mRNA展示技术
mRNA展示技术ppt课件
人们已利用这种新的技术鉴定了许多功能性 多肽，包括 RNA 结合肽、TNF-α 结合因 子等，建立了以 mRNA 体外展示技术筛选 与抗肿瘤药物的重要靶酶———胸苷酸合 成酶mRNA高度亲和多肽的方讨
Structure of mRNA-linker
体积25ul,其中含10xPCR缓冲液2.5 u凝胶载体上，然后加入 400ul
洗涤5~6遍后，加入洗脱液(无酵母 tRNA) 及
mRNA展示技 术
应用：
CAT(Cambridge Antibody Technology) 应用体外展示技术制备单克隆抗体用于疾 病的治疗：
D2E7 ABT-874 CAT-192and GC1008
CAT-5001 (formerly SS1P)
目前应用的组合多肽/蛋白质库技术包括 噬菌体展示技术(phage display) 酵母双杂交 与核糖体展示技术(ribosome display，RD) mRNA体外展示技术( mRNA display)
基本原理：借助一种蛋白质合成 抑制剂嘌呤霉素(puromycin)来 形成mRNA- 蛋白质融合体，从 而实现基因表型 (RNA)与蛋白质 表型(多肽) 的结合. 嘌呤霉素是 一种模拟子的3’端，当 mRNA 翻译完成时，嘌呤霉素进入核糖 体的 A 位点接纳新生肽，抑制蛋 白质翻译，在多肽与嘌呤霉素的 O- 甲基酪氨酸之间形成稳定的 酰胺键，生成肽酰嘌呤霉素复物， 而使mRNA3 ’端和蛋白质的羧基 端通过嘌呤霉素分子共价地联系 在一起。
DNA展示技术
mRNA体外展示又称mRNA- 蛋白质融合体 展示(mRNA-protein fusion display)，是 近年来发展的一种高效多肽选择技术。 它可以由大容量的多肽库中(1013 ~1015 个分子)获得具有特定生物学功能的多肽分子. 与噬菌体和核糖体展示技术相比，mRNA 体 外展示技术具有多肽库容量大、筛选方法简 便等优点，特别适用于获得小分子功能性多 肽
分子生物学常用实验方法原理介绍
分子生物学常用实验方法原理介绍一、GST pull-down实验基本原理:将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。
此方法简单易行,操作方便。
注：GST即谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)二、足印法（Footprinting）足印法（Footprinting）是一种用来测定DNA-蛋白质专一性结合的方法，用于检测目的DNA序列与特定蛋白质的结合，也可展示蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合。
其原理为：DNA和蛋白质结合后，DNA与蛋白的结合区域不能被DNase（脱氧核糖核酸酶）分解，在对目的DNA 序列进行检测时便出现了一段无DNA序列的空白区(即蛋白质结合区)，从而了解与蛋白质结合部位的核苷酸数目及其核苷酸序列。
三、染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具，利用该技术不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰以及转录因子与基因表达的关系。
染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA 片段沉淀下来。
染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化及鉴定。
四、基因芯片（又称 DNA 芯片、生物芯片）技术基因芯片指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。
蛋白质体外表达与进化技术
［８］ＪｏｏｂｅｕｒＴｅｔａｌ．Ｐｌａｎｔ，２００４，３９（３）：２８３—２９７［９］ＦｅｕｉｌｌｅｔＣｅｔａｌ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２００３，１００（２５）：１５２５３—１５２５８［１０］ＴａｎｋｓｌｅｙＳＤｅｔａｌ．ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ，１９９５，１１（２）：６３—６８［１１］ＳｃｈｗａｒｔｚＤＣｅｔａｌ．Ｃｅｌｌ，１９８４，３７：６７—７５［１２］王永军等．遗传学报，２００４，３１（１）：８７—９０［１３］杨立春等．中国农业科学，２００４，３７（１）：６５—７１［１４］ＭａｄｓｅｎＬＨｅｔａｌ．ＭｏｌＧｅｎｅｔＧｅｎｏｍｉｃｓ，２００３，２６９：１５０—１６１文章编号：１０００－１３３６（２００５）０４－０３３３－０３蛋白质体外表达与进化技术王长松刘友生陈燕平１（第三军医大学西南医院病理学研究所，重庆４０００３８；１西南医院国际合作实验室，重庆４０００３８）摘要：蛋白质体外表达与进化技术包括核糖体展示技术和ｍＲＮＡ展示技术。
与蛋白质体内表达系统相比，体外表达技术可产生较大容量的蛋白质文库（约１０１２～１０１３左右），同时在回收编码蛋白质的信息时对文库进行了进化，增加了蛋白质文库的多样性，促进了抗体或配体类蛋白质的亲和成熟能力。
该文介绍了蛋白质体外表达技术在新蛋白质（如抗体或配体等）表达筛选中的应用。
