PCR常见问题分析及对策复习过程
PCR常见问题、原因分析及其对策
镁离子浓度不当
总结词
镁离子是PCR反应的重要成分，对PCR的效率和产物质量有 重要影响。
详细描述
镁离子浓度过高可能导致非特异性扩增和产物稳定性下降； 镁离子浓度过低则可能影响DNA聚合酶的活性，导致PCR失 败或扩增效率低下。因此，需要根据实验条件和试剂盒推荐 ，选择合适的镁离子浓度。
03
pcr问题对策
详细描述
模板质量的好坏直接影响到pcr的扩增 效果，因此需要确保模板的纯度和浓 度，避免使用降解严重的模板，以提 高pcr的产量和特异性。
优化pcr循环参数
总结词
pcr循环参数的优化可以显著提高pcr的效率和特异性。
详细描述
通过调整变性、退火、延伸等温度和时间，可以优化pcr循环参数，提高pcr的效率和特异性。同时， 合理设置预变性时间和循环数，可以有效避免非特异性扩增和产物积累。
优化引物设计
总结词
引物设计是pcr反应的关键，优化引物设计可以显著提高pcr的特异性和效率。
详细描述
引物设计时需考虑特异性、长度、GC含量、引物二聚体和发夹结构等因素，通过合理设计引物，可以避免非特 异性扩增和引物二聚体形成，提高pcr的特异性。
提高模板质量
总结词
模板质量对pcr结果的影响不容忽视， 提高模板质量可以提高pcr的产量和特 异性。
模板质量差
总结词
模板质量的好坏直接影响到PCR的效率和产物质量。
详细描述
模板中可能含有抑制剂、DNA聚合酶抑制剂或DNA聚合酶竞争性抑制剂等物质， 这些物质会影响DNA聚合酶的活性，导致PCR失败或扩增效率低下。此外，模 板的浓度过低或过高也可能影响PCR结果。
pcr循环参数不当
总结词
PCR循环参数包括变性、退火、延伸等步骤，这些步骤 的温度和时间设置对PCR结果有重要影响。
PCR常见问题、原因分析及其对策
特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的 PCR 对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方
法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等。
策略之三
•天为时代：Long Taq
保真度低于Pfu聚合酶 但扩增效率较高 特别适用于保真度较 高的 超长片段扩增
长片段扩增
TaKaRa：LA Taq • Invitrogen：Elongase Amplificaiton System
•
PCR MasterMix
原 理
预配好的PCR反应液
DNA聚合酶
反应缓冲液
PCR技术简介
PCR常见问题、原因分析及其解决方案
提高PCR反应特异性的策略
四种策略
• 巢式PCR（Nest-PCR）
• 递减PCR（TouchDown PCR） • 热启动PCR（HotStart PCR）
• 使用PCR增强剂
策略之一
• 巢式PCR（Nest-PCR）
P1 P3 P4 P2
巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多 套引物都互补的靶序列很少。
巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，
并且提高了困难PCR（如5' RACE）的特异性。
策略之二
• 递减PCR（TouchDown PCR）
递减 PCR通过在 PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高
化学修饰
•
•
Roche : FastStart Taq Abgene: Thermo-start® DNA Polymerase Stratagene: SureStart™ Taq
pcr2
PCR常见问题PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性)问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR引物设计的黄金法则（转自tiangen）1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。
在NCBI上搜索不同物种的基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列该基因的保守区2.引物长度一般在15~30碱基之间。
PCR常见问题分析及对策
PCR反应常见问题汇总（转自tiangen）----PCR常见问题分析及对策1.PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
