细胞信号通路检测
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化学显色法：
常用酶标系统HRP的显色底物为TMB和DAB
酶标系统AP的显色底物为BCIP和NBT
特点：方便、便宜； 具有一定毒性、灵敏度较低、反应速度慢； 检测后的膜不可重新剥离检测。
28
WESTERN BLOT
Step1 蛋白样品制备 Step2 蛋白定量 Step3 SDS-PAGE Step4 转膜 Step5 封闭 Step6 免疫反应 Step7 显色或发光
湿转系统
转移操作
白色夹板（正极） 垫片
膜 滤纸 +阳极 -阴极 多孔垫片 滤纸
300mA 1h
2层滤纸
凝胶
膜（左上角标记）
凝胶（Marker靠左）
2层滤纸
垫片 黑色夹板（负极）
22
56mA /膜 1h
步骤五、封 闭
去除非特异结合位点： Blocking Buffer ：3%BSA
5% Milk
A
B
︱ ︱ ︱ –CH2–CH–CH2–CH–CH2– CH–CH2–CH– CH– O O ︱ ∥ ∥ CONH CH2=CH–C–NH–CH2–NH–C–CH=CH2 ︱ CH2 (神经毒性) ︱ CONH CONH2 CONH2 ︱ ︱ ︱ 9
CH2=CH–C–NH2
O ∥
APS, TEMED
• 回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。
• 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温 孵育1-2小时或4℃过夜。 • 回收二抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。 • 最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。
步骤ຫໍສະໝຸດ Baidu、检测方法
二抗与底物反应显色
化学发光法：
常用HRP酶标系统的显色底物为ECL鲁米诺（Luminol） 特点：无毒害、灵敏度高、速度快；特异性好、节省抗体、线性宽； 可重新剥离检测。
CONH2
CONH2
CONH
制胶
不连续系统
浓缩胶
5% pH6.8
分离胶
12%
pH8.8
特点： pH不连续 凝胶不连续 缓冲液成分不连续
10
蛋白质在进入分离胶以前，先
被浓缩成一条细线，使每个蛋 白的起跑线相同，提高解析度。
制胶
• 12%分离胶(15ml) 双蒸水 30% Arc/Bis 分离胶缓冲液 (pH8.8) 10% SDS 10%APS TEMED 灌胶，待凝，约1小时
• • •
步骤二、SDS-PAGE电泳
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。 SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质 电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大 小。
PAGE：聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰 胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker)
4.8ml 6ml 4ml 150ul 75ul 8ul
灌制分离胶
隔绝空气
ddH2O 0.1%SDS:<8% 异丁醇：>8%
• 4%浓缩胶（7.5ml） 双蒸水 30% Arc/Bis 分离胶缓冲液 (pH6.8) 10% SDS 10%AP TEMED 灌胶，插梳子，待凝，约0.5小时
4.55ml 1ml 1.9ml 75ul 75ul 7.5ul
WESTERN BLOT定义
Western Blot又称免疫印迹，是指将蛋白样品转移到固相 相应的抗体来检测目的蛋白的一种方法。 载体上，而后利用
Western Blot 应用： 研究检测样品中特异性蛋白质的存在 细胞中特异蛋白质的半定量分析 蛋白质分子的相互作用研究
3
WESTERN BLOT实验流程
注意：抗体的稀释倍数是由底物和待检测蛋白质的丰度决定的， 为了获得最佳实验结果，强烈推荐进行预实验，以确定具体的实验参
数.
25
二抗的选择：
根据一抗物种：
抗兔 抗大鼠 抗人 抗山羊 抗鸡 抗豚鼠 抗马
抗小鼠
根据标记物：
标记物 HRP、AP、Biotin、荧光标记、无标记
一抗、二抗孵育
• 把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以 0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室 温孵育1-2小时或4℃过夜。
灌制积层胶
插入梳子
SDS-PAGE 电泳
上样前煮沸样品
上样量：30-100 μg
蛋白Marker
16
• 准备样本 加2×Loading Buffer,混匀，煮沸3～5分 钟， 10000g离心10分钟 取上清适量上样 • 电泳：5mA/胶 大约需时2小时
蛋白样品的变性
• SDS-PAGE上样缓冲液：
SDS-PAGE凝胶成分
• • •
•
•
SDS-PAGE：SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 丙烯酰胺 (A)：形成聚合物链 N,N’-亚甲双丙烯酰胺 (B) ：形成纵向架桥（cross-linkage） 过硫酸铵(APS) ：助凝剂 TEMED：催化剂 ︱
Step1 蛋白提取 Step2 蛋白定量 Step3 SDS-PAGE 转膜 封
Step4 Step5
闭
Step6 应 Step7 免疫反 显色或发 光
4
步骤一、蛋白样品的提取
• 总蛋白抽提程序： • PBS冲洗细胞(我们采用的细胞是E0771)3次（此步骤我
• 们省略） 加入裂解缓冲液（RIPA其中我们已加入PMSF）80ul （1.5*106个细胞大约加入100ul裂解液，或100ml培养皿 中加入100ul裂解液），冰上放置20-30min 收集裂解液到EP管中 4度离心，12000转/分，2-10min 吸取上清，蛋白定量（实验条件所限我们不做），分装 （也不做，直接用总体积上清即80ul与5X上样缓冲液20ul 混合），加入5X上样缓冲液20ul，煮沸5-10min，保存在80度备用。
Room Temperature 1 h
23
封闭
为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发 生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对 膜上的潜在结合位点进行封闭处理。
5%脱脂奶粉或BSA（室温孵育1h）
Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司） Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影响 抗体与抗原的结合。
