蛋白质浓度测定方法..
蛋白浓度的测定方法
蛋白浓度的测定方法蛋白质是构成生物体的重要基本成分之一，对于研究生物学和医学具有重要意义。
因此，准确测定蛋白质的浓度对于科研工作具有重要意义。
本文将介绍几种常用的蛋白质浓度测定方法。
一、Lowry法Lowry法是一种经典的蛋白质浓度测定方法，该方法利用蛋白质与硫酸铜在碱性条件下发生络合反应，生成紫色复合物。
复合物的吸光度与蛋白质的浓度成正比，可通过比色法测定吸光度来计算蛋白质的浓度。
二、Bradford法Bradford法是一种常用的快速、灵敏的蛋白质浓度测定方法。
该方法利用蛋白质与染料吸附后的吸收光谱变化来测定蛋白质的浓度。
Bradford染料在酸性条件下与蛋白质发生络合反应，形成蓝色复合物，其吸光度与蛋白质的浓度成正比。
三、BCA法BCA法是一种常用的蛋白质浓度测定方法，该方法利用还原性物质与蛋白质中的蛋白质酸和蛋白质酰胺反应，生成紫色复合物。
复合物的吸光度与蛋白质的浓度成正比，可通过比色法测定吸光度来计算蛋白质的浓度。
四、Ninhydrin法Ninhydrin法是一种常用的蛋白质浓度测定方法，该方法利用蛋白质中的氨基酸与Ninhydrin反应，生成紫色复合物。
复合物的吸光度与蛋白质的浓度成正比，可通过比色法测定吸光度来计算蛋白质的浓度。
五、UV吸收法UV吸收法是一种常用的蛋白质浓度测定方法，该方法利用蛋白质中芳香族氨基酸（如酪氨酸和色氨酸）的吸收特性来测定蛋白质的浓度。
在特定波长下，蛋白质吸收的光强与蛋白质的浓度成正比，可通过比色法测定光强来计算蛋白质的浓度。
六、生物传感器法生物传感器法是一种新兴的蛋白质浓度测定方法，该方法利用生物传感器与蛋白质结合后的信号变化来测定蛋白质的浓度。
生物传感器可以是抗体、酶或其他与蛋白质结合的生物分子，通过测定生物传感器信号的变化来计算蛋白质的浓度。
蛋白质浓度的测定方法有很多种，每种方法都有其特点和适用范围。
在实际应用中，根据研究需要和实验条件的不同，可以选择合适的蛋白质浓度测定方法进行实验。
[指南]蛋白质浓度的测定方法总结
![[指南]蛋白质浓度的测定方法总结](https://img.taocdn.com/s3/m/9b0f826e30b765ce0508763231126edb6f1a7664.png)
一、蛋白浓度的直接测定（UV法）这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。
选择Warburg 公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。
蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。
从而显得结果很不稳定。
蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。
紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。
（1）简易经验公式蛋白质浓度(mg/ml) = [1.45*OD280-0.74*OD260 ] * Dilution factor（2）精确计算通过计算OD280/OD260的比值，然后查表得到校正因子F，再通过如下公式计算最终结果：蛋白质浓度(mg/ml) = F *(1/d) *OD 280 * D其中d为测定OD值比色杯的厚度D为溶液的稀释倍数二．紫外吸收法测定蛋白质含量0【实验目的】01. 学习紫外吸收法测定蛋白质含量的原理。
02. 掌握紫外分光光度计的操作方法。
0【实验原理】0大多数蛋白质分子结构中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）残基，使蛋白质在280nm的紫外光区产生最大吸收，并且这一波长范围内的吸收值与蛋白质浓度的成正比，利用这一特性可定量测定蛋白质的含量。
0紫外吸收法可测定0.1-0.5mg/ml的蛋白质溶液，此操作简便，测定迅速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。
因此，此法在蛋白质的制备中广泛应用。
0【实验材料】01.实验器材0试管及试管架；50毫升容量瓶 2只；移液管；紫外分光光度计。
02.实验试剂0(1)标准蛋白质溶液：精确配制2mg／ml的酪蛋白溶液。
0(2)样品溶液：配制约0.5mg/ml的酪蛋白溶液作为未知样品溶液。
0【实验操作】01. 绘制标准曲线0取7支试管按下列各表加入各试剂：0二、比色法蛋白浓度测定蛋白质通常是多种蛋白质的化合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸（如酪氨酸，丝氨酸）与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。
蛋白质浓度测定-Bradford
蛋白质浓度测定—Bradford法一、实验目的学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度。
二、实验原理考马斯亮蓝能也与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。