关键词：蛋白质体外表达；核糖体展示；ｍＲＮＡ展示；进化中图分类号：Ｑ５１；Ｑ８１６———————————收稿日期：２００５－０５－１６国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ．３０２７１３４２）作者简介：王长松（１９７２—），男，博士，主治医师，Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｏｌｄｅｎｆｉｎｇｅｒ８５０１２４＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ；刘友生（１９５５—），男，博士，教授，博士生导师，联系作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｏｕｓｈｅｎｇｌｉｕ６６０＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ从２０世纪８０年代至今，产生了多种筛选肽或蛋白质文库的新技术，这些技术方法大多以表面展示来命名，如细胞表面展示、质粒展示和酵母双杂交系统等。
肿瘤分子预测诊断新技术及其进展
收稿日期:2005-03-24基金项目:国家自然基金重点项目(N o.30430720)作者简介:叶青海(1966-),男,江西丰城人,复旦大学中山医院副教授、副主任医师,主要从事肝癌外科临床与转移复发研究.肿瘤分子预测诊断新技术及其进展叶青海(复旦大学附属中山医院、肝癌研究所,上海200032)关键词:预测;肿瘤;DN A ;复发;核酸杂交;基因组;肿瘤标记,生物学;蛋白质类/遗传学中图分类号:Q 7;R 73 文献标识码:A 文章编号:1001-1692(2005)04-0286-04 恶性肿瘤是严重影响人类健康和生命的重大疾病,每年新发病1090万人,死亡670万人。
及早预测诊断肿瘤及其转移潜能是提高肿瘤治疗效果的关键。
几十年来,科研工作者从临床到基础对肿瘤的发生发展规律进行了深入细致的探索,肿瘤的预测诊断技术也得到了飞速发展,已从较早的组织细胞水平发展到分子水平。
特别是为适应人类基因组计划(Human Geno me Pro ject,H GP)的需要,近年先后涌现了一系列包括比较基因组杂交(com parative genomic hybridization ,CGH )、mRNA 差异展示技术(mRNA differential display )、基因表达系列分析技术(serial analysis of gene expression,SAGE)、基因芯片技术(genechips )以及蛋白质芯片技术(pro -tein chips )等在内的高新分子生物学和遗传学技术,肿瘤的分子诊断预测研究达到了一个前所未有的高水平。
并从传统的核酸印迹杂交技术如south-er n blotting 、no rthern blotting 及免疫组织化学技术等单因素研究模式逐步发展到全基因组(蛋白组)、多因素模式,因而具有更高的预测准确率和临床应用价值,已经成为近年肿瘤研究的热点之一。
下面就目前常用的一些肿瘤分子预测诊断新技术及其进展作一简单介绍。
09135蛋白质工程
《蛋白质工程》课程（09135）教学大纲一、课程基本信息课程中文名称：蛋白质工程课程代码：09135学分与学时：2学分38学时课程性质：专业选修授课对象：生物工程专业二、本课程教学目标与任务蛋白质工程是随着生物化学、分子生物学、结构生物学、晶体学和计算机技术等的迅猛发展而诞生的，也与基因组学、蛋白质组学、生物信息学等的发展密切相关，是融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域。
由于蛋白质工程学科的边缘性，所以本课程在介绍蛋白质基本内容的同时，兼顾学科发展动向，旨在使学生了解现代蛋白质工程理论的新进展并为相关学科提供知识和技术。
通过本课程的学习，使学生掌握蛋白质工程的基本理论、基础知识、主要研究方法和技术以及生物信息学和现代生物技术在蛋白质工程上的应用及典型研究实例，熟悉从事蛋白质工程的重要方法和途径。
努力培养学生具有科学思维方式、启发学生科学思维能力和勇于探索，善于思考、分析问题的能力，激发学生的学习热情，为未来的学习和工作奠定坚实的理论和实践基础。
三、学时安排四、课程教学内容与基本要求第一章绪论教学目的：使学生了解蛋白质工程的基本概况。
基本要求：理解掌握蛋白质工程研究内容和蛋白质工程设计的原理。
重点与难点：蛋白质工程的原理，蛋白质工程的程序和操作方法。
教学方法：课堂讲授为主。
主要内容：一、蛋白质工程的物质基础二、蛋白质工程的原理三、蛋白质工程的程序和操作方法四、蛋白质工程的产生与发展五、蛋白质工程的应用领域第二章蛋白质结构基础教学目的：使学生理解蛋白质的结构与功能及二者之间的关系，理解蛋白质多肽链的折叠方式。
基本要求：要求掌握蛋白质各个结构层次的组成、基本特点和维持结构的作用力、结构与功能的关系。
蛋白质的变性和复性、蛋白质的折叠以及分子伴侣和折叠酶在蛋白质折叠中的作用。
重点与难点：重点：蛋白质的结构与功能，蛋白质结构与功能的关系。
难点：多肽链的折叠。
mRNA展示技术
mRNA展示技术生物化学与生物物理进展ProgressinBiochemistryandBiophysics,2006,33(8):795-799PI;jI;3mRNA展示技术术张万巧王建贺福初"(北京放射与辐射医学研究所,北京100850)摘要mRNA展示技术是一种新兴的体外筛选多肽和蛋白质的有力工具.在筛选过程中,mRNA与其编码的多肽或蛋白质共价结合,形成mRNA一蛋白质融合体,能在大容量的多肽文库0o"～lO5)中筛选具有特定生物学功能的多肽和蛋白质.目前,mRNA展示技术主要应用于各种靶分子的多肽和蛋白质适体的发现以及蛋白质相互作用机制的阐明和分析.由于其自身的巨大发展潜力,mRNA展示技术具有更为广阔的应用前景.关键词体外展示技术,mRNA展示技术,mRNA.蛋白质融合体学科分类号Q331伴随着后基因组时代的来临,对核酸,多肽和蛋白质等生物学大分子的功能和相互作用的研究,逐渐成为生命科学界研究的主流.在过去的10年中,展示技术已经成为多肽和蛋白质配体发现和体内相互作用研究方面的基本工具.展示技术可以分为体内展示技术和体外展示技术两类.体内展示技术有噬菌体展示技术和酵母双杂交技术,体外展示技术有核糖体展示技术,mRNA展示技术和DNA展示技术等.