2.假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR 循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
⑤模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD 值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。
PCR扩增过程中常见的问题及解决方法
PCR技术具有高度的特异性、选择性、灵敏性，而且快速、简便、易于自动化，因此在临床医学工作中受到广泛的重视及合理的应用。
目前在我国许多基层医疗单位均已相继开展P CR研究用应用工作。
PCR技术很简单，原理也很清楚，因此有条件的单位都能较顺利地上马，但毕竟PCR技术是一种新生事物，受到许多条件因素的影响，所以要做得好也不容易。
在PCR技术应用过程中会遇到这样或那样的问题，更甚至会得到与事实完成相反的结果。
为了使我们能够顺利地开展PCR工作，更好地发挥PCR技术的工具作用，我们根据多年来PCR工作总结的经验，对PCR扩增过程中经常出现的一些问题进行简要的总结，提供给广大科研工作者作为参考，抛砖引玉，不足之处欢迎指正。
一、假阳性扩增在实验过程中有时会碰到所检验的样本全部阳性，而且扩增产物电泳条带亮度均一，这是扩增系统受到污染时最典型的一种表现，需仔细检查，排除污染源，一般应从以下步骤着手：⒈试剂污染：厂方提供的试剂或其中的某种组分在出厂或运输、贮存过程中受到污染。
检测方法，可按试剂盒说明书将试剂分装好，直接置于PCR仪中扩增（不加阴性对照，可加适量蒸馏水），便可简单而有效地判断试剂是否已受到污染。
⒉实验室污染：这是最常见的污染源，由于PCR技术可以在几个小时内将模板中某些特异性序列扩增到数百万倍以上，扩弗产物可能在电泳等过程中污染移液器、操作台或随着蒸发所形成气溶胶而污染整个实验室。
扩增产物又是最有效的模板，一旦出现产物污染其污染程度都较严重。
判断方法：可以将实验中最关键步骤如试剂分装、样品处理等转移到一个新的环境中或转移到超净工作台中完成。
当然，所用的移液器、吸咀管（离心管）都应彻底更换。
解决方法：实验室污染是PCR扩增过程中最易出现的现象，而且一旦出现污染，消除污染源又极其困难，往往需对整个实验室及实验器材彻底清洗处理，所以应该以预防为主，实验过程中严格遵守实验基本要求，样品处理与扩增产物及电泳应尽量分开，最好能在两个房间进行。
PCR技术之——常见问题解析及处理方法
PCR技术之——常见问题解析及处理方法我们进行核酸扩增时，往往会不定的出现一些异常问题，本期我给大家搜集了一些平时经常性遇到的一些问题，希望对大家有所帮助。
（一）相对特异性 PCR产物的特异性主要取决于引物链的特异性。
由于存在同源序列，随意设计的引物链，其PCR产物在电泳分析时可能出现多条链，因此在设计引物链时应考虑其绝对特异性和相对特异性。
前者指两条引物链的核苷酸序列只与靶DNA片段互补，后者是指两条引物链的核苷酸序列及两者之间的DNA长度对靶DNA片段是特异的，但亦可与其他区域的DNA片段互补，而其PCR产物的长度与靶DNA片段的扩增产物的长度明显不同，应根据两引物问的DNA片段长度，预计PCR产物的大小，并与电泳分析的DNA片段大小比较．或用寡聚核苷酸限制性内切酶片段分析，或用分子杂交、核苷酸序列分析来测定。
（二）标本中存在的有形成分对反应的抑制这一点主要是针对来自临床标本中的杂质加细菌蛋白质和Taq DNA聚合酶抑制因子，须注意避免污染和去除标本中的杂质；将标本加热煮沸使抑制因子与DNA分离。
对于来自标本中的细胞和细胞器的崩解、核酸酶的激活均可使待检的DNA降解，降解的DNA是Taq DNA聚合酶作用良好底物，能与靶DNA竞争，从而扩增大量的非特异性DNA，这种非特异性DNA会使背景干扰超过了前景信号影响PCR循环扩增效率，减少特异性DNA扩增产量。
（三）Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶扩增的特异性受PCR循环次数及延伸时间与温度的影响循环次数太多使延伸时间延长和Taq DNA聚合酶单位用量增长可能导致非特异性扩增；循环次数太少，则不能得到充足的扩增产物，温度不适宜会影响扩增产物数量，延伸温度一般高于复性温度。
（四）复性温度与时间引物与变性DNA的复性温度对PCR 的特异性有影响，复性温度由引物的碱基成分决定。
在低温度（37℃）下复性可出现比扩增DNA长的非特异性扩增带；而在55～60℃复性的扩增带一般是特异的，复性时间过长或过短都会增加非特异性扩增。
PCR常见问题分析及对策
PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性)问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR引物设计的黄金法则（转自tiangen）1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。
在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区2.引物长度一般在15~30碱基之间。
PCR技术常见疑难问题3则
在细胞中只有RNA聚合酶可以从头合成RNA，合 成 的 RNA 与 模 板 链 结 合 ， 从 而 引 导 DNA 分 子 子 链的延伸。而DNA聚合酶由于它的保真系统决定 它 不 能 从 头 合 成 DNA 单 链 ， 所 以 DNA 复 制 时 先 由 RNA 聚 合 酶 合 成 一 段 RNA 链 ， 再 由 DNA 聚 合 酶起到DNA分子复制时的延伸功能，形成互补的 子链。
问题2 PCR技术中加入的“引物”是什么？有什么 作用？引物会在PCR仪中复制吗？
引 物 是 在 DNA 分 子 复 制 时 起 引 导 作 用 一 段 短 RNA 或 单 链 DNA 片 段 ， 可 结 合 在 脱 氧 核 苷 酸 链 上与之互补配对的区域，其功能是作为核苷酸聚 合作用的起始点，DNA聚合酶可由其3’端开始合 成新的核酸链。细胞内的引物是RNA链，由RNA 酶根据DNA链碱基序列自动合成。
问题3 为什么细胞内DNA复制的引物是RNA？ PCR的引物是DNA？
细胞内DNA分子复制过程可概括为：（1）双链 的解开；（2）RNA引物的合成；（3）DNA链 的延伸；（4）切除RNA引物，填补缺口并连接 相邻的DNA片段。
迄今为止，无论在原核生物还是在真核生物中所 发现的DNA聚合酶，都必合 成 新 的 DNA 链 （ 由 5’→3’方向延伸）。
在PCR仪中用的是DNA引物，是人工设计合成， 一般不用RNA作为引物，因为RNA引物需要被切 除，而PCR仪中没有这种酶，再说，若用的RNA 引物被切除后将使这个新合成的DNA的两端都出 现了一段单链而不稳定。
PCR常见问题、原因分析及其对策汇总
提高PCR反应特异性的策略
策略之二：递减PCR（TouchDown PCR）
递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火 条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5℃ 的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2℃,直到 退火温度低于Tm 5℃。 特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在 随后的循环中继续扩增占据优势。 递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程 度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析。
PCR技术的简介
PCR技术的发展历史
1985 关于PCR 的文章首次由美国科学Kary Mullis等 人在 《Science》杂志上发表 1989 《Science》杂志报道了耐热性DNA多聚酶 Taq酶 （生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到的一种耐 热的DNA聚合酶 ）的发现,预示着分子时代的到 来。12月《Science》杂志将PCR和它所使用的聚 合酶命名为第一个“年度分子”。 1993 Kary Mullis 因PCR的发明获得诺贝尔化学奖。
1. 现象：空白对照出现目的扩增产物 原因：靶序列或扩增产物的交叉污染 对策： 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪 内或溅出离心管外； 2. 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材 均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应 一次性使用。 3. 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。
原 因
1.
2. 3. 4. 5. 6.
模板不纯 Buffer不合适 退火温度偏低 酶量过多 dNTP、Mg2+浓度偏高 循环次数过多
1.
2.
对 策
3. 4. 5.
6.
