第六章(1) 分子生物学改造

❖ 因此所产生的新链便具有已发生突变的碱基序列,将 其转入细胞后,经过不断复制,即可获得突变的DNA 分子,再经表达即可获得改造后蛋白质.
❖ 为了使目的基因的特定位点发生突变，所设计的寡 核苷酸引物的序列除了所需的突变碱基外，其余的 则与目的基因编码链的特定区段完全互补。
2.突变过程
1)合成含有目的 基因的正链DNA； 2)合成含有特殊 突变碱基的引物； 3）制备异源双链 DNA； 4）富集和转化双 链DNA分子； 5）筛选突变体并鉴定
❖ B Ile Cys Thr Thr Ala Thr Cys 1
❖ C Ile Ile Cys Thr Ala Cys Leu 1
❖ D Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys 2
❖ E Ile Cys Cys Thr Ala Cys Cys 2
❖ F Cys Cys Cys Thr Cys Cys Cys 3
❖ 将β-IFN分子中的游离Cys残基用Ser来取代，因为 Cys与Ser分子结构相似，前者有一个S原子，而后 者是一个O原子，减少了二聚体的形成，提高了活 性蛋白质的得率。
增加酶的活性
❖ 用定点突变技术不仅可以提高蛋白质的稳定 性，还可以提高酶的活性。要改变酶的活性， 需要一个详细描述了酶的活性位点的图谱。 有了这样的资料，研究者们即可推测酶与底 物的亲和程度，并利用定点突变技术对蛋白 质进行改造，提高酶的活性。
（二）Kunkel定点突变法
❖ 体外DNA合成往往是不完全的，所以部分合 成的DNA分子必须通过蔗糖密度梯度离心除 去,获得纯化的突变DNA。
❖ 理论上来说，DNA是半保留复制的，应用寡 核苷酸定点突变时，所形成的噬菌体中携带 突变基因的应为一半。但实际上，由于技术 上的原因通常只有1-5%的噬菌斑含有突变基 因的噬菌体。
❖ 当感染型单链M13噬菌体感染大肠杆菌后，在菌体内借助宿 主的酶系统先把ssDNA复制为双链（dsDNA），称为复制 型（replication form,RF）M13（RF- M13）。
❖ 广泛用于DNA序列分析和噬菌体表面展示系统（phage display)和单链核酸的制备。
1.基本原理
❖ 再使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段 作引物，启动M13单链DNA分子进行复制，随后这 段寡核苷酸引物便成为新合成的DNA子链的一个组 成部分。
天冬氨酸(Asp) + NH3
❖ 谷氨酰胺(Gln)
谷氨酸(Glu) + NH3
❖ 导致肽链折叠的局部的改变,可能影响其活性。
❖ 如酵母的丙糖磷酸异构酶是由两个相同的亚基组成的二聚体， 每个亚基都含有两个Asn残基，均位于两个亚基相互接触的 表面上，可能与该酶的热稳定性有关。
❖ 若将两个Asn全部换成Asp，则变体酶即使在常温下也不稳 定，而且酶活性也大为降低；
❖ 如枯草杆菌蛋白酶之所以易被氧化失活，是 由于催化部位的丝氨酸(Ser221)邻近的甲硫 氨酸(Met222)易被氧化成硫氢化物，若以其 他氨基酸取代Met222，则可提高酶的氧化稳 定性而又不影响其催化活性。这是结构分析 和定点突变改造蛋白质的成功范例。
❖ 枯草杆菌蛋白酶可作为洗涤剂的添加剂，但由于其 只能水解苯丙氨酸(Phe)羧基所形成的肽键，底物 作用范围过窄而限制了洗涤剂的高效性，若用带正 电荷的赖氨酸(Lys)取代位于活性中心166位的甘氨 酸(Gly)，所获得的突变酶不仅能水解苯丙氨酸(Phe) 羧基所形成的肽键，而且可以水解酸性氨基酸谷氨 酸(Glu)所形成的肽键，使其底物作用范围拓宽，因 而可能成为最高效的洗涤剂添加酶，这是定点突变 改变蛋白质生物学活性的成功例子。
③ 双链DNA导入正常的大肠杆菌 中，其尿嘧啶N-糖基化酶除去 DNA链上的尿嘧啶碱基。
④ 结果原来的M13模板链被降解， 只有突变链因不含U，被保留下 来。这种方法产生的M13噬菌体 中含有突变DNA的比例大大增 加。
（三） PCR定点突变
❖ Polymerase Chain Reaction （PCR）是一 种体外酶促合成特定DNA片断的技术，是根 据人类的需要对复杂生命过程的一种简单化 的模拟。PCR技术的原理是DNA半保留复制。 Kari.B.Mullis首创。
基因，即可表达出适合于商业用途的蛋白质。
❖ 在体外，通过碱基取代、插入或缺失的方法， 使基因DNA序列中的某个特定碱基发生改变， 从而改变蛋白质的结构，称为蛋白质工程。
❖ 通过蛋白质工程，人们可以随心所欲地改变 蛋白质的结构及其理化性质和生物学功能。 例如，我们可以利用蛋白质工程改变酶的Km、 Vmax，酶促反应的最适温度、最适pH值、 酶促反应的特异性以及酶蛋白的稳定性等。
先设置一个PCR反应产生一个含突变的 DNA片段，然后再以此DNA片段作为引物 与原模板退火进行PCR扩增得到含突变的完 整的基因。因为作为引物使用的DNA片段较 通常的引物要大许多甚至有上百碱基，所以 命名为大引物PCR法。
