微生物的培养和应用

专题2 微生物的培养与应用
课题3 分解纤维素的微生物的分离
一、基础知识回顾
1、培养基概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。

2、培养基种类：液体培养基和固体培养基，二者的区别是是否添加凝固剂，其中实验室中常用的凝固剂是琼脂。

3、培养基营养成分：（1）主要营养物质：碳源、氮源、水和无机盐。

（2）其他条件：pH、特殊营养和氧气。

4、微生物的培养和分离过程中的无菌技术：(1)目的：获得纯净的培养物。

(2)关键：防止外来杂菌的入侵。

(3)常用方法：灭菌（培养皿—干热灭菌；培养基—高压蒸汽灭菌；接种环—灼烧灭菌）和消毒（操作者灭双手—化学消毒；操作室—紫外线消毒）。

5、高压蒸汽灭菌法：压力为100 kPa，温度为121℃，灭菌时间为15~30min.
6、巴氏灭菌法，亦称低温消毒法，是由法国微生物学家巴斯德发明的低温杀菌法，是一种利用较低的温度既可杀死病菌又能保持物品中营养物质风味不变的消毒法，常常被广义地用于定义需要杀死各种病原菌的热处理方法。

7、干热灭菌法是指在干燥环境（如火焰或干热空气）进行灭菌的技术。

一般有火焰灭菌法和干热空气灭菌法。

适用于干燥粉末、凡士林、油脂等。

8、倒平板：待培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。

9、菌落：由单个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。

10、平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基的表面连续划线操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。

11、稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，稀释度足够高时，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞。

为了使微生物在培养基上能够均匀分布，一般用涂布法将微生物接种在培养基上。

12、微生物的接种方法还包括斜面接种、穿刺接种等，其核心是防止杂菌污染，保证培养物的纯度。

13、平板划线操作中灼烧接种环的目的：第一次划线前：杀死接种环上原有的微生物，防止外来杂菌污染培养基；第二次及以后每次划线前：杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端。

最后一次划线后：杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。

14、菌种的保藏方法：（1）临时保藏法：（适合于频繁使用的菌种）先接种到试管的固体斜面培养基上培养，然后放入 4 ℃的冰箱中。

（2）甘油管藏法（适合于长期保藏的菌种）转入灭菌后的甘油中，混匀后放在-20 ℃冷冻箱中保存。

15、培养基中营养物质的确定方法：
①自养型微生物所需的主要营养物质是无机物，碳源可来自大气中的CO2，氮源可由含氮无机盐提供。

②异养型微生物所需的营养物质主要是有机物，即碳源必须由含碳有机物提供，氮源也主要由有机物提供，部分异养型微生物也可以利用无机氮源。

16、选择无菌技术的原则。

①考虑无菌技术的效果：灭菌的效果比消毒要好。

②考虑操作对象的承受能力：活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒，而不能灭菌。

17、纯化大肠杆菌的两种方法的异同。

①相同点：平板划线法和稀释涂布平板法都能获得单细胞菌落。

②不同点：平板划线法不能对微生物计数，而稀释涂布平板法能对微生物计数。

18、微生物的生长需要碳源、氮源等营养物质，培养基中的牛肉膏、蛋白胨为微生物的生长既提供了碳源，也提供了氮源。

微生物培养通常采用的培养基是固体培养基，其中的琼脂，
在培养基中起凝固剂的作用。

19、判断培养基制作与接种操作是否合格的方法：
(1)从培养基制作是否合格上判断：如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。

(2)从接种操作是否符合无菌要求上判断：
①如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合接种菌菌落的特点，说明接种操作是符合要求的。

②如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作未达到要求，需要分析原因，重新操作。

20、(1)培养基一般采用高压蒸汽灭菌法灭菌。

在配制培养基时，需要先调节pH，后灭菌。

(2)菌落可以通过肉眼观察，而单个细菌无法通过肉眼观察，需要借助显微镜观察。

21、统计菌落数目：（1）间接计数法：(稀释涂布平板法)样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

公式：每克样品中的菌株数= (C÷V)×M。

其中：C：某稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)；M：稀释倍数。

缺点：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。

误差比实际值偏小。

（2）直接计数法(显微计数法)：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在
显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。

公式：每毫升原液所含细菌
数=每小格平均细菌数×400×10 000×稀释倍数。

缺点：不能区分细胞死活。

误差比实际值偏大。

22、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数：（1）筛选菌株：①寻找目的菌株的方法：根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找(生物和环境是相适应的）。

②实验室中微生物的筛选：方法：人为提供有利于目的菌株生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物生长。

23、筛选尿素分解菌时使用以尿素为唯一氮源的选择培养基进行培养。

24、选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。

25、土壤中分解尿素的细菌的分离：(1)土壤取样：富含有机质的土壤表层土（3--8cm)。

(2)样品的稀释：通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30～300、适于计数的平板。

(3)接种：用稀释涂布平板法接种。

（4）培养：①细菌30~37℃培养1~2天；②放线菌25~28℃培养5~7天；③霉菌25~28℃培养3~4天。

(5)观察：根据菌落的特征区分微生物。

(6)计数：统计菌落的数目。

(7)计算：根据公式计算单位体积中的菌体数。

26、分解尿素的细菌的鉴别：(1)方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养分解尿素的细菌。

(2)原理：分解尿素的细菌→脲酶→CO(NH2)2+H2O →CO2+2NH3加入酚红指示剂变红色。

(3)实验现象及结论：①培养基变红：该种细菌能分解尿素。

②培养基不变红：该种细菌不能分解尿素
27、(1)只得到1个菌落数在30～300的平板：不符合实验的重复原则，易受到偶然因素的影响。

(2)得到3个或3个以上菌落数在30～300的平板：也不一定正确，如得到3个平板，菌落数分别为230、34、240，虽然菌落数均在“30～300”，但由于34与另外两个平板上的菌落数差异较大，应找出原因并重新实验。

28、（1）分解尿素细菌的培养基中葡萄糖的主要作用是为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原材料。

（2）分解尿素细菌的培养基中KH2PO4和Na2HPO4的作用是为细菌生长提供无机营养，
作为缓冲剂保持细菌生长过程中pH稳定。

29、无氮源的培养基可以用于培养固氮微生物，该类微生物可以利用空气中的N2作为氮源。

30、无碳源的培养基可以用于培养自养型微生物，该类微生物可以利用空气中的CO2作为碳源。