作为体内展示技术,噬菌体展示技术主要运用在发现新的多肽和蛋白质适体上,而酵母双杂交技术则主要运用在体内蛋白质相互作用分析上,它们都在各自的应用中发挥着巨大的功效.但它们在实验过程中都不可避免地需要一个体内步骤,因而有了某些应用上的限制.在噬菌体展示技术中,由于在构建文库和筛选时都涉及到细胞转染,文库容量受转染效率的影响被限制在109～10m,降低了文库筛选效率.类似的,酵母双杂交实验需要将文库引入到酵母中,把文库容量限制在l0～10.另外,在双杂交系统中所检测的相互作用必须发生在核内,限制了对结合强度,适合的结合作用和对生化条件的控制.而且相互作用的蛋白质对酵母细胞有毒性的也得不到检测,产生大量假阴性结果.新兴的体外展示技术(invitrodisplay),如核糖体和mRNA展示技术,就克服了体内筛选技术的许多限制.由于完全不依赖细胞,没有转染步骤, 减少了因表达差异而产生的偏性,文库的多样性和筛选效率得到了极大提高,其正常产生的文库容量都超过101,显示出诱人的应用前景.目前,体外展示技术已成为可用于分离具有特定化学或生化特性的多肽和蛋白质的最好方法.关于体外展示技术的研究也是当前研究的热点之一.1mRNA展示技术的原理及优势1.1mRNA展示技术mRNA体外展示技术又称为mRNA一蛋白质融合体展示技术,是一种新兴的体外多肽筛选技术.可以运用于生物分子配体的发现和相互作用分析. 其基本方法是:化学合成编码多肽库的DNA库,并对DNA进行特殊加工,在5端添加T7聚合酶启动子,翻译增强子,翻译起始密码子等序列;在3端添加亲和纯化标签.在体外利用T7RNA聚合酶将DNA转录成RNA,把RNA的3端和带有嘌呤霉素的连接子结合,带有嘌呤霉素连接子的诱饵RNA和RNA文库在无细胞系翻译体系中共翻译,通过嘌呤霉素的作用,mRNA与其所翻译的蛋白质结合起来形成mRNA一蛋白质融合体.从而实现国家高技术研究发展计划(2002-BA711A11,2004-BA711A19),北京市科技计划资助项目(H030230280920)."通讯联系人.Tel*************—1304.E-mail:********************.cn收稿日期:2006.03.30,接受日期:2006.04-29张万巧等:mRNA展示技术?797?(b)5mRNA一蛋白质融合体Fig.3ProposedmechanismforRNA.peptidefusion formationontheribosome【图3mRNA.蛋白质融合体形成机制【lJ(a)核糖体以mRNA为模板起始蛋白质的合成,核糖体向mRNA的末端(3端)转移.(b)核糖体到达RNA开放阅读框的末端时,翻译在RNA/DNA结合处停止.嘌呤霉素进入核糖体的A位点并与新生多肽结合.(c)通过亲和色谱法纯化得到的mRNA一蛋白质融合体.2mRNA展示技术的发展早在1997年,就有关于mRNA展示技术的最原始报道文章【-2],通过几年的研究改进,2000~2001年间达到实验体系的最优化【～.成熟的mRNA展示体系能完成对容量>10u文库的筛选.正常情况下,输入mRNA模板的10%～40%能形成融合产物,每毫升翻译反应物可包含>5x10tmRNA一蛋白质融合分子[51.由于mRNA一蛋白质融合体的形成率和稳定性是影响mRNA展示效率的关键因素,对mRNA展示技术的改进主要围绕连接子(1inker)的改造展开. mRNA与嘌呤霉素的结合方法有:利用固相支持物CPG(controlledporeglass)的夹板结合,光交联结合和单链酶连结合.每种结合方式都有各自不同的连接子.在夹板结合中,嘌呤霉素和CPG固相支持物连接形成CPG一嘌呤霉素,用以合成3端带有嘌呤霉素的寡聚脱氧核苷酸连接子【u.此DNA连接子上有核糖体翻译中止序列,使嘌呤霉素有时间进入核糖体的A位点.而在光交联结合中,带有补骨脂素部分的DNA连接子直接通过光交联反应与mRNA末端杂交【.前两种方法都因为有杂交的DNA双链序列而影响了mRNA3端的稳定性.最新改进的方法——单链酶结合法就是将以前的DNA单链连接子换成了聚乙二烯连接子,通过聚乙二烯连接子上带有的荧光素,在T4RNA连接酶作用下使连接子与RNA结合,大大提高了mRNA的稳定性,增加了mRNA一蛋白质融合体的合成效率[9].mRNA展示技术的另一项改进是将反转录步骤统一安排在融合体纯化和体外筛选之间.这是因为:a.反转录形成的cDNA/mRNA的杂交双链,避免了RNA二级,三级结构对体外筛选的干扰;b.筛选之后mRNA模板量大大减少,仅为筛选前的1%,不足以进行有效的反转录反应【7】.3mRNA展示技术的应用mRNA展示技术主要应用于发现RNA,小分子,蛋白质等新的蛋白质配体和阐明蛋白质与药物在细胞中的相互作用机制.其他可能的特殊运用有自组装蛋白质芯片,非天然氨基酸的文库构建和多肽的化学修饰.3.1通过mRNA展示技术发现新的配体当前利用mRNA展示筛选新的具有指定特征的多肽或蛋白质的方法已经相当完备,与RNA,小分子和蛋白质结合的序列都能得到分离.经筛选到的适体亲和力强,特异性高.在RNA适体的筛选中,现在已能完成对容量>9x10的初始文库的筛选.被筛选到的多肽都与RNA以高亲和力结合(=0.5～5.0nmol/L)且大部分被证明与野生型序列相比有相当或更高的特异性【Ⅻ.Keefe和Szostakt"】通过对ATP结合蛋白质的筛选来分离与生命产生前的远古蛋白同源的现代蛋白质.他们利用mRNA展示技术,能筛到与ATP以高亲和力d=100nmol/L)结合,并能以2000倍的特异性从其他核苷三磷酸盐中将ATP识别出来的克隆.估计其筛选比例能达到1/10t2,几乎与结合ATP的RNA的筛选相当.Roberts实验室【I2】利用mJ~NA展示筛选G蛋白调控因子,筛到的蛋白质除具有上述特点外,还表现出与G蛋白调控(GPR)模序高度保守位点的差异,显示了调控机制的复杂性.3.2利用mRNA展示技术进行特异性和相互作用分析mRNA展示技术也被用来进行包含已知抗原决定簇序列的筛选.Baggio等【u】利用两个随机文库798?