电化学生物传感器原理、发展趋势及应用

电化学生物传感器原理、发展趋势及应用
一、电化学生物传感器的检测原理
电化学生物传感器（electrochemical biosensor）是指由生物材料作为敏感元件，电极（固体电极、离子选择性电极、气敏电极等）作为转换元件，以电势或电流的变化为特征检测信号的传感器，简称生物电极。

这类传感器发展最早，研究内容十分丰富，并已经得到广泛应用。

电流型传感器主要基于探测生物识别膜或化学反应中的电活性
物质，通过固定工作电极的电位提供电活性的电子转移反应驱动力，探测电流随时间的变化。

该电流直接反映了生物分子识别和电子转移反应的速度，即该电流与待测物质的浓度成正比。

电位型传感器将生物识别反应转换为电位信号，该信号与生物识别反应过程中产生或消耗的活性物质浓度对数成正比，从而与待测物质浓度的对数成正比。

电位型离子选择电极的选择性渗透离子导电膜可设计成与待测离子
相关的产生电位信号的敏感膜，测试在电流为零的条件下进行。

根据作为敏感元件所用生物材料的不同，电化学生物传感器分为酶电极传感器、微生物电极传感器、电化学免疫传感器、组织电极与细胞器电极传感器、电化学DNA传感器等。

电化学生物传感器具有以下特点：
1.适合于对生物体液中的物质活度测定的需要，响应直观，通过
计算机联用，可直接读出待测生物物质的浓度或活度。

2.由于其具有分子识别的功能和高选择性，在许多测定中，样品无需复杂处理，操作简便，易于自动化监测，可连续监测患者的血液物质浓度。

3.测定速度快电讯号的输出和测定响应快速，通过与计算机的
接口还可进行多成分同时测定。

4.试样用量少可以将敏感探头微型化，只需微升级样品即可完
成分析。

如有的K+、Ca2+、Cl-、Na+及CO2分析仪仅需50μl样品，每小时可测100个样品，这为临床检验缩短检测周期提供了条件。

5.可对体内物质直接和动态测量。

将微小探头埋在体内或留置于血管中，可以指示体内物质的变化，有利于床旁或现场检测。

6.灵敏度高例如AFP免疫电极可测定10-8～10-10 g/ml的浓度。

由于使用生物材料作为传感器的敏感元件，所以电化学生物传感器具有高度选择性，是快速、直接获取复杂体系组成信息的理想分析工具。

已在临床检测、生物医学、环境分析等领域得到了实际应用。

二、酶电极生物传感器
酶电极生物传感器是生物传感器发展史上的里程碑，具有高灵敏度和高选择性，并且使用简易，至今仍广泛应用。

1962年，Clark在氧电极的基础上发展了第一个生物传感器——葡萄糖酶电极传感器。

该传感器应用氧电极检测葡萄糖氧化酶分解葡萄糖时消耗的氧的多
少间接反映血液中葡萄糖浓度。

其中氧电极由阳极、阴极、可渗透氧的多层膜及电解液组成。

氧分子渗透多层膜到达阴极表面，通过检测电流大小即可知道氧浓度。

在氧电极的基础上，Clark将葡萄糖氧化酶作为分子识别元件固定于电极表面，在葡萄糖氧化酶的催化下，葡萄糖被氧氧化生成葡萄糖酸和过氧化氢，通过测定氧消耗量即可得知葡萄糖浓度。

