细菌感染的分子生物学检验

第二节 结核分枝杆菌的分子生物学检验
结核分枝杆菌(TB)，简称结核杆菌，是引起结核 病的病原体。随着抗结核药物的不断发展和卫生 生活状况的改善，结核的发病率和死亡率曾一度 大幅下降。近年，由于艾滋病和结核分枝杆菌耐 药菌株的出现、免疫抑制剂的应用、吸毒、贫困 及人口广泛流动等因素，全球范围内结核病的疫 情死灰复燃。 据WHO统计，全世界约1/3的人感染了结核分枝 杆菌，在某些发展中国家成年人中群中结核分枝 杆菌携带率高达80%，其中的5%~10%携带者可 发展为活动性结核病。
TB是一种革兰氏阳性菌，G+C含量高，其细胞壁 除肽聚糖层外，还含有另外一层由特殊脂质、糖 脂和多糖组成的附加层。TB呈细长略弯曲，常聚 集成团，用抗酸性染色被染成红色。
对养要培求特殊条件，一 般要经4-6周才出现肉眼可 见的菌落。TB通过呼吸道、 消化道和破损的皮肤粘膜 侵入机体，它被吞噬后能 在吞噬细胞内繁殖，导致 巨噬细胞裂解，还可在细 胞外繁殖。
6、扩增结核分枝杆菌直接试验（ AMTDT）
AMTDT以结核分枝杆菌的16SrRNA为扩增模板，采 用转录介导的扩增技术对靶核酸进行扩增，采用化 学发光物吖啶酯标记的cDNA探针与扩增的靶基因杂 交，探针与扩增产物杂交后利用杂交保护试验除去 未杂交的标记探针，最后利用化学发光仪检测化学 发光信号。
结核分枝杆菌天然地对很多抗生素有抵抗力，使得 治疗极其困难。该菌的药物抵抗力主要由于其具有 高度疏水的细胞壁充当渗透屏障。同时，在基因组 中还发现有许多药物抗性决定因子的编码序列，包 括水解酶或者药物修饰酶，例如乙酰转移酶和很多 药物外排泵系统。
抵抗力特点：“三耐四敏” ※耐干燥、耐酸碱、耐孔雀绿（1：13000） ※对湿热、70％乙醇、紫外线、常用抗结核药物（但长
8、GeneXpert全自动结核检测平台
将样品前处理、核酸提取、PCR检测和结果分析等全 过程结合在一起，最大程度上提高检测自动化和灵敏 度。XpertMTB/RIF，通过六重荧光定量PCR对结核分 枝杆菌和利福平耐药性进行快速检测。
（二）结核分枝杆菌的耐药性检测
结核分枝杆菌耐药的分子机制是由于结核杆菌的特定基 因某些碱基出现突变（插入、缺失、替换）而造成。
二、结核分枝杆菌的分子生物学检验内容
（一）结核分枝杆菌核酸的检测
可采用PCR、real-time PCR、PCR-RFLP、线性探针杂 交、链替代扩增技术、扩增结核分枝杆菌直接试验、基 因芯片技术、全自动结核检测平台等方法检测标本中的 TB DNA。 1、 PCR PCR扩增所选靶序列主要有65kD抗原基因、 MPB蛋白基因、rRNA基因、TB IS6110插入序列、染色 体DNA的重复序列等。常规PCR的不足：产物的交叉污 染、假阳性、假阴性、实验室污染。 2、real-time PCR 与传统PCR相比，具有敏感度、特 异性高及方便快速等优点，特别是对难以培养与生长缓 慢的结核杆菌的检测更有优势。
（4）耐吡嗪酰胺分子机制：吡嗪酰胺需经结核分枝杆菌 体内的吡嗪酰胺酶催化才能转变成具有活性的吡嗪酸。 耐吡嗪酰转换成活性形式的能 力，形成耐药。