考马斯亮蓝G250的磷酸盐呈棕红色，最大吸收峰在465nm。
当它与蛋白质结合形成复合物时呈兰色，其最大吸收峰改变为595nm。
考马斯亮蓝G250在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。
（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液，用g―球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。
（2）考马斯亮兰G―250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G―250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。
2. 器材：（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）试管16支三、操作方法1.标准曲线制作（按下表0-11管操作，每管做3个平行）0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100标准蛋白含量( g)0 0．1 0．2 0．3 0．4 0．5 0．6 0．7 0．8 0．9 1．0标准蛋白溶液（0.1mg/mL）(mL)0．1 0．2 0．3 待测蛋白质溶液(mL)2 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 1.9 1.8 1.7 蒸馏水(mL)2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2考马斯亮蓝试剂摇匀，1 h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色OD595nm以OD595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
2. 未知样品蛋白质浓度的测定测定方法同上（上表11-13管），将未知待测样品做一定的稀释（鸡血清1：100稀释；羊血清1：200稀释；肝匀浆1：100稀释），使其测定值在标准曲线的直线范围内，每管做3 个平行。
测量蛋白质浓度的方法
测量蛋白质浓度的方法
测量蛋白质浓度的方法有多种。
最常用的方法是使用分光光度计。
该方法基于比色法，通过测量溶液的吸光度来确定蛋白质的浓度。
在使用分光光度计时，需要先准备好标准曲线。
标准曲线是一条由一系列已知浓度的蛋白质样品构成的曲线，通过测量这些样品的吸光度，建立一条蛋白质浓度与吸光度之间的标准曲线。
然后，通过测量待测样品的吸光度，并利用标准曲线来计算出待测样品中蛋白质的浓度。
除了分光光度计，还有其他一些方法也可用于测量蛋白质浓度。
例如，比色法也可以使用比色计来进行测量。
比色计是一种手持式仪器，可以通过测量样品的颜色来确定样品中蛋白质的浓度。
此外，生物素化法、BCA法、Lowry法等也是常
用的测量蛋白质浓度的方法。
生物素化法是利用生物素和亲和素之间的结合来测量蛋白质浓度。
该方法需要将生物素标记在蛋白质上，然后将标记后的蛋白质与亲和素结合，再使用酶标仪
来测量复合物的吸光度。
BCA法是一种比色法，可以用来测量蛋白质浓度和确定蛋白质含量。
该方法
基于蛋白质与铜离子的还原反应，将蛋白质中的含氮化合物还原为双胍类化合物，并与试剂中的铜离子发生化学反应，生成紫色物质。
这种紫色物质的颜色与蛋白
质浓度成正比。
Lowry法也是一种比色法，可以用于测量蛋白质浓度。
该方法使用硫酸铜和碱
性草酸钠来形成一种复合物，该复合物可以与蛋白质中的含氮化合物发生化学反应，形成一种蓝色化合物。
这种蓝色化合物的吸光度与蛋白质浓度成正比。
蛋白浓度测定方法
蛋白浓度测定方法引言：蛋白质是生物体内广泛存在的一类重要有机分子，其浓度的准确测定对于生物研究和医学诊断具有重要意义。
本文将介绍几种常用的蛋白浓度测定方法，包括比色法、BCA法、Lowry法和Bradford 法，并对其原理、步骤和应用进行详细说明。
一、比色法：比色法是一种常用的蛋白浓度测定方法，基于蛋白质与某些特定试剂反应产生颜色变化的原理。
常用的试剂有布拉德福试剂、科学试剂等。
该方法操作简便，结果准确可靠，广泛应用于蛋白质研究领域。
1. 原理：比色法的原理是蛋白质与某些试剂反应产生可测量的颜色变化，根据颜色的强度可以推算出蛋白质的浓度。
这种反应通常是由于蛋白质中存在的特定官能团与试剂之间的化学反应导致的。
2. 步骤：比色法的步骤主要包括样品制备、试剂配制、反应和测量。
首先，将待测样品制备成适当浓度的溶液；然后，配制试剂，并与样品混合反应；最后，使用光谱仪或分光光度计测量反应产生的颜色的光吸收值，并根据标准曲线推算出蛋白质的浓度。
3. 应用：比色法广泛应用于生物化学、分子生物学、药学等领域。
例如，可以用于蛋白质表达水平的测定、蛋白质纯化过程中的监测以及药物研发过程中的蛋白质浓度测定等。
二、BCA法：BCA法是一种基于铜离子与蛋白质中的蛋白质酰基反应产生紫色络合物的测定方法。
该方法具有灵敏度高、稳定性好等特点，广泛应用于蛋白质浓度测定和蛋白质含量分析。