生物化学与生物物理进展Prog.Biochem.Biophys. 来研究与c-myc抗体(9El0)和牛胰岛素结合的多肽的特异性.mRNA展示文库由eDNA文库转录而来,使mRNA展示技术具有分离生物学相关的相互作用对的潜力.Hammond实验室【-4]利用随机引物从几个不同的人类组织中构建mRNA展示文库,这种方法产生的文库含有多种不同长度的序列.通过对抗凋亡蛋白Bc1.XL的筛选,分离了多于2O个的不同蛋白质,包括已知的相互作用蛋白质,Bim,Bax和BCL2L12.细胞文库还可以用作发现与感兴趣的药物相互作用的蛋白质或受体. McPherson等【.5】用免疫抑制药物FK506作为细胞文库的靶标来进行筛选,结果分离到了已知的相互作用蛋白FKBP,并定义了FKBP与FK506相互作用所必需的区域.最近,日本Y anagawa实验室又研究出一项mRNA展示的新应用,利用mRNA展示技术筛选DNA绑定蛋白,用以分析DNA和蛋白质的相互作用.因为转录因子几乎都与DNA结合形成异源二聚体,此项新应用在转录因子复合体的筛选上将大有所为【.3.3mRNA展示技术的一些特殊应用把mRNA展示技术中的mRNA.蛋白质融合体运用到高通量筛选技术蛋白质芯片技术中,形成了一门新技术——自组装蛋白质芯片技术.其原理是,利用标准的DNA芯片上的DNA序列,通过碱基互补配对作用与mRNA.蛋白质融合体上的RNA杂交,从而将DNA芯片转换成蛋白质芯片【.另一特殊应用是建立包含非天然氨基酸残基的mRNA展示文库【旧.含有体内步骤的体内展示技术,如噬菌体展示和酵母双杂交技术只能利用2O种天然氨基酸形成展示蛋白质.mRNA展示技术不依赖活体细胞,再结合提供非天然氨基酸的tRNA抑制物技术或通过四基密码子(four-basecodon)介导就能成功构建包含非天然氨基酸的文库,大大增加了展示文库的化学复杂性,使得发现高亲和力,高特异性,高稳定性的配体分子更为容易【.4总结与展望目前,mRNA展示技术已经相当成熟,以其自身的优势从各种展示技术中脱颖而出,成为体外蛋白质筛选和定向进化的有力工具,并在多个研究方面得到运用.通过mRNA展示技术筛选到的分子能够成为控制和了解生物学过程的工具,增加了对分子间相互作用和潜在疾病治疗机制的了解.可以想象在不远的将来体外展示技术将在生物技术,医药卫生和蛋白质组学等多个方面得到更广泛的应用.mRNA体外展示技术还是一项不断发展的技术,如何进一步增加mRNA.蛋白质融合体的稳定性,使mRNA在体外翻译系统中的降解达到最小;如何进一步提高mRNA.蛋白质融合体的生成效率,以提供更大容量的文库和简化翻译后修饰的过程,都是未来的主要研究方向,如何将该技术标准化自动化以在更多的领域进行推广也是亟待解决的问题.参考文献lRobertsRW,SzostakJW.RNA—peptidefusionsfortheinvitro selectionofpeptidesandproteins.ProcNatlAcadSciUSA,1997,94(23):12297123022NemotoN,MJyamoto—SatoE.Invitrovirus:bondingofmRNA bearingpuromycinatthe3'-terminalendtotheC-terminalendofits encodedproteinontheribosomeinvitro.FEBSLett,1997,414(2): 405～4083HammondPW,AlpinJ,RiseCE,et.Invitroselectionand characterizationofBcl—XL-bindingproteinsfromamixof tissue—specificmRNAdisplaylibraries.JBiolChem,2001,276(24): 20898～209064StarckS1LRobertsRW.Puromycinoligonucleotidesrevealsteric restrictionsforribosomeentryandmultipllemodesoftransl撕on inhibition.RNA,2002,8(7):890~9035TakahashiTT,AustinRJ,RobertsRW.mRNAdisplay:ligand discovery,interactionanalysisandbeyond.TrendsBiochcmSci, 2003,28(3):l59～1656SchaffitzclC,HanesJ.Ribosomedisplay:aninvitromethodfor selectionandevolutionofantibodiesfromlibraries.JImmunol Methods,1999,23l(1～2):ll9～1357BarrickJE,TakahashiTT.SelectionofRNA-bindingpeptides usingmRNA-peptidefusions.Methods,2001,23(3):287~2938KurzM,GuLohsePA.Psoralenphoto?crosslinkcdtuRNA-puromycinconjugates:anoveltemplatefortherapidand faeriepreparationofmRNA-proteinfusions.NucleicAcidsRes, 2000,28(18):e839HorisawakTateyarnaS,IshizakaM.Inv/froselectionof Jun—associatedproteinsusingmRNAdisplay.NucleicAcidsRes, 2004,32(21):e16910BarrickJE,TakahashiTT'RcnJ,rgelibrariesrevealdiversesolutionstoanRNArecognitionproblem.ProcNatlAcad