细胞信号通路检测（二）
Western Blot
病理生理学教研室
1
定义：
• 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测
反应来检测样品的一种方法。
• 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利 用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 • 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹 分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为 Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法
• 按1:1比例与蛋白质样品混合，95～100℃加热5～15min， 冰上冷却后再上样，上样量一般为20-25μl，总蛋白量 20～50μg。
步骤四、转膜
•
膜的选择： NC、PVDF、尼龙膜 转膜方法： 半干转、湿转 转膜确认： 立春红染色、蛋白预染Marker
19
•
3
•
取出一块胶做考马斯亮兰染色 另一块胶转膜 转膜：负极到正极，依次放海绵，滤纸，凝 胶，硝酸纤维膜， 滤纸，海绵 380mA 30分钟
① 100mM Tris-HCl(pH6.8) ② 200mM ③ 4%SDS ④ 0.2%溴酚兰 ⑤ 20%甘油 ⑥ ddH2O
SDS 甘油 溴酚蓝 4g 20 ml 0.2 g 1M Tris-HCl(pH6.8) 1M DTT 10 ml 20 ml
DTT
总体积
100ml
• DTT可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，-20℃冻存。
N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide，
简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网
状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明
度。是良好的电泳介质。
SDS
• SDS与蛋白结合后，还可引起构象改变，复合物呈长椭 圆棒，SDS-PAGE只取决于蛋白分子量大小。
29
Perfect Data
讨论
根据实验结果判断相关信号通路活化情况，并 作出讨论
步骤六、抗体孵育
一抗的选择 ：
确定所研究的目的蛋白，根据目的蛋白名称查询相关抗体。
抗体选择：
单克隆抗体 或者 多克隆抗体 直接标记的抗体 或者 未标记的抗体 抗体的实验目的：对不同实验选用不同抗体 WB（免疫印迹）、IHC（免疫组化）、ELISA（酶联免疫反应）、FC（流式细胞 检测）、 IP（免疫沉淀） 抗体所检测的种属：人、小鼠、大鼠等
常用酶标系统HRP的显色底物为TMB和DAB
酶标系统AP的显色底物为BCIP和NBT
特点：方便、便宜； 具有一定毒性、灵敏度较低、反应速度慢； 检测后的膜不可重新剥离检测。
28
WESTERN BLOT
Step1 蛋白样品制备 Step2 蛋白定量 Step3 SDS-PAGE Step4 转膜 Step5 封闭 Step6 免疫反应 Step7 显色或发光
湿转系统
转移操作
白色夹板（正极） 垫片
膜 滤纸 +阳极 -阴极 多孔垫片 滤纸
300mA 1h
2层滤纸
凝胶
膜（左上角标记）
凝胶（Marker靠左）
2层滤纸
垫片 黑色夹板（负极）
22
56mA /膜 1h
步骤五、封 闭
去除非特异结合位点： Blocking Buffer ：3%BSA
5% Milk
A
B
︱ ︱ ︱ –CH2–CH–CH2–CH–CH2– CH–CH2–CH– CH– O O ︱ ∥ ∥ CONH CH2=CH–C–NH–CH2–NH–C–CH=CH2 ︱ CH2 (神经毒性) ︱ CONH CONH2 CONH2 ︱ ︱ ︱ 9
CH2=CH–C–NH2
O ∥
APS, TEMED
• 回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。
• 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温 孵育1-2小时或4℃过夜。 • 回收二抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。 • 最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。
步骤ຫໍສະໝຸດ Baidu、检测方法
二抗与底物反应显色
化学发光法：
常用HRP酶标系统的显色底物为ECL鲁米诺（Luminol） 特点：无毒害、灵敏度高、速度快；特异性好、节省抗体、线性宽； 可重新剥离检测。
CONH2
CONH2
CONH
制胶
不连续系统
浓缩胶
5% pH6.8
分离胶
12%
pH8.8
特点： pH不连续 凝胶不连续 缓冲液成分不连续
10
蛋白质在进入分离胶以前，先
被浓缩成一条细线，使每个蛋 白的起跑线相同，提高解析度。
制胶
• 12%分离胶(15ml) 双蒸水 30% Arc/Bis 分离胶缓冲液 (pH8.8) 10% SDS 10%APS TEMED 灌胶，待凝，约1小时
• • •
步骤二、SDS-PAGE电泳
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。 SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质 电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大 小。
PAGE：聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰 胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker)
4.8ml 6ml 4ml 150ul 75ul 8ul
灌制分离胶
隔绝空气
ddH2O 0.1%SDS:<8% 异丁醇：>8%
• 4%浓缩胶（7.5ml） 双蒸水 30% Arc/Bis 分离胶缓冲液 (pH6.8) 10% SDS 10%AP TEMED 灌胶，插梳子，待凝，约0.5小时
4.55ml 1ml 1.9ml 75ul 75ul 7.5ul
WESTERN BLOT定义
Western Blot又称免疫印迹，是指将蛋白样品转移到固相 相应的抗体来检测目的蛋白的一种方法。 载体上，而后利用
Western Blot 应用： 研究检测样品中特异性蛋白质的存在 细胞中特异蛋白质的半定量分析 蛋白质分子的相互作用研究
3
WESTERN BLOT实验流程
注意：抗体的稀释倍数是由底物和待检测蛋白质的丰度决定的， 为了获得最佳实验结果，强烈推荐进行预实验，以确定具体的实验参
数.