1. 原理：BCA法的原理是蛋白质中的蛋白质酰基与铜离子在碱性条件下反应生成紫色络合物，该络合物的吸收峰位于562 nm处。
蛋白质浓度与吸光度呈线性关系，可通过比色法测定吸光度来推算蛋白质的浓度。
2. 步骤：BCA法的步骤主要包括样品制备、试剂配制、反应和测量。
首先，将待测样品制备成适当浓度的溶液；然后，配制BCA试剂，并与样品混合反应；最后，使用分光光度计测量反应产生的紫色络合物的吸光度，并根据标准曲线推算出蛋白质的浓度。
3. 应用：BCA法被广泛应用于生物化学、分子生物学、生物技术等领域。
测蛋白浓度的方法
测蛋白浓度的方法
测蛋白浓度的方法有多种，常见的方法包括：
1. Bradford法：用Bradford试剂与蛋白质反应，形成蓝色的蛋白质-染料复合物。
根据复合物与蛋白质浓度成反比的关系，可以通过比色法或荧光法测定蛋白质浓度。
2. Lowry法：将蛋白质与碱式铜试剂和Folin-Phenol试剂反应，生成紫色蛋白质-复合物。
通过比色法或荧光法测定复合物的吸光度，计算出蛋白质浓度。
3. BCA法：将蛋白质与BCA试剂反应形成紫色的蛋白质-染料复合物，根据复合物与蛋白质浓度成正比的关系，通过比色法或荧光法测定蛋白质浓度。
4. UV分光光度法：利用蛋白质在280nm处的吸收峰测定蛋白质浓度。
该方法的优点是快速、简单，但需要纯化后的蛋白质，并且无法区分不同种类的蛋白质。
5. 二维凝胶电泳：分析各种蛋白在二维中的迁移距离，可以定量测定蛋白质的相对含量。
该方法需要复杂的操作和设备，但能够同时定量多种蛋白质。
蛋白质浓度测定方法
蛋白质浓度测定方法蛋白质是生物体内一类重要的生物大分子，其浓度的准确测定对于生物学研究和生物工程技术具有重要意义。
目前常用的蛋白质浓度测定方法主要包括比色法、BCA法、Lowry法和Bradford法等。
下面将对这几种常用的蛋白质浓度测定方法进行详细介绍。
比色法是一种常用的蛋白质浓度测定方法，其原理是利用蛋白质与某种试剂发生反应后产生显色物质，通过测定显色物质的吸光度来确定蛋白质的浓度。
比色法操作简单，结果准确，适用于大多数蛋白质的浓度测定。
BCA法是一种基于铜离子与蛋白质中的蛋白质和肽键发生还原反应而形成的紫色螯合物来测定蛋白质浓度的方法。
BCA法对于蛋白质的浓度测定具有较高的灵敏度和特异性，适用于各种类型的蛋白质。
Lowry法是一种经典的蛋白质浓度测定方法，其原理是利用蛋白质与碱性铜离子和蛋白质中的酚类物质在碱性溶液中发生离子还原反应，生成蓝色络合物，通过测定其吸光度来确定蛋白质的浓度。
Lowry法对于蛋白质的浓度测定具有较高的灵敏度和稳定性，适用于大部分蛋白质的浓度测定。
Bradford法是一种基于某种染料与蛋白质中的氨基酸残基之间的相互作用来测定蛋白质浓度的方法。
Bradford法对于蛋白质的浓度测定具有较高的灵敏度和线性范围，适用于多种类型的蛋白质。
在进行蛋白质浓度测定时，需要注意以下几点，首先，选择合适的测定方法，根据样品的特性和实验要求进行选择；其次，掌握好操作技巧，严格按照操作步骤进行，避免操作失误；最后，对测定结果进行准确的记录和分析，确保结果的可靠性和准确性。
总之，蛋白质浓度的准确测定对于生物学研究和生物工程技术具有重要意义，选择合适的测定方法并掌握好操作技巧是保证测定结果准确可靠的关键。
希望本文介绍的蛋白质浓度测定方法能够对您有所帮助。
蛋白质定量的五种方法
蛋白质定量的五种方法方法一双缩脲法测定蛋白质浓度[目的]掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和标准曲线的绘制。
[原理]双缩脲(NH2CONHCONH2)在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲反应，蛋白质分子中含有许多肽键(-CONH-)在碱性溶液中也能与Cu2+反应产生紫红色化合物。
在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。
因此，可以利用比色法测定蛋白质浓度。
双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一。
操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小，但灵敏度较差，而且特异性不高。
除-CONH-有此反应外，-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基团也有此反应。
[操作]取中试管7支，按下表操作。
各管混匀、放置37℃水浴中保温20分钟。
用540nm比色，以空白管调零点，读取各管光密度值。
[计算](一)在座标纸上以光密度为纵座标，以蛋白质浓度为横座标绘制标准曲线。
(二)从标准曲线中查出待测血清样本的蛋白质浓度(g／L)，并求出人血清样本的蛋白质浓度。
(三)再从标准管中选择一管与测定管光密度相接近者，求出人血清样本的蛋白质浓度(g／L)。
[器材]中试管7支，l毫升刻度吸管3支，10毫升刻度吸管1支，水浴箱，721型分光光度计、坐标纸。
[试剂](—)6N NaOH：称取240g氢氧化钠溶于1000ml水中。