SciUsA,2ool,98(22):l2374～12378llKeefeAD.SzostakJW.Functionalproteinsfromarandom—sequencelibrary.Nature,2001,410(6829):7l5～7l8l2JaWW.RobertsRW.Invitroselectionofstate?specificpeptide modulatorsofGproteinsignalingusingmRNAdisplay. Biochemistry,2004,43(28):9265~927513BagSioBurgstallerP,HaleSP,et.Identificationofepitope—like consensusmotifsusingmRNAdisplay.JMolRecognit,2002,152006;33(8)张万巧等:mRNA展示技术?799?(3):126～13414HammondPW,AlpinJ,RiseCE,eto1.Invitroselectionand characterizationofBcl—X(L)一bindingproteinsfromamixof tissue—specificmRNAdisplaylibraries.JBiolChem,2001,276(24): 20898～2090615McPhersonM,Y angY,HammondPW,eto1.Drugreceptor identificationfrommultipletissueusingcellular—derivedmRNA displaylibraries.ChemBiol,2002,9(6):691～69816TateyamaS,HorisawakTakashimaH,eto1.Affufityselectionof DNA—bindingproteincomplexesusingmRNAdisplay.Nucleic AcidsRes,2006,34(3):e27l7WengS,GuHammondPW,eto1.Generatingaddressahleprotein microarrayswithPROfusioneCOV alentmRNA—proteinfusion technology.Proteomics,2002,2(1):48~57l8LiS,MillwardS,RobertsRW,eto1.InvitroselectionofmRNA displaycontaininganunnaturalaminoacid.JAmChemSoc,2002, 124(34):9972~9973l9MuranakaN.HohsakaT,SisidoM.Four-basecodonmediated mRNAdisplaytoconstructpeptidelibrariesthatcontainmultiplenonnaturalalninoacids.NucleicAcidsRes,2006,34(1):e7 mRNADisplayTechnologyZHANGWan—Qiao,WANGJian,HEFu—Chu'' (BeijingInstituteofRadiationMedicine,Beo'ing100850,China) AbstractmRNAdisplayprovidesanewpowerfultoolforinvitroselectingofpeptidesandprot eins.Intheselectingprocess,peptidesarecovalentlyattachedtotheirownrnRNAtoformrnRNA—proteinfusions.ThesemRNA—proteinfusionsenableinvitroselectionofpeptideandproteinlibrariesofmorethan10differe ntsequences.Theexperimentconditionsandprotocolshavebeenoptimizedinrecentyears.The applicationof mRNAdisplaytechnologyismainlyinthediscoveryofligandsformanykindsoftargetmolec ulesandtheanalysis andmechanismelucidationoninteractionbetweenproteins.Withitsgreatpotential,therewil lbeawideapplicationforegroundintheapplicationofmRNAdisplay. Keywordsinvitrodisplaytechnology,rnRNAdisplaytechnology,rnRNA—proteinfusion 'ThisworkwassupportedbygrantsfromHi—TechResearchandDevelopmentProgramofChina(2002一BA71lAl1,2004一BA71lAl9),ScienceandTechnologyProgramofBeijing(H030230280920).''Correspondingauthor.Tel:86—10—80727777—1304.E—mail:********************.cnReceived:March30,2006Accepted:April29,2006。
蛋白质的修饰和表达
影响化学修饰旳主要原因有两方面：
1、蛋白质功能基旳活性反应，涉及基团之 间旳氢键和静电作用等，基团之间旳旳空 间阻力。
2、修饰剂旳反应活性。
一、蛋白质侧链旳化学修饰
在20种天然氨基酸旳侧链中，大约有二分之一能够在足够 温和旳条件下产生化学取代而不使肽键受损，其中氨基、 巯基和羧基尤其轻易产生有用旳取代。
（一）亲和标识