纯化模板 更换Buffer 适当提高退火温度 适量用酶 适当降低dNTP和镁离子的 浓度 减少循环次数
PCR检测常见问题与解决途径
PCR检测常见问题与解决途径PCR 检测常见问题与解决途径利用 PCR 方法检测转基因成分时，经常出现假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带。
尤其是假阳性和假阴性可使检测结果得出错误结论，有时可造成严重后果。
为了提高转基因检测的准确性和可靠性，PCR 检测应尽量减少假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带现象的发生。
一个好的PCR 方法不但要求特异性好、灵敏度高、还要求具有高的可重复性、重现性、鲁棒性，尽量减少假阳性、假阴性和非特异性扩增。
本文对 PCR 检测中出现的假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带的原因及其解决方法予以综述。
一、假阳性：（一）假阳性现象假阳性是指检测阴性材料得到阳性结果。
如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。
实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。
（二）造成假阳性的原因1.样品间交叉污染：样本污染主要有收集样本的容器被污染，或样本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有样本而造成相互间交叉污染；样本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；2.PCR 试剂的污染：主要是由于在 PCR 试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被 PCR 核酸模板污染。
3. PCR 扩增产物污染：这是 PCR 贝量大 (一般为 1013 拷贝 /ml)，远远高于物污染，就可形成假阳性。
反应中最主要最常见的污染问题。
因为PCRPCR 检测数个拷贝的极限，所以极微量的产物拷PCR 产4. 气溶胶污染：在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。
据计算一个气溶胶颗粒可含 48000 拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。
5.实验室中克隆质粒的污染：由于克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。
PCR常见问题分析及对策
PCR常见问题分析及对策PCR常见问题分析及对策(⽆扩增产物、⾮特异性扩增、拖尾、假阳性)问题1：⽆扩增产物现象：正对照有条带，⽽样品则⽆原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发⽣降解4.反应条件：退⽕温度太⾼，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使⽤试剂盒提取模板DNA或加⼤模板的⽤量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间⼆聚体和链内⼆级结构）或者换⼀管新引物4.降低退⽕温度、延长延伸时间问题2：⾮特异性扩增现象：条带与预计的⼤⼩不⼀致或者⾮特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过⾼3.酶量过多4.Mg2+浓度偏⾼5.退⽕温度偏低6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使⽤巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离⼦浓度5.适当提⾼退⽕温度或使⽤⼆阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退⽕温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏⾼6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提⾼退⽕温度4.适量⽤酶5.适当降低dNTP和镁离⼦的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空⽩对照出现⽬的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应⼩⼼轻柔，防⽌将靶序列吸⼊加样枪内或溅出离⼼管外；2.除酶及不能耐⾼温的物质外，所有试剂或器材均应⾼压消毒。
所⽤离⼼管及加样枪头等均应⼀次性使⽤。
3.各种试剂最好先进⾏分装，然后低温贮存琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物⼀．原理DNA⽚断的分离与回收是基因⼯程操作中的⼀项重要技术，例如可收集特定酶切⽚断⽤于克隆或制备探针，回收PCR产物⽤于再次鉴定等。
回收实验中两个最重要的技术指标是纯度和回收率：前者未达标时会严重影响以后的酶切、连接、标记等酶参与的反应；后者不理想时往往会⼤⼤增加前期的⼯作量。
PCR实验中常见问题解决方法
QuikStrip 已变干。
加入 40 μL 水，在装载前轻轻上下移液以混合均匀。
3.电泳凝胶上看不到条带、对照 DNA 和PCR 产物
凝胶未正确制备。
确保正确稀释电泳缓冲液。
融化琼脂糖时需要特别注意较高浓度 (>0.8%) 的凝胶。在倒入凝胶之前，确保溶液 没有“团块 ”和玻璃状颗粒，也可以直接使用配置好的预制胶。省时省力。
凝胶未正确染色。
染色时注意浓度，实在不行就重新染色。
电泳装置或电源出现故障。
请联系电泳仪或电泳设备供应商，帮忙排除故障
4.凝胶染色后，DNA 条带模糊。
凝胶没有染色足够长的时间。
严格按照染色流程说明进行实验操作。
5.染色后，条带可见，但不存在 PCR 产物。
PCR扩增不成功。
注意引物设计是否合理，DNA聚合酶的加入量是否适宜。
PCR实验中常见问题解决方法
PCR实验中常见问题及解决方案
PCR实验中常见问题汇总
问题，管中的液体较少。
样品挥发，损失
确保加热的盖子达到适当的温度。
吸取样本后，尽快盖上PCR 管的盖子。防止挥发。
移液不准确
确保吸取 20 µL 引物混合物和 5 µl Lambda DNA 模板到 PCR 管中。样本量少时需要采用高精度移液器。
确保PCR的正确操作，温度设计是否合理。
6.染色后，凝胶上可见条带和对照 PCR 产物，其中一部分样品不存在。
PCR 反应中添加了错误体积的 DNA 和引物。
熟练使用移液器进行精准移液定量，确保移液的准确度
pcr技术审核中存在的问题和解决措施方案
反应条件不一致
总结词
反应条件不一致是PCR实验中常见的 问题之一，可能影响实验的重复性和 准确性。
详细描述
反应条件不一致包括但不限于：反应 体系不均一、反应温度不合适、循环 参数不一致等。这些问题会导致PCR 反应不均一，或者产生非特异性扩增 ，从而影响实验结果。
实验操作不规范解
02
决措施
规范实验操作流程
纯化模板
采用合适的纯化方法，如亲和色谱、离子交 换等，对模板进行纯化，以提高其质量和浓 度，减少非特异性扩增等问题的发生。