(二)双缩脲试剂：称取CuS04·5H2O 3.0克，酒石酸钾9.0 克和碘化钾5.0克，分别溶解后混匀，加6N NaOH l00ml，最后加水至1000ml，贮于棕色瓶中，避光，可长期保存。
如有暗红色沉淀出现，即不能使用。
(三)0.9％NaCl。
(四)蛋白质标准液(10mg／m1)，称取干燥的牛血清蛋白100.0mg，以少量生理盐水溶解后倒入l0ml容量瓶中，淋洗称量瓶数次，一并倒入容量瓶中，最后加生理盐水至刻度线，或用凯氏定氮法测定血清蛋白质含量，然后稀释成l0mg ／m1作为蛋白质标准液。
蛋白质浓度测定方法
蛋白质浓度测定方法蛋白质是生物体内最重要的基本组成部分之一，它在维持生物体正常功能和结构方面起着重要的作用。
因此，准确测定蛋白质浓度对于许多生物学和生物化学研究非常重要。
目前常用的蛋白质浓度测定方法包括比色法、光散射法、蛋白质标记法和生物分析法。
下面将详细介绍这些方法。
1.比色法比色法是一种简单、快速测定蛋白质浓度的方法。
其中最常用的方法是布拉德福法和Lowry法。
布拉德福法基于显色剂康斯塔蓝G与蛋白质间的相互作用，形成一个蛋白质-康斯塔蓝G复合物，该复合物的吸光度在595 nm处最大。
根据吸光度与蛋白质浓度之间的关系，可以通过比较待测样品与标准曲线的吸光度值来计算样品中的蛋白质浓度。
Lowry法是一种比色酶促反应法，其原理是将含有蛋白质的样品与低浓度的碱式铜离子和富尔氏试剂（Folin-Ciocalteu试剂）作用，产生显色反应。
然后通过测量显色产物的吸光度来计算蛋白质浓度。
2.光散射法光散射法是通过测量蛋白质溶液中散射光的强度来计算蛋白质浓度的一种方法。
该方法根据蛋白质溶液中蛋白质粒子的大小和浓度的关系来进行测定。
常用的光散射仪器有多角度光散射（MALS）仪和动态光散射（DLS）仪。
多角度光散射法可以通过测量来自不同角度的散射光来获得粒子的大小和形状信息，从而计算蛋白质浓度。
动态光散射法通过测量溶液中颗粒的热运动来计算颗粒的尺寸和分布，根据颗粒尺寸和浓度的关系，可以推导出蛋白质的浓度。
3.蛋白质标记法蛋白质标记法是一种通过标记蛋白质而实现测定蛋白质浓度的方法。
常见的蛋白质标记物有生物素、放射性同位素和荧光染料等。
标记方法包括直接标记和间接标记。
直接标记是将标记物直接与蛋白质结合，然后通过测量标记物的信号来计算蛋白质浓度。
间接标记是将标记物与蛋白质反应生成复合物，然后通过测量复合物的信号来计算蛋白质浓度。
4.生物分析法生物分析法是一种利用生物体系来测定蛋白质浓度的方法。
常见的生物分析方法包括酶活测定、荧光素酶报告基因测定和亲和层析法等。
蛋白质浓度测定方法
蛋白质浓度测定方法1.低里德试剂法低里德试剂法通过测定蛋白质与试剂中碱式染料之间的吸光度来计算蛋白质浓度。
常用的低里德试剂有考马斯亮蓝G-250和试剂Folin-Ciocalteu。
这种方法操作简便，灵敏度高，但依赖于特定的蛋白质。
2.比色法比色法使用吸光度测定蛋白质溶液中特定波长的光的吸收程度。
常用的试剂有Bradford试剂、Biuret试剂和BCA试剂。
这些试剂与蛋白质发生化学反应后，形成显色物质，显色强度与蛋白质浓度成正比。
这种方法操作简便，灵敏度高，但对于一些物质干扰较大。
3.紫外吸收法紫外吸收法是通过测定蛋白质在特定波长下的吸光度来计算蛋白质浓度。
蛋白质在280 nm波长下的吸光度与其含量成正比。
该方法对纯度较高的蛋白质测定较为准确，但对于包含核酸、色素等物质的溶液会有干扰。
4.氨基酸分析法氨基酸分析法是通过测定蛋白质中的氨基酸含量来估计蛋白质浓度。
可使用色谱法或光谱法进行氨基酸测定。
该方法需要较复杂的实验设置和仪器，适合用于纯化蛋白质或特定氨基酸分析。
5.生物学活性测定法生物学活性测定法是通过测定蛋白质对生物系统或特定底物的活化能力来估计蛋白质浓度。
例如，酶活测定法通过测定酶活性与酶浓度之间的关系来计算蛋白质浓度。
这种方法直接反映了蛋白质的功能性，但前提是需要具备可靠的活性测定方法。
在实验中选择合适的蛋白质浓度测定方法需要根据实验目的、样品属性和仪器设备等进行综合考虑。
此外，为了减小误差，实验过程中应注意控制实验条件的一致性，并进行适当的平行样品测定。
蛋白质浓度检测标准
蛋白质浓度检测标准引言蛋白质是生物体内非常重要的有机化合物，其浓度的准确检测对于许多生物学和生物化学研究具有重要意义。
蛋白质浓度的准确检测可以帮助科学家了解细胞内蛋白质的含量和分布，起到指导生物研究方法和结果解释的作用。
因此，制定蛋白质浓度检测标准至关重要。
确定蛋白质浓度的方法1.分光光度法分光光度法是目前最常用的测定蛋白质浓度的方法之一。
该方法利用蛋白质在特定波长下的吸光性质来测定其浓度。
具体操作步骤如下：–准备一定浓度的标准蛋白溶液，例如1mg/mL的牛血清白蛋白（BSA）溶液。
–使用分光光度计在280nm波长下测量标准蛋白溶液的吸光度。
记录吸光度与浓度的关系。
–测量待测蛋白溶液的吸光度，并根据标准曲线确定其浓度。
2.二氧化碳测定法二氧化碳测定法利用蛋白质氨基酸和二氧化碳的反应，原理是测定生成的二氧化碳量与蛋白质浓度成正比。
具体操作步骤如下：–将蛋白溶液与NaOH溶液混合，使蛋白质中的氨基酸与NaOH反应产生二氧化碳。
