分子诊断技术临床应用

二、基于测序技术为基础的分子诊断技术 DNA的序列分析是分子诊断学的金标准，
各种遗传疾病，病毒或细菌的感染与变异，在 基因表达水平上的个性化用药，多基因疾病的 诊断与预测，最终都可以借助基因测序平台的 应用。
三、基于扩增技术为基础的分子诊断技术 1983年Mullis发明了聚合酶链反应
（Polymerase chain reaction，PCR），使 体外扩增DNA成为可能，开启了体外扩增和操 作DNA或RNA技术的发展。到现在，扩增DNA的 技术已经成为分子诊断应用最广的技术之一， 并发展变化了数十种核酸扩增检测技术。
二、PCR概述
（一）PCR概念
PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚 合酶链反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链 DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、 退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA 互补的子链DNA的过程。是一项体外核酸扩增技 术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。
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二、PCR概述
（二）原理
双链DNA 变性
退火
（膜板） （双链分成单链） （膜板与引物杂交）
延伸
（DNA合成）
不断重复
PCR循环次数与DNA产量关系
PCR反应的特点
• 高灵敏度 • 高特异性 • 简便快捷
• 高效扩增、忠实复制！
三、荧光定量PCR技术的临床应用
一 病原体检测
病毒性肝炎（HBV、HBV-YMDD、HCV）的基因检测 性病相关病原体（CT、NG、UU、HPV、HIV）的基因检
血清阳转后的方法
RNA+ Ab-
反
应
P24+ Ab -
指
标
RNA
Ab
感染
p24
时间
抗体检测临界值 特异性抗体比例
婴幼儿感染HIV诊断：12月内核酸检测，13-17月先抗体， 阳性者检测核酸，18个月以上抗体检测
四、PCR检测的标本采集要求
五、NAT（核酸检测）技术类型：
荧光定量PCR检测TB-DNA的意义
3. 荧光定量PCR检出结核杆菌阳性率显著高于痰涂片 抗酸染色和改良罗氏培养法。
4. TB-DNA浓度可用于判断疗效： 痰标本中结核杆菌的数量呈逐渐下降趋势 ，
TB-DNA拷贝数下降。根据病原体DNA浓度，对 药物治疗及疗效观察提供参考依据
三、荧光定量PCR技术的临床应用
a. 接种BCG可出现阳性 b. 不能区分活动性结核病和治愈后留下 损伤灶的病人 c. 交叉反应，假阳性 不能早期诊断！容易漏诊、误诊！
荧光定量PCR检测TB-DNA的意义
1. 能稳定检测10copy的TB-DNA ，灵敏度高 ，特异性强
2. 早期、快速、准确地诊断结核病。 痰液、肺及支气管灌洗液——肺结核 血液——播散性结核和各脏器的结核病 脑脊液——中枢神经系统结核病 宫颈拭子、尿道拭子——泌尿生殖道结核病
PCR技术
PCR核心技术是从水栖高温菌中
分离到能耐高温的Taq酶，使扩增反
应不需要每一个循环加一次DNA聚合
酶，从而实现了自动化，使应用领
域迅速扩大，PCR技术成为了分子生
物学中的一项突破性技术。
PCR概述——2000至2013年发表论文篇
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PCR＋遗传分析
PCR＋临床诊断
PCR＋肿瘤研究
根据分子诊断技术特征划分为三类：
一、基于分子杂交为基础的分子诊断技术 两条同源核酸分子（DNA或RNA）可以在
碱基互补的原则下形成异质双链是遗传物质 最重要的化学特征，这一过程亦被称为分子 杂交。分子杂交是所有分子生物学技术的基 础，从最初的印迹杂交到聚合酶链反应 （PCR），从基因芯片再到高通量的DNA测序 技术，都离不开碱基互补的分子杂交反应。
测 优生优育项目诊断：人巨细胞病毒（HCMV）、单纯疱
疹病毒（HSV）、弓形虫（TOX）、风疹病毒（RUB） 其它病原体检测：结核杆菌、肺炎支原体、EB病毒、
伤寒杆菌、幽门螺旋杆菌等
常规结核病实验室诊断方法及不足
1. 痰涂片作抗酸染色：阳性率低 、费时 2. 细胞培养“金标准”：周期太长(4-8W) 3. 血清学诊断：
二、PCR概述
PCR技术能在一个试管内将所要研究的 目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至 十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判 断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细 胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴 定。
PCR 发展简史
1983 Mullis于12月16日成功发明了PCR 1985 关于PCR 的文章首次由 Mullis及其同事等人 在
分子诊断技术的临床应用
一、分子诊断的概念
狭义的分子诊断是基于核酸的诊断技术， 是通过对DNA或RNA的检测来实现对疾病的检测 和诊断。但是，随着第一张人类基因组测序图 的完成，以及由此而带来的基因组学、蛋白组 学、代谢物组学等新兴学科的发展，分子诊断 的内涵已经从单纯的DNA/RNA拷贝、突变等变化 的检测，拓展到核酸与DNA片段、蛋白与多肽、 抗原与抗体、受体与配体等生物大分子的检测， 并广泛应用于疾病的筛查、诊断、治疗监测、 预后与预防等生命科学的各个领域。
窗口期：
所谓“窗口期”,是指从感染病原体开始 ,直至用某种检测方法能够检测到该病原 体存在为止的这一段时间。
美国90％以上输血传播HIV和HBV以及75 ％以上输血HCV的危险性均来自“窗口期 ”感染献血。
PCR检测的临床意义
提供直接证据缩短“窗口期”
怎样检测HIV早期感染?
血清阳转
血清阳转前的方法
《Science》杂志上发表 1989 12月《Science》杂志将PCR和它所使用的Taq
DNA聚合酶命名为第一个“年度分子”。 1993 10月13日 Mullis获诺贝尔化学奖 1995 荧光定量PCR技术出现
九十年代中期PCR临床应用在国内全面展开 1998年 荧光定量PCR技术开始在中国应用 于临床检测
二 肿瘤相关基因表达的检测： 1、包括癌基因、抗癌基因 2、肿瘤转移基因 3、转移抑制基因
三、荧光定量PCR技术的临床应用
三 遗传病 1、等位基因检测 2、多基因遗传病的突变检测 3、基因表达异常所致遗传病检测
三、荧光定量PCR技术的临床应用
四 其它应用 1. 法医学鉴定 2. 抗病毒药物疗效的观察、指导 3. 缩短诊断的窗口期