中只有ξ电位能实际测得，所以认为它是控制胶粒间电排斥

作用的电位。它取决于Nernst电位和反离子的浓度及电荷大小，

即随着溶液中离子浓度和价数的升高，ξ电位下降，从面使颗粒间

斥力强度减小，溶液趋于不稳定，蛋白质也就会沉淀下来。

沉淀法分离蛋白质有哪些特点？

①分离前期就可使原料液体积很快地减小10－50倍，从而简化生产工艺、降低生产费用，浓缩与纯化合二为一；

②使中间产物保持在一个中性温和的环境；

③可及早地将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合的溶液中分离出来，避免蛋白质的降解，提高产物稳定性；

④用蛋白质沉淀法作为色谱分离的前处理技术、可使色谱分离使用的限制因素降低到最少。蛋白质沉淀的方法有哪些？（请列举5种蛋白质沉淀的方法）。

沉淀和结晶有何区别与联系？

在本质上同属一种过程，都是新相析出的过程．主要是物理变化，当然也存在有化学反应的沉淀或结晶。

沉淀和结晶的区别在于形态的不同，同类分子或离子以有规则排列形式析出称结晶．同类分子或离子以无规则的紊乱排列形式析出称为沉淀

影响盐析的因素有哪些？

（1）离子强度对盐析过程的影响

（2）蛋白质种类：一般而言组成相近的蛋白质，分子量越大，沉淀所需的盐的量越少；蛋白质分子不对称性越大，也越容易沉淀。

（3）不同种类的盐：对蛋白质溶解度的影响主要是对Ks的影响，Ks较大就意味着盐的盐析效果较好。

（4）温度和pH值对（β）盐析的影响

如何选择盐析用盐？列举常用的盐析用盐。

A 盐析作用要强

在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱

（Ks）磷酸钾>硫酸钠>硫酸铵>柠檬酸钠>硫酸镁

B 盐析用盐需有较大的溶解度

C 盐析用盐必须是惰性的

D 来源丰富、经济

据此，常用的盐析用盐有

#硫酸铵：溶解度大（767g/L）硫酸钠磷酸盐柠檬酸盐

在有机溶剂沉淀中，有机溶剂的选择应该注意哪些？

所选溶剂和水互溶，而和蛋白不起作用，乙醇、丙酮最常用。

蛋白分子量越大，有机溶剂用量越少。例如丙酮作为沉淀剂时用量与蛋白分子量关系：丙酮用量＝1.8－0.12ln[蛋白分子量]

一般把蛋白质沉淀过程人为的分为几个步骤？

1）初始混合：蛋白溶液与沉淀剂在剧烈搅拌下混合

2）晶核生成：形成初始固体小颗粒－晶核

3）扩散限制生长：晶核在Brownian扩散作用下，形成亚微米的核

4）流动引起的生长：核在搅拌下，碰撞聚集成絮体

5）絮体的破碎：松软的絮体在溶液剪切力小，破碎

6）聚集体的陈化：在扩散－凝聚过程中，演变为密度高的、结实的沉淀

简述有机溶剂沉析的原理。

（1）降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。（2）由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低了亲水性，导致脱水凝聚。

简述盐析Cohn方程中，β和Ks的物理意义。据此用盐析法分离蛋白质时可以有哪两种方法？

β值为蛋白质在纯水中即离子强度为零时的假想溶解度对数值，是pH值和温度的函数，在蛋白质等电点(pI)时最小。

Ks与温度和pH值无关，但和蛋白质及盐的种类有关。

因此，用盐析法分离蛋白质时可以有两种方法：

①在一定的pH值及温度条件下，改

变盐的浓度(即离子强度)达到沉淀

的目的，称为“Ks”分级盐析法。

②在一定的离子强度下，改变溶液的pH值及温度．达到沉淀的目的，称为“β”分级盐析法

其中，Ks盐析法由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。而β盐析法由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的纯化。

图示利用蛋白质沉淀大规模提出白蛋白与免疫球蛋白的工艺流程。

试举例利用沉淀技术分离一种生化产物。

二、离子交换

名解：

离子交换、大孔离子交换树脂、两性树脂、螯合树脂、交换容量、表观容量、工作容量、树脂再生

知识点：

根据修饰基团的不同，离子交换树脂可分为哪四大类？

离子交换树脂的网络骨架分为人工合成的高分子材料和天然多糖交联材料两大类，人工合成的高分子材料有聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等，天然多糖交联材料主要有葡聚糖、琼脂糖，天然多糖材料有亲水性强、交换空间大、对生物大分子物质致变性作用小等优点。

离子交换树脂在结构上由哪几部分组成？

离子交换树脂的选用要考虑哪些因素？

简述离子交换机理。

影响离子交换速度的因素有哪些？

影响离子交换选择性的因素有哪些？

强酸型离子交换树脂第一次使用时有哪些预处理步骤？

离子交换树脂洗脱的原则？

三、色层分离法

名解：

正相色谱法与反相色谱法、色谱技术、色谱图(色谱流出曲线)、基线、色谱峰、保留时间、保留体积、洗脱体积、相对保留值、分离度Rs、分离因素、分配色谱、薄层层析、离子交换色谱、分子筛凝胶色谱

知识点：

色谱法按分离机理可分为几种类型？纸层析是一种层析。

置换色谱要求样品组分及置换剂的吸附等温线应为Langmuir 型，而且置换剂相对于被分离的各组分应有最的吸附能力，其吸附等温线位于所有组分的吸附等温线的。

层析柱的理论塔板数越多，则溶质的分离度越。

层析操作必须具备相和相。

按照操作方式，洗脱方法有哪三种。

使用硅胶或氧化铝柱时，最常用的配对的展开剂是和。