–静置反应混合液一段时间后，使用酸去除多余的NaOH。
–使用酸碱滴定法测定反应产生的一氧化碳的量，根据一氧化碳与蛋白质浓度的关系确定蛋白质的浓度。
3.比色法比色法是一种简单且常用的蛋白质浓度测定方法。
其原理是利用蛋白质与某些试剂的化学反应产生显色物质，颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。
具体操作步骤如下：–将蛋白质溶液与试剂混合，反应一段时间后生成显色物质。
–使用分光光度计测量显色物质的吸光度，根据吸光度与浓度的关系确定蛋白质的浓度。
蛋白质浓度检测的标准制定1.标准蛋白溶液的选取制定蛋白质浓度检测标准的第一步是选取标准蛋白溶液。
常用的标准蛋白溶液包括牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HSA）等。
选取标准蛋白溶液时应考虑其纯度、稳定性、价格等因素。
2.确定标准曲线标准曲线是将已知浓度的标准蛋白溶液的吸光度与浓度进行关联的曲线。
制定标准曲线的具体步骤如下：–准备一系列浓度递增的标准蛋白溶液，例如0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL等。
蛋白浓度测定方法
蛋白浓度测定方法蛋白浓度是生物学和化学研究中非常重要的参数，因此需要准确测定。
下面介绍两种常用的蛋白浓度测定方法。
一、比色法1. 原理比色法是利用蛋白质与某些试剂反应后形成的复合物吸收特定波长的光线，从而确定蛋白质含量的方法。
2. 实验步骤（1）制备标准曲线：取不同浓度的已知蛋白标准溶液，分别加入试剂，使其形成复合物。
然后使用分光光度计在特定波长下测量吸光度值，并记录下来。
将吸光度值作为纵坐标，标准溶液的蛋白质浓度作为横坐标绘制曲线。
（2）待测样品处理：将待测样品加入相同试剂中，形成复合物。
然后使用分光光度计在特定波长下测量吸光度值，并根据标准曲线计算出样品中蛋白质含量。
3. 注意事项（1）试剂选择：常用试剂有Bradford试剂、Biuret试剂和Lowry试剂等。
不同试剂的灵敏度和选择性不同，应根据实验需要选择合适的试剂。
（2）标准曲线制备：标准曲线中应包含待测样品中可能出现的蛋白质种类，以确保准确性。
二、BCA法1. 原理BCA法是利用还原剂将蛋白质中的酰胺键还原为游离氨基，然后使用BCA试剂与游离氨基反应生成紫色络合物。
络合物吸收特定波长的光线，从而确定蛋白质含量的方法。
2. 实验步骤（1）制备标准曲线：取不同浓度的已知蛋白标准溶液，加入还原剂和BCA试剂，使其形成络合物。
然后使用分光光度计在特定波长下测量吸光度值，并记录下来。
将吸光度值作为纵坐标，标准溶液的蛋白质浓度作为横坐标绘制曲线。
（2）待测样品处理：将待测样品加入相同还原剂和BCA试剂中，形成络合物。
然后使用分光光度计在特定波长下测量吸光度值，并根据标准曲线计算出样品中蛋白质含量。
3. 注意事项（1）还原剂选择：常用还原剂有DTT和β-巯基乙醇等。
不同还原剂的灵敏度和选择性不同，应根据实验需要选择合适的还原剂。
（2）标准曲线制备：标准曲线中应包含待测样品中可能出现的蛋白质种类，以确保准确性。
检验蛋白质浓度的方法
检验蛋白质浓度的方法
常用检测蛋白质浓度的方法有比色法、质谱法、时间分光光度法、电泳法等。
1、比色法：利用蛋白质及其衍生物吸收光谱的特点，分别用不同浓度的染色剂对标准品和样品进行染色，然后比较染色后的色度强度多少，可确定蛋白质浓度。
2、质谱法：其原理是，利用质谱仪，通过电离质谱图，分析样品中各种分子量物质，通过其他组分中已知浓度的比较，考察来蛋白质浓度。
3、时间分光光度法：该法是利用偶联反应，比如蛋白质与某种琼脂糖结合反应等，在短时间内达到最高点，然后用某种光度测定仪检测，由其浓度变化来推测蛋白质的浓度。
4、电泳法：电泳法是检测蛋白质最常用的方法，原理是把样品放在凝胶泳道中，加上电压，使分子带电而沿正负极移动，然后根据电泳图判断蛋白质浓度。
蛋白定量试剂
兼容大多数去垢剂
蛋白定量方法中，测定最快速，方法最简单，且在室温下进行
蛋白质间差异性小于Bradford法
与大多数盐离子、溶剂、缓冲剂、硫醇、还原性物质和金属螯合剂兼容
缺点
能还原铜离子的物质也能造成显色，影响定量的准确性
与通常用于溶解膜蛋白的高浓度去垢剂不兼容
与铜离子螯合的试剂，DTT 等常见还原剂和特定的单个氨基酸也会在BCA检测中显色（半胱氨酸或胱氨酸、酪氨酸和色氨酸）
1
2
3
4
5
6
7
8
0
1
2
4
8
12
16
20
20
19
18
16
12
8
4
0
0
0.025
0.05
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
每份标样分别加入BCA试剂200μl。
2、配制待测样品：准确吸取20μl样品溶液于酶标孔中，加入BCA试剂200μl。如待测样品需稀释，稀释倍数需根据原始样品浓度进行适当调整，一般保证稀释后样品浓度标曲浓度范围内。
2、配制待测样品：准确吸取50μl样品溶液于孔板中，加入考马斯亮蓝G250试剂200μl。静置10min后检测。如待测样品需稀释，稀释倍数需根据原始样品浓度进行适当调整，一般保证稀释后样品浓度在0.1-1.0mg/ml。