C6H12O6+O2→C6H12O7+H2O2将葡萄糖氧化酶固定于电极表面是第一代酶电极传感器的特征。

这种传感器所使用的方法即为间接测定法，所以干扰因素较多。

第二代酶电极传感器是采用氧化还原电子媒介体在酶的氧化还原活性中心与电极之间传递电子。

这类传感器不受测定体系的限制，测量浓度线性范围较宽，干扰少。

第三代酶电极传感器正在发展中，其原理为酶的氧化还原活性中心直接和电极表面交换电子。

酶电极传感器所用生物酶通常由微生物中提取，可通过物理或化学方法固定于膜表面。

物理固定方法包括吸附和捕获方法；化学固定方法有共价键结合和交联结合（图-1、表-1）。

表-1 酶电极传感器固定方法示例
图-1 四种固定方法示意图
酶电极传感器广泛应用于食品和医学领域。

其中应用最为广泛的酶电极传感器当属葡萄糖传感器，用于监测血液中葡萄糖浓度。

如今简便、易用的葡萄糖传感器方便高血糖患者在家自我监测，只需要1滴血便可在60秒内得到检测结果。

传感器中电极上包被了羧甲基纤
维素用以去除血液中细胞对检测过程的影响。

这类传感器经过不断的改进，已发展成为一次性产品。

其他如醇传感器也主要应用于食品和医学领域。

醇传感器的检测原理为检测醇氧化酶分解醇类时产生的过氧化氢浓度来指示醇的浓度。

醇氧化酶不仅可以分解乙醇，还可以分解甲醇和丙醇等，因此该传感器检测的为总醇浓度。

酶电极传感器不仅可单独应用，也可联合应用。

例如检测储存鱼类的新鲜程度。

通过检测鱼肉中肌苷、肌苷酸和次黄嘌呤的浓度计算其新鲜指数。

该传感器将核苷酸酶、核苷磷酸化酶及黄嘌呤氧化酶整合在一个传感器中，整个分析过程仅需20分钟，极大地简化检测过程，且检测结果与传统方法具有高度一致性。

三、微生物电极传感器
由于酶电极传感器所用酶制作成本高，价格昂贵且稳定性较差，限制了其在传感器中的应用，因此研究者试图直接利用活的微生物来作为分子识别元件的敏感材料。

这种将微生物（常用的主要是细菌和酵母菌）作为敏感材料，固定在电极表面而构成的电化学生物传感器称为微生物电极传感器（图25-3），通常应用于发酵工业、食品检验、医疗卫生和环境监测。

根据其工作原理大致可分为三种类型：①利用微生物体内含有的酶（单一酶或复合酶）系来识别分子，这一类型与酶电极类似；②通过检测有氧微生物呼吸活性的变化，即通过氧电极测量体系中氧浓度的变化间接测定待测物的浓度；③通过测定厌
氧微生物代谢产物的浓度间接测定待测物的浓度。

图-2微生物传感器检测原理示意图
有氧微生物代谢时需要氧，因此可将有氧微生物作为识别元件。

当待测物影响微生物的呼吸活性时，可通过测定氧浓度的变化间接测定待测物浓度。

例如以铜绿假单胞菌作为识别元件固定于电极表面，可测定液体中的葡萄糖浓度。

铜绿假单胞菌分解葡萄糖时需要消耗氧，电极周围的氧浓度降低，从而引起电流发生变化。

通过测定电流变化计算液体中氧浓度，再根据细菌分解葡萄糖耗氧的比例关系可计算液体中的葡萄糖浓度，这也可以发展为另一种类型的葡萄糖传感器。

液体中葡萄糖浓度可影响铜绿假单胞菌的呼吸活性。

高浓度的葡萄糖可促进细菌呼吸代谢，从而剧烈消耗氧。

反之，细菌呼吸活性降低。

因此，可利用待测物影响微生物呼吸活性的特性来测定待测物浓度。

生化需氧量（biochemical oxygen demand，BOD）是检测水质的一个重要指标。

传统标准方法检测BOD需要5天时间，不能及时反映水质情况。

而应用微生物电极传感器30分钟内即可报告检测结果。

BOD传感器的生物识别元件可以由不同的微生物群体构成。

这些微生物群包括单一微生物（如Arxual adeninivorans，Bacillus polymyxa D212，Trichosporon cutaneum等）、两种微生物混合体（如Bacillus subtilis 和Bacillus licheniformis 7B，Rhodococcus erythropolis和Issatchenkia orientalis）、微生物菌团、活性污泥、甚至是干燥的死细胞。