（5）耐乙胺丁醇分子机制：耐乙胺丁醇主要与操纵子 cmbB基因有关， cmbB突变导致糖基转移酶结构，影响 乙胺丁醇和糖基转移酶的结合而产生耐药，其中第306 位密码子的错义突变最为常见。 （6）耐氟喹诺酮类药物分子机制：氟喹诺酮类药物主 要靶位是结核杆菌的DNA旋转酶，该酶由gyrA和gyrB两 种基因编码的两个A亚单位和两个β亚单位组成。 其中编码的gyrA基因发生突变则导致氟喹诺酮类药物结 合位点构象改变，从而产生耐药性。 突变大多数发生在gyrA基因保守区67~106位密码子区， 常见有94位GAC→GCC或CAC或TAC， 90位GCC→GTG的突变。
其中以编码531位氨基酸的碱基TCG→TTG和编码526位 氨基酸的碱基CAC→TAC的突变最常见。
（2）耐异烟肼分子机制：结核杆菌耐异烟肼与过氧化氢 酶-过氧化物酶编码基因(katG)、烯酰基还原酶编码基因 (inhA)、烷基过氧化氢酶还原酶编码基因(ahpC)、β2S酮 酰基酰基运载蛋白合成酶编码基因(kasA)有关。
5、链替代扩增技术 （ SDA） SDA是一种基于酶促反应的新的DNA体外等温扩增技术。 基本原理： 引物与靶DNA序列上对应的DNA单链杂交，在聚合酶作 用下产生带HincⅡ识别位点含5’和3’端的靶DNA序列， 该靶序列进入DSA循环；HincⅡ限制性核酸内切酶切割 识别位点，依赖DNA聚合酶在切割处延伸3’端，并替 代另一条DNA链；该替代链与引物杂交后又依次作为另 一扩增反应的靶源，这些步骤在反应体系中不断重复， 使靶DNA序列呈指数性增长；37℃ ~40℃进行23次循环 后，2h内靶序列可得到108扩增放大。 SDA法以IS6110和16SrRNA基因为扩增靶点。
传统上对于细菌感染的病原体检测主要采用免疫学、 微生物学和血液学等相关技术，但这些技术方法受灵 敏度和特异性的限制，不易达到早期诊断。
利用分子生物学技术检验感染性病原体自身遗传物质 （RNA或DNA），从而达到早期、快速、敏感、特异 地检测已经成为临床检验的主流技术之一。
第一节 细菌感染的分子生物学检验策略
AMTDT方法具有高度的敏感性特异性。对涂片阳性 TB诊断的敏感性达到92%~100%，对所有临床标本 检测的特异性均在95%以上，因此具有极大的临床 应用价值。
7、基因芯片技术、
1999年 Troesch 等开发出首块结核病相关芯片，包括 两部分，一部分是在结核分枝杆菌有种间的多态性的 16SrRNA 基因片段，借以鉴别结核杆菌与非结核杆菌； 另一部分则用于分析耐利福平菌株rpoB基因突变的发 生情况，可用于结核分枝杆菌对利福平耐药性的快速 检测。
187个ORF参与脂类代谢、细胞壁合成， 360个参与细胞壁代谢， 66个参与脂类合成， 287个参与能量代谢， 95个参与氨基酸合成， 38个与细菌毒力相关， 69个参与DNA合成。
所编码的蛋白约有40%的为功能性蛋白，44%的 与已知蛋白有相似性信息，16%的则为未知蛋白。 TB不同菌株之间存在多个差异基因。 基因组中有3个毒力因子：mce、过氧化氢酶-过 氧化物酶和sigA。除了这些单基因毒力因子，细 菌的胞壁也对致病性起着重要的作用。
2、结核分枝杆菌耐药性检测的分子生物学技术 （1）DNA测序：该技术是检测基因突变的金标 准，不仅可用于突变的筛选，而且能确定突变碱 基的部位和分布。 （2）PCR-SSCP （3）PCR-RFLP （4）PCR-ROB （5）基因芯片技术
三、分子生物学检验的临床意义