反应条件不一致解
05
决措施
建立反应条件标准化流程
确保PCR反应体系的一致性
确保每个PCR反应中使用的模板DNA、引物、酶等关键组件的浓度和质量相同，以确保 反应条件的一致性。
些标准。
对标准化操作规范的执行情况进 行监督和检查，以确保其实施效
果。
引物设计不合理解
03
决措施
建立引物设计标准流程
确保引物设计的科学性和合理性，建 立标准流程，包括引物设计的基本原 则、软件选择、参数设置、实验验证 等环节，确保每个步骤都得到规范执 行。
VS
针对不同实验需求，制定个性化的引 物设计方案，以适应不同的样本类型 、检测目标等实际情况。
制定标准的PCR实验操作流程 ，包括实验前的准备、实验操 作步骤和实验后处理等。
对实验操作流程进行详细说明 ，包括实验操作的细节和注意 事项，以确保实验结果的准确 性和可靠性。
对实验操作流程进行监督和检 查，确保实验操作严格按照规 定执行。
加强实验操作培训
01
对实验人员进行PCR技术的全面培训，包括理论知识和实践操 作，确保实验人员具备必要的技能和知识。
PCR常见问题分析及对策
PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性) 问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
PCR常见问题分析及对策
PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性)问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
定量PCR方法的使用中常见问题
定量PCR方法的使用中常见问题PCR（聚合酶链反应）是一种广泛应用于分子生物学领域的技术，它能够快速复制一小段DNA序列，使其增加到足够多的数量，以便进行进一步的研究。
而定量PCR是PCR的一种改进技术，它可以用来准确测量样品中特定DNA序列的数量，以及确定其在不同样品之间的相对丰度。
然而，在使用定量PCR方法时，常常会遇到一些问题。
本文将介绍定量PCR方法的常见问题，并提供解决方案。
常见问题一：PCR反应效率不稳定PCR反应效率是指每个循环中目标序列的复制增长率。
在定量PCR中，反应效率的稳定性至关重要，以确保准确地测量目标DNA的数量。
然而，由于各种因素的干扰，PCR反应效率可能会发生变化。
解决方案：1. 优化引物和探针的设计：确保引物和探针的序列与目标序列相匹配，并具有适当的长度和G+C含量。
2. 优化反应条件：调整PCR反应的温度、时间和缓冲液成分，以最大程度地提高反应效率的稳定性。
3. 检测PCR反应条件的一致性：在每次PCR实验前，都要检测热循环仪的准确性和一致性，以确保反应条件的一致性。
常见问题二：扩增效率不高在定量PCR中，扩增效率通常是指每个循环中目标序列的复制增长率。
如果扩增效率不高，会导致目标序列的数量被低估。
解决方案：1. 优化反应条件：调整PCR反应的温度、时间和缓冲液成分，以最大程度地提高扩增效率。
2. 检查引物和探针的设计：确保引物和探针的设计是合适的，以确保与目标序列的亲和力高。
3. 检查DNA样品质量：确保DNA样品的质量好，没有受到污染或降解。
常见问题三：存在PCR抑制剂在定量PCR中，有时会出现PCR抑制剂的存在，这些抑制剂会干扰PCR反应的进行，导致准确测量目标DNA数量的困难。
解决方案：1. 对待样品进行预处理：根据需要，对DNA样品进行各种预处理，如纯化、稀释、电泳分析等，以去除或减少PCR抑制剂的存在。
2. 检测PCR抑制剂的存在：使用质控实验验证PCR抑制剂的存在，例如在已知浓度的目标DNA中添加PCR抑制剂，然后检测其对PCR扩增效率的影响。
PCR实验室常见问题及经验分享
PCR实验室常见问题及经验分享一、没有ct值二、ct值过晚三、阴性对照扩增有信号四、标准曲线不佳五、熔解曲线峰不特异六、扩增曲线异常七、扩增效率低聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。
一、没有ct值检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。
一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;3、引物或探针降解。
可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可),对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。
二、ct值过晚在相对定量中,Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中,对低拷贝数的样品,Ct值会增大,但是一般不宜超过40循环,否则定量不准确。
因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况,需要根据具体实验设计和目的进行。
1、扩增效率低。
引物之间或者引物和探针的比例不合适,需要进行优化;引物或探针设计不合理,需要重新设计;2、PCR程序不合适,改用三步法进行反应,或者优化退火/延伸温度,可以适当降低退火温度;退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。
PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;4、PCR产物太长。
PCR产物设计超过500bp;5、模板存在抑制物。
用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。
PCR常见问题分析及对策
PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性)问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR引物设计的黄金法则（转自tiangen）1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。
在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区2.引物长度一般在15~30碱基之间。
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P C R常见问题分析及对策PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性) 问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
⑤模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。
或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。
靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。
需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。