单一微生物电极传感器具有很好的测量稳定性和高识别专一性，但传感器的广谱性较差。

相反，由多种微生物混合构成识别元件（如活性污泥、微生物群等）的生物传感器具有很好的广谱性，但由于微生物之间异质性易导致测量不稳定。

常见的BOD传感器是将皮状丝孢酵母菌（Trichosporoncutaneum）固定在纤维素膜上，然后将纤维素膜固定于氧电极上，根据电流的变化采用平衡法测定水中的BOD值。

这类传感器相对误差＜10%，使用寿命最长可达48天。

总之，微生物电极传感器由于价廉、使用寿命长而具有良好的应用前景。

但是，它的选择性和长期稳定性等还有待进一步提高。

四、其他电化学生物传感器的应用及发展趋势
（一）在检验医学中的应用
1.血气分析
血液中的pH、PO2、PCO2等，可以体现呼吸、循环系统的功能及酸碱平衡状态。

O2电极、CO2电极及玻璃电极都是比较成熟的电极。

早已用于临床检验分析中。

2.血液生物化学
用电化学传感器检测血液中Na+、K+、Cl-、Ca2+、Mg2+、NH3、葡萄糖、乳酸、尿素、肌酸、尿酸及氨基酸等物质的浓度。

3.在体测定
微型的选择性电极可直接植入人体内测定血浆、脑脊液及细胞间的液体中的Li+、Na+、K+、Ca2+、H+等。

最近又出现了一种可以置
于皮肤上即可直接监测临床危重患者的化学传感器。

此外，一种新的体内微量渗透取样生物传感器也有报道。

它通过模拟毛细管作用，在待测定部位（如脑、肝、肾等部位）植入一支直径通常在0.2～0.5mm 的渗透膜制备的人造血管式探头，连续收集和抽取探头内的细胞间液，用来测定细胞间液中的神经递质、代谢产物、氨基酸、嘌呤、肽、葡萄糖及乳酸等。

4.免疫检测
抗体与相应抗原具有特异的识别和结合功能。

电化学免疫传感器就是利用这种识别和结合功能，将抗体或抗原和电极组合而成的检测装置。

根据电化学免疫传感器的结构可将其分为直接型和间接型两类。

直接型的特点是在抗体与其相应抗原识别结合的同时，将其免疫反应的信息直接转变成电信号。

间接型的特点是将抗原和抗体结合的信息转变成另一种中间信息，然后再把这个中间信息转变成电信号。

间接型电化学免疫传感器通常是采用酶或其他电活性化合物进行标记，将
被测抗体或抗原的浓度信息加以化学放大，从而达到极高的灵敏度。

免疫生物传感器可用于血清、蛋白质代谢异常的诊断。

非标记免疫电极的实例之一是梅毒检测用的电极，另一种为利用血型物质（抗原）制成血型检验的免疫电极，此外，将人绒毛膜促性腺激素（hCG）的抗体修饰在TiO2电极表面上，可用于hCG的定量测定。

标记免疫电极已用于测定免疫球蛋白G、A、M、hCG及AFP，并且在30秒内可测AFP的浓度，检测限低达10-8～10-11 g/ml。

此外，用固化人体球蛋白膜和场效应管构成的酶免疫微型传感器已有报道。

5.DNA检测
电化学DNA传感器是利用单链DNA （ssDNA）或基因探针作为敏感元件固定在固体电极表面，与溶液中的同源序列特异识别作用（分子杂交）形成双链DNA（dsDNA），使电极表面性质改变，来达到检测基因的目的。

Hashimoto等利用光刻微细加工技术，刻蚀出直径0.3mm固定有DNA探针的微金膜电极，并以电活性物Hoechst 33258作杂交指示剂检测了患者血清HBV-DNA的浓度。

Singhal和 Kuhr利用在铜表面核糖和氨基的电催化氧化，研制出了用腺嘌呤和鸟嘌呤核碱基氧化检测不同DNA的电化学传感器。

此外，电化学生物传感器还可应用于基因突变和损伤的检测。

1997年Wang等就直接用固定dsDNA的微型电化学传感器研究DNA中鸟嘌呤的氧化信号变化探讨了紫外光辐射引起
的DNA损伤，包括DNA构象变化和鸟嘌呤的光致化学反应。