亲和标识是一类位点专一性旳化学修饰， 试剂能够专一性标识于酶旳活性部位上， 使酶不可逆旳失活，所以又称为专一性旳 不可逆克制作用。
此类克制剂可分为两类：
一类是Ks型旳不可逆克制剂，它是根据底 物旳构造设计旳，它具有和底物构造相同 旳结合集团，同步还具有和活性部位氨基 酸残基旳侧链基团反应旳活性基团。
蛋白质旳化学偶联是指将蛋白质分子偶联 到一种化学惰性旳水不溶性载体上，形成 固定化蛋白质。
蛋白质分子旳固定化
蛋白质分子旳固定主要是酶分子旳固定。 酶旳固定化，使用固体材料将酶束缚或限制于一
定区域内，酶仍能进行其特有旳催化反应，并可 回收及反复使用旳一类技术。 优点：1、既能保持酶旳活性又能克服游离酶旳某 些不足，提升酶分子旳稳定性。 2、能与产物分开，有效地控制生产过程 3、能与产物分开，可省去热处理使酶失活旳环节， 简化生产工艺 4、酶可在生产中反复利用，提升了酶旳利用率。
氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子 互换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交 联。4）载体交联法：用多功能试剂旳一部 分功能基团化学修饰高聚物载体，而其中 旳另一部分功能集团偶联酶蛋白。
2、共价结正当
是酶蛋白分子上功能团和固定支持物表面 上旳反应基团之间形成化学共价键连接， 以固定酶旳措施。
常用载体为：天然高分子（纤维素、琼脂 糖、淀粉等），合成高聚物（尼龙、多聚 氨基酸），无机支持物（多孔玻璃）
生物大分子进化总结
9.4.4 DNA改组
DNA Shuffling
是运用随机突变技术，对某种感兴趣的蛋 门质或核酸进行快速的改造，并定向选择所需 性质的生物分子。
原理
1. 单个基因或一组相关基因经酶切产生一系列随 机大小的DNA片段。
2. 无引物PCR，具有互补3’末端的片段互为引物， 各为模板，通过不断的PCR循环在不同模板上 随机互补结合并进一步延伸。
（2）抗水解多肽
思路：D型多肽不容易被天然的水解酶水解。
过程： ① 先合成L型水解酶，建立多肽； ② 进化得到目标多肽； ③ 与D型水解酶作用，验证效果。
9.8.3 核酸适配体的应用
核酸适配体由单链DNA或RNA组成，形成一定 的二级结构，可以特异识别某种分子。
适体库能识别分子，包括蛋白质、核酸、脂类、 细胞、小分子。
突变
Pool of mutant genes
转化宿主菌
重复
筛选单一突变基因的克隆
好的突变进行下一轮突变
突变的优良基因
9.8 生物大分子进化应用实例
9.8.1 自然改进型分子进化
（1） 绿色荧光蛋白
2008年诺贝尔奖
钱永健
下村修
钱永健
1994年，开始改造GFP，有多项发现。世界 上用的大多数是钱永健实验室改造后的变种， 有的荧光更强，有的黄色、蓝色，有的可激活、 可变色。
第9章
生物大分子进化
内容
1 自然界生物大分子进化
2
生物大分子进化方法
3 生物大分子进化的概念和思路
4
分子多样性的建立
5
分子库的放大
6 标记和区分蛋白质分子
7
挑选和筛选
8
应用实例
9.1 自然界的生物大分子进化
蛋白质定向进化技术
蛋白质定向进化技术
DE始于上世纪70年代，最早的一个例子是进化一 DE始于上世纪70年代，最早的一个例子是进化一 个来源于大肠杆菌的 E b g A蛋白， 这个酶几乎 A蛋白， 不具备 β-半乳糖苷酶的活性。通过以乳糖为单一 碳源的平板上筛选 L a c- 缺失的大肠菌株 ，野生 c型的 E b g A就进化成为了具有 β- 半乳糖苷酶活 A就进化成为了具有 性的酶。
蛋白质定向进化技术 （DE technology of Protein）
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蛋白质定向进化技术
★定义（definition） 定义（definition） ★原理（theory） 原理（theory） ★显著特征（marked features） 显著特征（mar法（methods） ★筛选方法（screening technique） 选方法（ technique） ★应用及展望（application and prospects） 应用及展望（application prospects）
蛋白质定向进化技术
频率太高，产生的绝大多数酶将失去活性；太低 ， 野生型的背景太高，样品的多样性则较少。对于 每一 D N A序列来说，合理的碱基突变数是 1-3 。 A序列来说，合理的碱基突变数是 理想的碱基置换率和易错P R的最佳条件则依赖 理想的碱基置换率和易错P C R的最佳条件则依赖 于随机突变的目标 D N A片段的长度。 A片段的长度。
蛋白质定向进化技术
当 D N A s h u f f l i n g用来重组一套进化上相 g用来重组一套进化上相 关的基因时 ，又被称为 f ami l y s h u f f l i n g 。 N I 等用 family shuffling对同源性为 7 8 . 5 ％ shuffling对同源性为 -9 6 ％ 4种白蚁的 3 O--3 O 倍。
生物技术名词解释
生物技术：是以生命科学为基础，利用生物体的特性和功能，设计构建有预期性状的新产品，与工程结合，对这些新产品加工的技术体系。
生物技术制药：采用现代生物技术，借助某些微生物、植物、动物生产医药品。
生物药物：是指采用生物学、医学、生物化学等研究成果，从生物体、生物组织、细胞、体液等，综合利用物理学、化学、生物化学、生物技术、药学等学科的原理和方法制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。
生物技术药物：采用DNA重组技术或其他生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物。