这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。
③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。
二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。
可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。
二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。
其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
其对策有：①必要时重新设计引物。
②减低酶量或调换另一来源的酶。
③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。
④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。
其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。
②减少dNTP的浓度。
③适当降低Mg2+浓度。
④增加模板量，减少循环次数。
克隆PCR产物的最优条件是什么？最佳插入片段：载体比需实验确定。
1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。
应测定比值范围。
连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。
室温保温1小时，或4oC过夜。
在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。
室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4oC过夜。
PCR产物是否需要用凝胶纯化？如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。
如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。
少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。
为此需在克隆前做凝胶纯化。
如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？A）涂布未转化的感受态细胞。
如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。
B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。
例如，将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。
用SOC稀释到1000ul后，用100ul 铺板。
培养过夜，产生1000个菌落。
转化率为：产生菌落的总数/铺板DNA的总量。
铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。
具体而言转化用10ng DNA，用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA，用1/10铺板，共用1 ng DNA。
转化率为：1000克隆X10（3次方） ng /铺板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ ug感受态细胞如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。
C）如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生>20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ ug感受态细胞），表明载体失去T。
可能是连接酶污染了核酸酶。
T4 DNA连接酶（M1801，M1804，M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。
D）用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生>20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。
对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？A）连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4oC过夜。
B）插入片段带有污染，使3`-T缺失，或抑制连接，抑制转化。
为此，将插入片段和pGEM-T正对照混合，再连接。
如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。
如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失。
C）插入片段不适于连接。
用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生。
UV过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。
D）带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需。
加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。
详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料（TM042）。
E）高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞PCR疑难解答当PCR结果不甚满意时，首先检查以下几方面并遵照执行：将PCR反应的试管与反应板紧贴。
当酶反应混合物以70℃“热启动”开始循环时，切记在加入酶后稍微振荡一下，因为在0.2-ml的PCR管中不能均匀传热。
不要随意减少dNTP的用量，它是一个系统的因素，必须与其它成份保持平衡。
对于有问题的PCR反应，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加Taq酶前的体系进行预变性，后加模板进行正常PCR扩增。
没有扩增产物：在提供MgCl2缓冲液中，以0.25mmol/L为梯度增加MgCl2浓度；无MgCl2的缓冲液以0.5 mmol/L为梯度增加MgCl2浓度。
泳道中出现模糊条带，如果DNA模板中存在RNA，则按上述提示浓度补加MgCl2，因为在PCR反应中可能缺少游离的Mg2+。
检查退火温度和变性条件，如果有需要的话，可降低退火温度。
检查模板和引物的用量。
增加循环次数和/或模板DNA的用量。
泳道中出现模糊条带：减少循环次数或模板DNA的用量。
提高退火温度，但不要超过68℃。
重新设计引物或设计更长的引物。
其他值得注意的条件：建议使用0.2-ml薄壁管。