测酶活方法

新鲜凋落物和土壤酶活测定
-------适用与Bob Sinsabaugh Lab，1994 Steven Allison，2001
1） 从冷藏室中取出凋落物袋/从冷冻室中取出土样，把样品分成2份。
2） 1份用于称重，记录质量，然后放入牛皮纸袋中或者把土壤放入铝盒中，70-150℃烘干至恒重（2天），称干重。
3） 另1份称取约2g（湿重），记录准确地质量，放入小的广口瓶（blender Mini-jar）【能否用三角瓶】，加入60ml醋酸缓冲液，用磁力搅拌器搅拌1min（茎的话搅拌2min）。把混匀的混合液倒入标记过的瓶子。
4） 底物溶液的准备：
1.0N NaOH 溶液：40gNaOH 溶于1L 去离子水（高纯水，DI water）
50mM PH=5 醋酸缓冲液：4.374g 三水乙酸钠+1.1ml 冰醋酸溶于1L去离子水（高纯水，DI water）（用冰醋酸调节pH ）
注意：目的是为了在底物溶液饱和的情况下进行指标测定（conduct assay）。总体上，5mM 的底物溶液就足够了，但由于对样品不熟悉或者在悬浮液不够或者在培养过程中混合不充分，所以有必要用高浓度的底物溶液以保证 zero order kinetics。
测定指标
酶活指标 底物 磷酸酶（phosphatase） 5mM 对硝基苯磷酸二钠（pNP-phosphate）
186.5mg /100 ml 纤维素酶（cellobiohydrolase;CBH） 2 mM 对硝基苯纤维二糖糖苷（pNP-cellobioside）
92.7 mg/100ml B-葡糖苷酶（B-glucosidase;BG） 5mM 对硝基苯-B-葡糖苷（pNP-B-glucopyranoside）
150.7 mg/100ml B-N-乙酰葡糖胺糖苷酶（B-N-acetylglucosaminidase;NAG） 2 mM 对硝基苯B –N-乙酰葡糖胺糖苷（pNP-B-N-acetylglucosaminide）
68.5mg/100ml 多酚氧化酶（polyphenol oxidase;PPOD） 5mM 左旋多巴（L-DOPA）
98.6mg/100ml 过氧化物酶（peroxidase;POD） 5mM左旋多巴（L-DOPA）
98.6mg/100ml
可配好100-200ml的底物溶液保存于冰箱中，如果不污染能保存几周。
调节底物溶液的pH，有些溶液混合之后需要调节pH ，特别是对硝基苯磷酸二钠（pNP-phosphate）加入NaOH可能会明显降低pH.

　5)吸取0.75ml 混合液加入2ml 的离心管，再加入0.75ml 底物溶液。把离心管放在离心管架上，在摇床上20℃暗条件下培养1-6h。过氧化物（peroxidase;POD）样品及其底物对照（substrate control;S control）要再加入75μl 0.3%H2O2.
　注意：确保用磁力搅拌器把混合液混匀。为了避免草碎片堵住枪头的口，可把枪头端部剪掉一些，使口直径1-2mm。
　每个样品做3-4个平行，每个平行至少再做8个子平行。
　Sample control: 0.75ml 样品+0.75ml 缓冲液；
　Substrate control: 0.75ml 底物+0.75ml 缓冲液；
　Assay: 0.75ml 底物+0.75ml 样品；
　每个对照做2个平行
　培养时间：磷酸酶---45min; 多酚氧化酶和过氧化物（PPO和POD）-----1-2h；B-N-乙酰葡糖胺糖苷酶（NAG）------3h；纤维素酶（CBH）----4h；B-糖苷酶----1h;
6）4

℃ 10000rpm 离心1-2min ，吸取0.75ml 上清液于10ml 培养管中或离心管中。（多酚氧化酶和过氧化物酶尽可能的多吸一些）。
7）每个管中加入0.075ml 1.0N NaOH 终止反应并显色。
8）加入3ml 去离子水（DI water），混匀
9）在410nm处读吸光值。用去离子水调零。
注意：如果样品的吸光值超过了2.000，需要把培养的时间缩短一些重新测定。
10）酶活性用每克干重每小时水解底物的μmol数来表示μmol/g?h
OD（optical delnsity；光密度）=吸光值assay－（吸光值substrate control+吸光值sample control）
酶活（μmol/h?g）=吸光值/[EC(μmol/ml)/1.5ml（assay）/h(培养时间)/（g/ml样品混合液）（0.75ml混合液）]
g=g(凋落物湿重)*（凋落物干重/凋落物湿重）
酶活=


注意：这个条件下对硝基苯酚的EC（extinction coefficient）为3.4。通过把1μmol/ml的对硝基苯酚标准溶液稀释成不同的浓度来制作一个标准曲线，0.75ml 标准液+0.075ml 1.0N NaOH +3.0ml 去离子水。在410nm处测定吸光值。根据吸光值和浓度来做相关分析，求相关方程，斜率a就是EC（extinction coefficient），吸光率和浓度呈线性关系，OD最高达到2.000


11）多酚氧化酶和过氧化物酶在450nm处测定吸光度
注意：用100μl mushroom 酪氨酸酶（1mg/ml 溶于50mM 醋酸缓冲液中），3ml 醋酸缓冲液和1ml 1mM 左旋多巴（LDOPA）或者焦酚（pyrogallol），均用醋酸缓冲液溶解，室温放置6小时在450nm(LDPOA)或者410nm（焦酚pyrogallol）处测最大吸光度。测定100μl 反应混合液的吸光值。然后除以0.25μmol/ml，得到吸光度/(μmol/ml).得到的EC大概在0.403