逆转录法：是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成c DNA，然后进行cD NA的克隆表达。
结果不稳定：外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。
分裂不稳定（质粒逃逸）：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。
（质粒不稳定（逃逸率）：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的工程菌现象。
）是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法单克隆抗体：及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。
克隆化：是指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程。
人鼠嵌合抗体：在基因水平上将鼠源单抗的H和L链可变区基因分离出来，分别与人Ig 的H 和L链的稳定区（C）基因连接成人-鼠嵌合抗体的H和L链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达完整人-鼠嵌合抗体。
双功能抗体：又称双特性抗体，是一种非天然性抗体。
其结合抗原的两个臂具有不同的特异性。
原代培养：是指直接从有机体获得的组织或将其分散成细胞后开始的培养。
接触抑制现象：多数二倍体细胞均需基质贴附，每个细胞与其周围细胞相互接触时，细胞就停止生长，若有充足营养，细胞仍可存活一段时间，但数量不增加。
mrna药物开发工艺流程gmp
mrna药物开发工艺流程gmpmRNA（messenger RNA，信使RNA）药物是一种新兴的生物技术药物，具有潜在的治疗和预防疾病的能力。
目前，mRNA药物已获得了广泛的关注，并在多个领域展示了巨大的治疗潜力，包括癌症、传染病、遗传病等。
要进行mRNA药物的开发，需要遵循一系列的工艺流程，以确保药物的质量和效力。
首先，从目标疾病或病毒中提取RNA序列，并在实验室中对其进行序列和结构分析。
这有助于了解目标RNA的特性和功能，为后续的药物设计和优化提供指导。
接下来，需要设计和构建mRNA药物的模板序列。
这涉及选择合适的启动子、转录终止信号和信使RNA编码序列，以及调控序列等。
设计合理的模板序列可以提高mRNA的稳定性和表达效率。
然后，通过体外转录（in vitro transcription）技术合成mRNA药物。
这通常涉及将模板DNA通过RNA聚合酶的作用转录成mRNA。
在此过程中，可以通过加入适当的辅助剂（如带正电的聚合物）来提高转录效率和产量，并通过增加RNA的修饰（如帽子、带尾巴的结构等）来提高mRNA的稳定性。
接着，对合成的mRNA进行纯化和质量控制。
纯化通常使用凝胶电泳或液相层析等方法进行，以去除杂质和未反应的试剂。
同时，可以通过毛细管电泳、质谱等技术对mRNA样品进行质量和纯度的评估。
经过质量控制后，mRNA药物需要进行适当的调剂和稳定化处理。
这通常涉及将mRNA与适合注射给药的载体结合，如脂质纳米颗粒（lipidnanoparticles）或聚合物。
这些载体可以保护mRNA免受降解，并促进其在体内的转染和表达。
最后，通过严格的质量控制和安全评估，获得符合GMP（Good Manufacturing Practice，良好生产规范）标准的mRNA药物。
GMP规范要求药物的生产过程严格符合一系列的规范和标准，以确保产品的质量、安全和一致性。
这包括从原材料的选择和采购，到生产工艺的执行和记录，再到最终药物的包装和存储等环节。
蛋白质工程(整合版)1
蛋白质工程考试题型：英翻中10题共10分填空20题共20分判断15题共15分单选30题或20题共30分简答5题共25分部分简答题和英翻中的范围：1、第一章第一节——第三节考1题简答题、还会考英翻中2、第三章第三届考1题简答题3、第六章英翻中4、第七章第四节第五节每一节考一题简答题5、第九章考英翻中第三节考一道简答题6、第十章考英翻中第一章蛋白质分类：纤维状蛋白质(胶原、角蛋白) 球状蛋白质（酶类）膜蛋白（膜内、膜锚定蛋白）蛋白质功能：调节信息传递支架作用防御与进攻其他特定功能催化结构成分贮存运动转运氨基酸多肽链名称：丙氨酸Ala A 甲硫氨酸MetM 半胱氨酸CysC天门冬酰胺AsnN天门冬氨酸 Asp D 脯氨酸Pro P 谷氨酸Glu E 谷氨酰胺Gln Q 苯丙氨酸PheF精氨酸Arg R 甘氨酸Gly G 丝氨酸Ser S 组氨酸His H 苏氨酸Thr T 异亮氨酸Ile I 缬氨酸Val V 赖氨酸Lys K 色氨酸Trp W非蛋白质氨基酸在哪出现目前认为有些非蛋白质氨基酸是某些代谢过程的中间产物或重要代谢物的前体。
如：瓜氨酸和鸟氨酸——精氨酸前体刀豆氨酸和5—羟基色氨酸——杀虫杀菌。
多巴胺——神经递质构象与构型的区别：构型：一个分子中各原子的特定空间排布。
当一种构型改变为另一种构型时必须有共价键的断裂和重新形成，最基本的分子构型是L-型和D-型。
构象（conformation）是组成分子的原子或基团绕单键旋转而形成的不同空间排布。
一种构象转变为另一种构象，不会有共价键的断裂与形成。
氨基酸的分类a.按照R基的化学结构进行分类：脂肪族（①中性氨基酸、②含羟基或硫氨基酸、③酸性氨基酸及其酰胺、④碱性氨基酸）、芳香族和杂环族氨基酸3类；b.按照R基的极性性质进行分类：疏水氨基酸（非极性R基氨基酸）；不带电的极性R基氨基酸；带正电的R基氨基酸；带负电的R基氨基酸。
c.非天然蛋白质氨基酸肽：肽是氨基酸的线性聚合物，也称为肽链（peptide chain）肽键：氨基酸同时含有氨基和羧基，他们能以首尾相连的方式进行缩合反应，一个氨基酸的α-NH2与另一个氨基酸的α-COOH缩合脱去一份子水，可以形成一个共价酰胺键或称肽键。
mRNA疫苗的原理及应用