传统的结核病的临床诊断主要是根据病史、细 菌培养、涂片抗酸染色找TB、免疫学方法检测 TB抗原或抗体、胸片等可对大多数患者做出正 确的临床诊断，但对部分病人可造成误诊或漏 诊。分子生物学方法为TB的临床诊断提供了一 种快速、准确的诊断方法，具有以下特点：
一、细菌感染的一般性检出策略
细菌感染性的分子生物学检验的一般性检出就是以感 染病原体的特异核酸序列作为检测目标序列，利用分 子生物学技术对目标序列进行检测，从而直接判断有 无细菌感染和是何种病原体感染。
二、细菌感染的完整性检出策略
完整性检出策略，即不仅对病原体作出快速准确诊断， 还需要对其进行分型（包括亚型）和耐药性等方面的 检测，尽可能地为临床诊疗提供更为详尽的细菌病原 体的相关信息。
（3）耐氨基糖苷类药物分子机制：耐链霉菌的结核杆菌 主要由于编码核算糖体16S rRNA的rrs基因与编码核糖体 蛋白S12的rpsL基因发生突变，从而降低了氨基糖苷类药 物结合到核糖体上的能力，形成耐药。 rpsL基因中编码第43位氨基酸的碱基A→G的突变是常见 的突变位点出。Rrs基因突变点为512、513位的碱基插 入，这些碱基突变均可导致高水平的耐药。
期使用易产生耐药性） 变异性 ※典型形态→多形性 ※ R型菌落→S型菌落 ※有毒→无毒（用于制备疫苗） ※抗结核药敏感→耐药
目前结核杆菌常规检测方法
痰涂片法阳性率低，且易受非结核杆菌的污染。 培养法目前认为是诊断的“金标准”但结核杆菌 生长缓慢，不利于临床上的及时诊断和治疗。 血清学试验由于分枝杆菌属各菌之间抗原有着广 泛的交叉，特异性不强。
分子生物学检验是以核酸（DNA或RNA）或蛋 白质分子为检验目标，通过检查人体内源基因 或外源（病原体）基因的存在、缺陷或表达异 常，对人体状态或疾病作出特异性诊断的方法 和过程。
机体感染细菌后，应用分子生物学技术直接测 定这些细菌病原体基因，不仅可以对微生物感 染作出明确诊断，同时也能诊断出带菌者或潜 在性感染，还可以对感染性病原体进行分型和 耐药性监测。
1、在TB感染早期，特别是在 TB 病灶通过血源性 外传播时及在外周血中存在极少量的TB 时，分 子生物学方法能通过体外扩增进行确诊。而早期 诊断在临床诊疗中具有重要的指导意义，可以防 止继发性TB病灶的形成。
2、PCR检测TB仅需2~4小时，克服了传统TB培 养方法需时间长、痰涂片检查阳性率低的缺点， 提高了临床检测的敏感性和特异性。
在H37Rv 全基因组中有16个拷贝的IS6110插入序列和6个 拷贝的IS1018，大多数插入序列位于基因间或非编码区， 通常靠近tRNA基因聚集成串，插入序列在染色体中主要分 布在重复区。
TB H37Rv 基因组中共有3924个开放阅读框，其 中91%有潜在的编码能力，ORF中最常见的起始 密码子61%为ATG，35%为GTG。
一、结核分枝杆菌的基因组结构特征
TB H37Rv 全基因组为环状双链 DNA，长约4 411 529bp，共有 4000基因， G+C平均值65.6%， 其基因序列高度保守。 H37Rv 基因组中有50 个编码功能 RNA 的基因，其中 45 个 tRNA基 因，3 个 rRNA 基因和 2 个核稳定 （stable）RNA基因，这些 RNA 分子是由特异的核糖体RNA 操纵 子产生的。
主要是katG基因的点突变、缺失、插入，完全缺失占异 烟肼耐药菌株的7%~24%，主要出现于高水平耐异烟肼 分离株中，随机突变占50%~70%，常见的点突变是315 位AGC→ACC和463位CGG→CTG。