有关DNA修饰电极的研究除对基因检测有重要意义外，还可将DNA修饰电极用于与外源分子间的相互作用研究，如抗癌药物筛选、抗癌药物作用机制研究以及用于检测DNA结合分子。

毫无疑问，它将成为生物电化学的一个非常有生命力的前沿领域。

（二）在环境监测和食品卫生监督中的应用
1.环境监测
酶生物传感器在环境监测中应用广泛，对有机磷酸酯及氨基甲酸酯类杀虫剂的最低检测极限已达10-10g水平。

此外，酶传感器还可监测环境中多种污染物，如用酚氧化酶作生物元件的酶传感器可测定环境中的对甲酚。

微生物传感器广泛应用于检测环境中的农药残留物、氯苯甲酸盐类物质、苯类物质、氰化物、多氯联苯和有毒重金属等。

目前，已有用于水质监测的BOD传感器、硝酸盐微生物传感器、酚类及阴离子表面活性剂传感器和水体富营养化监测传感器，以及有利于大气和废气监测的亚硫酸、亚硝酸盐、氨、甲烷及CO微生物传感器等。

目前也有报道利用电化学传感器体系来检测环境中致癌物、芳族胺、多氯联苯等。

通常采用计时电位分析法，通过固定在电极表面的DNA杂交后出现的鸟嘌呤（guanine）峰值的氧化信号来检测致癌污染物。

一些结合在DNA上的小分子、由电离辐射引起的DNA破坏及二甲基硫酸盐等都可通过鸟嘌呤的电化学信号来描述。

该方法已应用于河流和污水样品的分析。

2.食品卫生
电化学生物传感器在食品分析中的应用包括食品成分、食品添加剂、有害毒物及食品新鲜度等的测定分析。

在食品工业中，葡萄糖的含量是衡量水果成熟度和贮藏寿命的一个重要指标。

已开发的酶电极生物传感器可用来分析白酒、苹果汁、果酱和蜂蜜中的葡萄糖等。

亚硫酸盐通常用作食品工业的漂白剂和防腐剂，采用亚硫酸盐氧化酶为敏感材料制成的电流型二氧化硫酶电极可用于食品中的亚硫酸盐含量测定。

此外，也有用传感器测定色素和乳化剂的报道。

微生物传感器具有成本低、设备简单、不受发酵液混浊程度的限制、可以消除发酵过程中干扰物质的干扰等特点。

因此在发酵工业中广泛地采用微生物传感器作为有效的测量工具。

它可用于测量发酵工业中的原材料和代谢产物。

另外，还可用于微生物细胞数目的测定。

利用这种电化学微生物传感器可以实现菌体浓度在线连续测定。

近年来随着生物科学、信息科学和材料科学发展的推动，电化学生物传感器技术发展迅速。

其发展趋势如下：
1.功能多样化
未来的电化学生物传感器将进一步涉及医疗保健、疾病诊断、食品检测、环境监测、发酵工业的各个领域。

2.微型化
随着微加工技术和纳米技术的进步，电化学生物传感器将不断的微型化，各种便携式传感器的出现使得在家中、床旁、现场进行疾病诊断，以及在市场上直接检测食品成为可能。

3.智能化和集成化
未来的电化学生物传感器必定与计算机紧密结合，自动采集数据、处理数据，更科学、更准确地提供结果，实现采样、进样、结果一条龙，形成检测的自动化系统。

同时，芯片技术将越来越多地进入传感器领域，实现检测系统的集成化、一体化。

4.低成本、高灵敏度、高稳定性和高寿命
电化学生物传感器技术的不断进步，必然要求不断降低产品成本、提高灵敏度、稳定性和延长寿命。

这些特性的改善也会加速电化学生物传感器市场化、商品化的进程。

今后，与人类生活、健康有关的各类生物传感器有望得到较大的发展。

各类新型生物传感器及其便携式测试系统的研制，使保健、疾病诊断、食品检测、环境监测不仅在生化分析实验室进行，还能向个人、家庭和现场检测发展。