25
二抗的选择：
根据一抗物种：
抗兔 抗大鼠 抗人 抗山羊 抗鸡 抗豚鼠 抗马
抗小鼠
根据标记物：
标记物 HRP、AP、Biotin、荧光标记、无标记
一抗、二抗孵育
• 把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以 0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室 温孵育1-2小时或4℃过夜。
灌制积层胶
插入梳子
SDS-PAGE 电泳
上样前煮沸样品
上样量：30-100 μg
蛋白Marker
16
• 准备样本 加2×Loading Buffer,混匀，煮沸3～5分 钟， 10000g离心10分钟 取上清适量上样 • 电泳：5mA/胶 大约需时2小时
蛋白样品的变性
• SDS-PAGE上样缓冲液：
SDS-PAGE凝胶成分
• • •
•
•
SDS-PAGE：SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 丙烯酰胺 (A)：形成聚合物链 N,N’-亚甲双丙烯酰胺 (B) ：形成纵向架桥（cross-linkage） 过硫酸铵(APS) ：助凝剂 TEMED：催化剂 ︱
Step1 蛋白提取 Step2 蛋白定量 Step3 SDS-PAGE 转膜 封
Step4 Step5
闭
Step6 应 Step7 免疫反 显色或发 光
4
步骤一、蛋白样品的提取
• 总蛋白抽提程序： • PBS冲洗细胞(我们采用的细胞是E0771)3次（此步骤我
• 们省略） 加入裂解缓冲液（RIPA其中我们已加入PMSF）80ul （1.5*106个细胞大约加入100ul裂解液，或100ml培养皿 中加入100ul裂解液），冰上放置20-30min 收集裂解液到EP管中 4度离心，12000转/分，2-10min 吸取上清，蛋白定量（实验条件所限我们不做），分装 （也不做，直接用总体积上清即80ul与5X上样缓冲液20ul 混合），加入5X上样缓冲液20ul，煮沸5-10min，保存在80度备用。
Room Temperature 1 h
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封闭
为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发 生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对 膜上的潜在结合位点进行封闭处理。
5%脱脂奶粉或BSA（室温孵育1h）
Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司） Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影响 抗体与抗原的结合。
细胞信号通路检测（二）
Western Blot
病理生理学教研室
1
定义：
• 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测
反应来检测样品的一种方法。
• 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利 用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 • 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹 分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为 Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法
• 按1:1比例与蛋白质样品混合，95～100℃加热5～15min， 冰上冷却后再上样，上样量一般为20-25μl，总蛋白量 20～50μg。
步骤四、转膜
•
膜的选择： NC、PVDF、尼龙膜 转膜方法： 半干转、湿转 转膜确认： 立春红染色、蛋白预染Marker
19
•
3
•
取出一块胶做考马斯亮兰染色 另一块胶转膜 转膜：负极到正极，依次放海绵，滤纸，凝 胶，硝酸纤维膜， 滤纸，海绵 380mA 30分钟
① 100mM Tris-HCl(pH6.8) ② 200mM ③ 4%SDS ④ 0.2%溴酚兰 ⑤ 20%甘油 ⑥ ddH2O
SDS 甘油 溴酚蓝 4g 20 ml 0.2 g 1M Tris-HCl(pH6.8) 1M DTT 10 ml 20 ml
DTT
总体积
100ml
• DTT可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，-20℃冻存。
N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide，
简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网
状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明
度。是良好的电泳介质。
SDS
• SDS与蛋白结合后，还可引起构象改变，复合物呈长椭 圆棒，SDS-PAGE只取决于蛋白分子量大小。
29
Perfect Data
讨论
根据实验结果判断相关信号通路活化情况，并 作出讨论
步骤六、抗体孵育
一抗的选择 ：
确定所研究的目的蛋白，根据目的蛋白名称查询相关抗体。
抗体选择：
单克隆抗体 或者 多克隆抗体 直接标记的抗体 或者 未标记的抗体 抗体的实验目的：对不同实验选用不同抗体 WB（免疫印迹）、IHC（免疫组化）、ELISA（酶联免疫反应）、FC（流式细胞 检测）、 IP（免疫沉淀） 抗体所检测的种属：人、小鼠、大鼠等