mRNA疫苗的原理及应用1. 引言mRNA疫苗是一种新型的疫苗技术，它利用人类的自身细胞来生产病毒特定蛋白质的方法，从而激发人体的免疫反应，以达到预防疾病的目的。
本文将介绍mRNA疫苗的原理及其在疾病预防和治疗中的应用。
2. mRNA疫苗的原理mRNA疫苗主要通过以下步骤实现疫苗效果：2.1 mRNA的合成mRNA疫苗是通过合成人工mRNA来引导人体细胞合成特定的蛋白质。
合成过程中需要根据病毒的基因序列确定相应的mRNA序列。
2.2 mRNA的转染合成的mRNA通过封装成纳米粒子或带有特殊功能的脂质纳米粒子，并注射到人体内。
这些纳米粒子可以帮助mRNA顺利进入人体细胞。
2.3 mRNA的翻译一旦mRNA进入人体细胞，它会与细胞内的核糖体结合，通过翻译作用，将mRNA的信息转化为特定的蛋白质。
这些蛋白质可能是潜在病原体的一部分，也可能是疫苗中的重要成分。
2.4 免疫反应的激发合成的蛋白质将在人体细胞中被处理和呈递给免疫系统，引发免疫反应。
免疫系统将识别蛋白质，并生成相应的抗体和细胞免疫应答。
3. mRNA疫苗的应用mRNA疫苗在疾病预防和治疗中具有广泛的应用前景，主要包括以下方面：3.1 传染病的预防mRNA疫苗可以针对不同的传染病进行开发和应用，如新型冠状病毒、流感病毒等。
它可以通过激活免疫系统来预防病毒的感染和传播。
3.2 肿瘤治疗mRNA疫苗可以携带特定的肿瘤抗原信息，并通过激活免疫系统来识别和杀死肿瘤细胞。
这为肿瘤的个体化治疗提供了新的方法。
3.3 基因治疗mRNA疫苗可以用于基因治疗，通过输入特定的mRNA序列来修复或替代缺陷基因，从而治疗遗传性疾病。
3.4 疾病疫苗的快速开发相比传统疫苗技术，mRNA疫苗的开发速度更快。
它可以根据不同病原体的基因序列快速合成mRNA，并进行大规模生产。
这使得疫苗在新兴病原体大规模传播时具有更快的反应能力。
4. 结论mRNA疫苗是一种创新的疫苗技术，利用人体自身的细胞合成特定蛋白质来激发免疫反应。
核糖体展示技术
优点
• 作为一种体外展示技术，mRNA具有多 肽库容量大、筛选效率高、操作简便等 共同特点。反转录的cDNA/mRNA的杂交 双链，避免了RNA二级结构、三级结构 对体外筛选的干扰。
应用
• 主要应用于发现RNA、小分子、蛋白质 等新的蛋白质配体和阐明蛋白质与药物 在细胞中的相互作用机制。其他可能的 特殊技术主要有两类:
体内筛选技术，如噬菌体展示技术、选择性感 染噬菌体技术等。 体外筛选技术，如核糖体展示技术mRNA展示 技术
传统筛选技术的缺陷：
1必须经过细菌转化的步骤 2抗体库的容量不能超过1010 3而且在表达某些候选抗体分子时,大肠杆菌宿主 菌的生长被抑制或者由于其毒性作用而不能生长, 导致亲和筛选的偏差 4另外,亲和筛选时,具有极高亲和力的抗体分子与 抗原结合后,很难被洗脱,所以无法捕获其编码基 因。 5采用噬菌体展示技术进行抗体分子定向进化时, 除了以上各种限制之外,基因突变与表型筛选之间 的转换也很烦琐。
核糖体展示技术分类
• 1997年Pluckthun提出的以RNA-核糖体蛋白质三聚体形式的核糖体展示技术 • Roberts等设计的mRNA-多肽融合技术 • 2002年zhou JM等改进的核糖体失活展示 技术
核糖体展示技术的基本流程
First generation
mRNA-多肽融合技术的基本流程 Second generation
背景
研究证实： 体外翻译时,蛋白或多肽的折叠与翻译同步进行； 与核糖体结合的天然多肽也具有酶活性。 1997年, Pluckthun实验室在以上研究成果 的基础上,建立了体外筛选完整功能蛋白的新技术 ——核糖体展示技术。
核糖体筛选技术
定义：核糖体展示技术是一种筛选蛋白质强 有力的工具,通过将基因型和蛋白表型联系在 一起核 糖 体 展 示 技 术
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噬菌体展示技术(phage display) 酵母双杂交 与核糖体展示技术(ribosome display，RD) mRNA体外展示技术( mRNA display)
DNA展示技术
mRNA体外展示又称mRNA- 蛋白质融合体展示 (mRNA-protein fusion display) ，是近年来 发展的一种高效多肽选择技术。 它可以由大容量的多肽库中(1013 ~1015 个分子)获得具有特定生物学功能的多肽分子. 与噬菌体和核糖体展示技术相比，mRNA 体外 展示技术具有多肽库容量大、筛选方法简便 等优点，特别适用于获得小分子功能性多肽
基本原理：借助一种蛋白质合 成抑制剂嘌呤霉素(puromycin) 来形成mRNA- 蛋白质融合体，从 而实现基因表型 (RNA)与蛋白质 表型(多肽) 的结合. 嘌呤霉素 是一种模拟子的3’端，当 mRNA 翻译完成时，嘌呤霉素进入核糖 体的 A 位点接纳新生肽，抑制 蛋白质翻译，在多肽与嘌呤霉素 的 O- 甲基酪氨酸之间形成稳定 的酰胺键，生成肽酰嘌呤霉素复 物，而使mRNA3 ’端和蛋白质的羧 基端通过嘌呤霉素分子共价地联 系在一起。
体积25ul,其中含10xPCR缓冲液2.5 ul， 25
Streptavidin 琼脂糖凝胶载体上，然后加入 400ul
洗涤5~6遍后，加入洗脱液(无酵母 tRNA) 及
运用mRNA体外展示技术 筛选胸苷酸合成酶RNA亲和肽
应用：
CAT(Cambridge Antibody Technology) 应用体外展示技术制备单克隆抗体用于疾 病的治疗：
D2E7 ABT-874 CAT-192and GC1008
CAT-5001 (formerly SS1P)
目前应用的组合多肽/蛋白质库技术包括
人们已利用这种新的技术鉴定了许多功能性 多肽，包括 RNA 结合肽、TNF-α 结合因子 等，建立了以 mRNA 体外展示技术筛选与抗 肿瘤药物的重要靶酶———胸苷酸合成酶 mRNA高度亲和多肽的方法讨
Structure of mRNA-linker