3、用酶标仪在595nm波长下测定溶液的吸光度。以BSA含量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。以标准曲线空白为对照，根据样品的吸光值从标准曲线上查出样品的蛋白质含量。
考马斯亮蓝G250
6104-58-1
磷酸
7664-38-2
乙醇(95%)
蛋白浓度测定的方法
蛋白浓度测定的方法蛋白质是生物体内的重要物质，对于许多实验室研究和临床诊断都有着重要的意义。
因此，准确测定蛋白质的浓度是非常关键的。
目前，常用的蛋白质浓度测定方法主要有生物学素法、分光光度法、BCA法、Lowry法、Bradford法和尿素法等。
下面将分别介绍这些方法的原理和操作过程。
1.生物学素法：生物学素法是一种通过测定蛋白质与棒状素之间的结合来确定蛋白质浓度的方法。
这种方法主要应用于血浆、血清和尿液等样品的蛋白质测定。
实验方法如下：a.准备一组具有不同浓度的棒状素溶液。
b.将待测蛋白质溶液与棒状素一起孵育一段时间。
c.通过酸甲醛试剂对母液进行反应，并测量光密度。
d.制作标准曲线，并根据待测样品的光密度与标准曲线的关系计算蛋白质浓度。
2.分光光度法：分光光度法是一种通过测定蛋白质对特定波长的紫外光吸收量来计算浓度的方法。
这种方法适用于纯度较高的蛋白质样品。
实验方法如下：a. 准备一组蛋白质标准溶液，并使用光度计测量其在280nm波长处的吸光度。
b.将待测蛋白质样品的吸光度值与标准溶液的吸光度值进行比较，并计算浓度。
3.BCA法：BCA法是一种通过测定蛋白质与巴氏试剂之间的反应产生的紫色络合物的吸光度来计算蛋白质浓度的方法。
该方法对于各种类型的蛋白质样品都适用。
实验方法如下：a.准备一组蛋白质标准溶液，并加入BCA试剂。
b.将待测蛋白质样品与BCA试剂孵育一段时间。
c.使用光度计测量吸光度，并通过标准曲线计算浓度。
4. Lowry法：Lowry法是一种经典的蛋白质浓度测定方法，通过低里试剂和碱式铜试液与蛋白质样品反应，产生紫色或蓝色化合物，并通过比色计测量光密度来计算蛋白质浓度。
实验方法如下：a.准备一组蛋白质标准溶液，并加入低里试剂和碱式铜试液。
b.将待测蛋白质样品与低里试剂和碱式铜试液反应一段时间。
c.使用比色计测量吸光度，并通过标准曲线计算浓度。
5. Bradford法：Bradford法是一种快速、敏感且广泛应用的蛋白质浓度测定方法，通过考虑到蛋白质在酸性溶液中与染料试剂环氧化苏丹蓝的特异性作用来计算浓度。
蛋白质浓度测定方法
蛋白质测定方法1 试剂：A．Na2CO3-NaOH溶液：①4% Na2CO3溶液，②0.2mol/L NaOH溶液，使用前①与②等体积混合配成Na2CO3-NaOH溶液；B．硫酸铜一酒石酸钾钠溶液：③1% CuSO4溶液（5个结晶水），④2%酒后石酸钾钠溶液，将③与④等体积混合配成硫酸铜一酒石酸钾钠溶液；C．配成Folin-酚试剂甲液：Na2CO3-NaOH溶液与硫酸铜一酒石酸钾钠溶液两个溶液按50︰1混合混合，此试剂只能用一天；D．福林酚试剂取Na2WO4·2H2O 100g，Na2MoO4·2H2O 25g 及蒸馏水700ml于1500ml的圆底烧瓶中，之后加入85% H3PO4 50ml，浓HCl 100ml。
安上回流冷却装置（使用磨口接头。
用软木塞或橡皮塞时，必须用锡泊包起来），使其慢慢沸腾10h。
冷却后加入Li2SO4·H2O 150g，水50ml，浓HCl 100ml安上回流冷却装置，开口加热煮沸15min，以逐出过量的溴。
冷却后稀释至100ml，并过滤入棕色瓶中，密闭于冰箱中保存。
使用时用标准NaOH溶液滴定，以酚酞为指示剂。
滴定终点由蓝变灰。
滴定后算出酸浓度，用时适量稀释，使最后浓度为1mol/L H＋，此为Folin-酚试剂乙液。
一般使用时用蒸馏水1：2（V：V）混合F．BSA标准蛋白（Fration V AMRESCO 公司, Lot 1205S02, 99.8%）溶液，（0，100，150, 200，250, 400微克/ml）。
2 具体操作步骤：取0.4毫升上清液（可能要稀释）及标准蛋白溶液加入5或10ml试管↓加入2毫升C液，混合，室温放置10分钟↓加入0.2毫升试剂E，混合，室温放置30分钟↓空白调零, 波长500 nm比色注：1.加入试剂E后需立即混合。
2.通过预试适当稀释样品使其蛋白质浓度在每毫升500微克以下。
3.放置30分钟后需立即比色，时间长颜色会衰减（每小时1%）。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
基本原理： 碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，ห้องสมุดไป่ตู้Cu+与BCA 试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的 吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白 的浓度。
紫外吸收法测蛋白质含量
蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸 残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸 收紫外光的性质。
吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度 值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶 液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。 利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与 蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含 量的测定。
原理
样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解 产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变 成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨， 借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被 中和的程度可计算得样品之氮含量。
以甘氨酸为例，其反应式如下：
NH2CH2COOH + 3H2SO4 == 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1) 2NH3 + H2SO4 ==(NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4 + 2NaOH ==2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3)
7. 蒸馏水
若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则 样品中蛋白质含量（%）=总氮量×6.25
若样品中除有蛋白质外，尚含有其他含 氮物质，则需向样品中加入三氯乙酸， 然后测定未加三氯乙酸的样品及加入三 氯乙酸后样品上清液中的含氮量，得出 非蛋白氮及总氮量，从而计算出蛋白氮， 再进一步算出蛋白质含量。
蛋白氮 = 总氮 - 非蛋白氮 蛋白质含量（g %）= 蛋白氮 × 6.25
双缩脲法
N端
C端
双缩脲
22
2
1800
2
加热
2
2
H－
＋ NH3
2
双缩脲
双缩脲反应:碱性环境
O=C HN
R-CH O=C
HN R-CH
H2O C=O
NH
CH-R
Cu
C=O
NH
CH-R
H2O
紫色络合物
原理
双缩脲法是利用蛋白质的双缩脲反应而测定蛋 白质含量的方法。因蛋白质含有两个以上的肽 键，所以有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质 与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋 白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨 基酸成分无关。 在一定的实验条件下，未知样品溶液与标准蛋 白质溶液同时反应，并于540~560nm测定，即可 以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的 蛋白质浓度。
试剂
一 试剂 1．标准酪蛋白溶液（5mg/ml） 用0.05mol/L NaOH溶液配制：5g酪蛋白加0.05mol/L NaOH 溶液至1 000ml。 2．双缩脲试剂
溶解1.5g硫酸铜（CuSO4 ·5H2O）和6.0 g酒石酸 钾钠（NaKC4H4O6 ·4H2O）于500ml蒸馏水中。在搅拌 下加入10% NaOH溶液300ml，用蒸馏水稀释到1升，贮 存在内壁涂有石蜡的瓶中，可长期保存。 3．未知蛋白质溶液
0
0
(mL)
OD540
2.各管混匀后，加入双缩脲试剂3.0mL,37oC反应30min。 3.以0号管调零，测定各管540nm光吸收值。
四、结果处理 1.绘制标准曲线 以牛血清白蛋白含量为横坐标，OD540为纵坐标，绘制
标准曲线。 2.样品的计算 根据样品的OD540从标准曲线上查得样品的蛋白质含量
γ–球蛋白溶液。
Folin－酚试剂法（Lowry法）
蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合， 形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚 试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物， 在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质 浓度的线性关系作标准曲线并测定样品 中蛋白质的浓度。该化合物在750nm有最 大吸收峰。