大引物PCR 定点突变技术路线
（圆点指突变位点）
3、环状突变 PCR 法
定义：以整个带有目的基因的质粒为模板，用突变剂 进行扩增，最后产生环状的带有目的突变的质粒。
方法： ①两个引物反向、紧邻但没有重叠区，扩增产物是平
末端的线性DNA，需用T4连接酶环化处理。 ②以Stratagene公司开发的定点突变试剂盒为代表，
两个引物也是反向的并且其5’端有l5个碱基以上的 重叠区，扩增产物为带黏性末端的线性DNA，可自 行环化。
❖ 例如：当人β-干扰素基因（β-IFN）在大肠杆菌中表 达时，尽管其表达量很高，但其比活性只及天然蛋 白质的10%。
❖ DNA序列分析显示， β-IFN所编码的蛋白质有三个 Cys残基，其中2个形成分子内二硫键，而另一个游 离的Cys可能涉及到β-IFN分子间二硫键的形成，导 致二聚体的产生，使单聚体含量减少，活性降底。
蛋白质分子的生物学改造
❖ 蛋白质在生命现象中具有重要作用，在医药、轻工 等行业也具有重要作用，如胰岛素、枯草杆菌蛋白 酶等；
❖ 天然生物材料中蛋白质含量较少； ❖ 基因克隆技术克隆基因，在宿主细胞中可表达特定
蛋白质（重组蛋白）； ❖ 多数天然蛋白质的理化特性不能适应于工业用途; ❖ 利用现代分子生物学技术，改变克隆基因中的特定
环状突变 PCR 法
环状突变 PCR 法
通过特殊氨基酸的改变提高蛋白的稳定性
例：葡萄糖异构酶（Glucose isomerase） 用双引物法对葡萄糖异构酶基因进行了体外定点 诱变，以Pro138替代Gly138，在酶比活相近的情况下， 突变型葡萄糖异构酶的热半衰期比野生型长一倍，最 适反应温度提高10~12C。
具体步骤：
① 将待突变的基因克隆入M13 DNA载体上，导入具有dUTP酶 （dut）和N-尿嘧啶脱糖苷酶 （ung）双缺陷的大肠杆菌 （dut-，ung-）菌株中。
② Dut缺陷导致细胞内dUTP水平 上升，并在DNA复制时，部分 取代dTTP进入DNA新生链中。 又由于ung缺陷使掺入DNA的 dUTP残基不能除去。由这种大 肠杆菌菌株产生的M13单链 DNA大约有1%的T被U所取代， 然后进行DNA定点突变。
通过改变活性中心附近的氨基酸提高酶的催化活性
应用举例：大肠杆菌碱性磷酸酶
Ser101
Asp101
Wild Type
D101S
E.coli Alkaline phosphatase: Mutation of D101S
二、编码基因随机突变和重组
易错PCR（Error prone PCR） DNA改组（DNA shuffling）
11
❖ 酶的稳定性以在100℃时半衰期或者失活率来表示。 半衰期越长酶越稳定
减少游离Cys残基的数目
❖ 在利用DNA重组技术表达外源基因时，常常 会遇到这种情况：外源蛋白的表达量很大， 但其生物活性却很低，即外源蛋白的比活性 很低。
❖ 利用蛋白质工程技术减少游离的半胱氨酸 （Cys）残基数目，以减少蛋白错误折叠的 可能性，从而可以提高蛋白质的生物活性。
三、定点突变原理
四、定点突变的常用方法
（一）M13DNA寡核苷酸突变
❖ 基因工程中,噬菌体是一种常用的基因载体,其中又以M13 和 λ为最常用。
❖ M13噬菌体是一种环形DNA，基因组大小为6.4kb，在颗粒 中包装的仅是正链的DNA，有时也称为感染型单链 DNA(single stranded DNA, ssDNA) 。
(%) 100 100
96 106
0 95 0
0
(℃) 41.9 41.9 46.7 48.3 52.9 57.6 58.9 65.9
❖ wtα：野生型T4溶菌酶；pwt:假野生型酶；A－F：六种设计的半胱氨酸 变体；Tm:熔点温度
将Asn和Gln转换成其他氨基酸
❖ 当蛋白质暴露于高温时:
❖ 天冬酰胺（Asn）
❖ 蛋白质工程的主要技术之一是定点突变技术.
一、定点突变
❖ 利用分子生物学技术，在体外通过碱基取代、插入 或缺失可以使基因DNA序列中任何一个特定的碱基 发生改变。这种体外特异性改变某个碱基的技术， 称谓定点突变（site directed mutagenesis）。
❖ 定点突变具有简单易行、重复性高等优点，现已发 展成为基因操作的一种技术。这种技术不仅适用于 基因结构与功能的研究，还可通过改变基因的密码 子来改造天然蛋白质。
PCR进行寡核苷酸 定点突变的示意图
1、重叠延伸PCR （OE-PCR）
首先设计两个PCR反应以产生两个含突 变位点的DNA片段，随后将上述两个 PCR产物混合，二者通过末端互补区结 合并在适宜的温度下互为引物延伸得到 完整的含突变的基因，对第一次PCR产 物进行纯化处理可显著提高突变效率
2、大引物PCR法（megaprimer PCR )
据分析，可能由于Pro138替代Gly138引入的一个 吡咯环刚好能够填充Gly138附近的空洞，使突变蛋白 的空间结构更具刚性，从而提高了酶的热稳定性。