试剂：一：1，4%碳酸钠；2，0.2N氢氧 化钠；3，1%硫酸铜；4,2%酒石酸钾钠。 1和2等体积混合，3和4等体积混合，然后 将两液以50：1混合(甲)。当天使用。二： 1NFolin--酚试剂(乙)。 方法：标准曲线； 试管中加0、0.2、0.40、0.60、1.00毫升酪 蛋白溶液（500微克/毫升），加水补足1 毫升，平行做两份。按序各加5毫升试剂 （甲），摇匀，室温置放10分钟，再依 次加入1N（0.5毫升）Folin----酚试剂 （乙），摇匀，30摄氏度保温30分钟。然 后在分光光度机上比色测定（A750）。
• 准 确 灵 敏 ： BCA 试 剂 的 蛋 白 质 测 定 范 围 是 20 － 2000μg/ml；Micro BCA试剂测定范围是0.5-20μg/ml •快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍 而且更加方便 •经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行，大 大节约样品和试剂用量 •不受样品中离子型和非离子型去污剂影响 •检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝
三、操作步骤
1.取15支试管，按下表编号、加试剂
管号
0
1
2
3
4
5
6 样品
牛血清白 0 蛋白(mg)
0.6 1.2 2.4 3.6 4.8 6.0
2mg/mL牛 0
血清白蛋白
体积(mL)
0.3 0.6 1.2 1.8 2.4 3.0 －
待测液体 －
－
－
－
－
－
－ 3.0*
积(mL)
蒸馏水 3.0 2.7 2.4 1.8 1.2 0.6
试剂
1. 消化液：30% H2O2∶浓H2SO4∶H2O=3∶2∶1 2. 30% NaOH溶液 3. 2% H3BO3溶液 4. 混合催化剂（粉末K2SO4- CuSO4混合物） K2SO4与CuSO4以3∶1比例充分研细混匀。 5. 0.01mol/L标准盐酸溶液
6. 混合指示剂（田氏指氏剂）取0.1%甲烯蓝无水乙醇溶液50ml、0.1%甲基红-无水乙醇溶 液200ml，混合，贮于棕色瓶中备用。该指示 剂酸性时为紫红色，碱性时为绿色，变色范 围很窄（pH5.2～5.6）且很灵敏。
依据Lambert-Beer（朗伯－比尔）定律， 一束单色光通过溶液后，光波被吸收一部 分，其吸收多少与溶液中溶质的浓度和溶 液厚度成正比。
当入射光、吸收系数K和溶液的光径长度L 不变时，吸光度A与溶液的浓度C成正比。
具体测量时，
补充知识
７２１型可见分光光度计
紫外分光光度计
微量凯氏（Kjeldahl）定氮法
反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成， 反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以 提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用 强酸。
器材 1. 100ml凯氏烧瓶 2. 改进型凯氏定氮仪 3. 50ml容量瓶 4. 分析天平（电子天平） 5. 烘箱 6. 电炉 7. 酒精灯 8. 小玻璃珠 9. 滴定管 10. 洗瓶 11. 锥形瓶 12.铁架台
四种古老的经典方法：
定氮法 双缩尿法（Biuret法） Folin－酚试剂法（Lowry法） 紫外吸收法
新的测定法：
考马斯亮蓝法（Bradford法）
更新的测定方法：
BCA法
分光光度计的使用
原理
光线的本质是电磁波的一种，有不同的波长。肉眼 可见的彩色光称为可见光，波长范围在400～750nm： 小于400nm的光线称为紫外光；大于750nm的光线称 为红外光。 当光线通过透明溶液介质时，其辐射的波长有一部 分被吸收，一部分透过、因此光线射出溶液之后， 部分光波减少，这种光波的吸收和透过可用于某些 物质的定性定量分析。
讨论
每种方法的适用范围 每种方法的影响因素 还有无其他方法
PROTEIN
Coomassie G-250
NH
+
CH3
CH3
C
+ CH3CH2 N
CH2
N CH2CH3 CH2
SO3-
SO3Na
Acid
BLUE
Protein - Dye
Complex
Amax = 595nm
总蛋白定量分析－BCA（Bicinchoninic acid， 二辛可宁酸、二羧基二喹啉）
（mg），再根据样品的体积计算出样品的浓度。 五、注意事项 1.须于显色后30min内测定，且各管由显色到比色时间应
尽可能一致。 2.*样品蛋白质含量应在标准曲线范围内。 3.比色杯的使用
测量后的计算方法
使用
一
实验结果 求出待测蛋白质溶液的光密度后，
从标准曲线上查出其蛋白质浓度，按稀 释倍数求出每毫升蛋白质溶液的蛋白质 含量。
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度
考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内， 蛋白质和染料结合符合比尔定律 ，因此 可以通过测定染料在595nm处光吸收的增 加量得到与其结合的蛋白质量。该法简 单、迅速、干扰物质少、灵敏度高（比 Lowry法灵敏4倍）。
Coomassie Dye-Based 蛋白质定量
O CH2CH3