蛋白质浓度测定方法..

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(mL)
OD540
2.各管混匀后，加入双缩脲试剂3.0mL,37oC反应30min。 3.以0号管调零，测定各管540nm光吸收值。
四、结果处理 1.绘制标准曲线 以牛血清白蛋白含量为横坐标，OD540为纵坐标，绘制
标准曲线。 2.样品的计算 根据样品的OD540从标准曲线上查得样品的蛋白质含量
四种古老的经典方法：
定氮法 双缩尿法（Biuret法） Folin－酚试剂法（Lowry法） 紫外吸收法
新的测定法：
考马斯亮蓝法（Bradford法）
更新的测定方法：
BCA法
分光光度计的使用
原理
光线的本质是电磁波的一种，有不同的波长。肉眼 可见的彩色光称为可见光，波长范围在400～750nm： 小于400nm的光线称为紫外光；大于750nm的光线称 为红外光。 当光线通过透明溶液介质时，其辐射的波长有一部 分被吸收，一部分透过、因此光线射出溶液之后， 部分光波减少，这种光波的吸收和透过可用于某些 物质的定性定量分析。
三、操作步骤
1.取15支试管，按下表编号、加试剂
பைடு நூலகம்管号
0
1
2
3
4
5
6 样品
牛血清白 0 蛋白(mg)
0.6 1.2 2.4 3.6 4.8 6.0
2mg/mL牛 0
血清白蛋白
体积(mL)
0.3 0.6 1.2 1.8 2.4 3.0 －
待测液体 －
－
－
－
－
－
－ 3.0*
积(mL)
蒸馏水 3.0 2.7 2.4 1.8 1.2 0.6
双缩脲法
N端
C端
双缩脲
22
2
1800
2
加热
2
2
H－
＋ NH3
2
双缩脲
双缩脲反应:碱性环境
O=C HN
R-CH O=C
HN R-CH
H2O C=O
NH
CH-R
Cu
C=O
NH
CH-R
H2O
紫色络合物
原理
双缩脲法是利用蛋白质的双缩脲反应而测定蛋 白质含量的方法。因蛋白质含有两个以上的肽 键，所以有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质 与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋 白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨 基酸成分无关。 在一定的实验条件下，未知样品溶液与标准蛋 白质溶液同时反应，并于540~560nm测定，即可 以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的 蛋白质浓度。
试剂
一 试剂 1．标准酪蛋白溶液（5mg/ml） 用0.05mol/L NaOH溶液配制：5g酪蛋白加0.05mol/L NaOH 溶液至1 000ml。 2．双缩脲试剂
溶解1.5g硫酸铜（CuSO4 ·5H2O）和6.0 g酒石酸 钾钠（NaKC4H4O6 ·4H2O）于500ml蒸馏水中。在搅拌 下加入10% NaOH溶液300ml，用蒸馏水稀释到1升，贮 存在内壁涂有石蜡的瓶中，可长期保存。 3．未知蛋白质溶液
PROTEIN
Coomassie G-250
NH
+
CH3
CH3
C
+ CH3CH2 N
CH2
N CH2CH3 CH2
SO3-
SO3Na
Acid
BLUE
Protein - Dye
Complex
Amax = 595nm
总蛋白定量分析－BCA（Bicinchoninic acid， 二辛可宁酸、二羧基二喹啉）
反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成， 反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以 提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用 强酸。
器材 1. 100ml凯氏烧瓶 2. 改进型凯氏定氮仪 3. 50ml容量瓶 4. 分析天平（电子天平） 5. 烘箱 6. 电炉 7. 酒精灯 8. 小玻璃珠 9. 滴定管 10. 洗瓶 11. 锥形瓶 12.铁架台
7. 蒸馏水
若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则 样品中蛋白质含量（%）=总氮量×6.25
若样品中除有蛋白质外，尚含有其他含 氮物质，则需向样品中加入三氯乙酸， 然后测定未加三氯乙酸的样品及加入三 氯乙酸后样品上清液中的含氮量，得出 非蛋白氮及总氮量，从而计算出蛋白氮， 再进一步算出蛋白质含量。
蛋白氮 = 总氮 - 非蛋白氮 蛋白质含量（g %）= 蛋白氮 × 6.25
依据Lambert-Beer（朗伯－比尔）定律， 一束单色光通过溶液后，光波被吸收一部 分，其吸收多少与溶液中溶质的浓度和溶 液厚度成正比。
当入射光、吸收系数K和溶液的光径长度L 不变时，吸光度A与溶液的浓度C成正比。
具体测量时，
补充知识
７２１型可见分光光度计
紫外分光光度计
微量凯氏（Kjeldahl）定氮法
• 准 确 灵 敏 ： BCA 试 剂 的 蛋 白 质 测 定 范 围 是 20 － 2000μg/ml；Micro BCA试剂测定范围是0.5-20μg/ml •快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍 而且更加方便 •经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行，大 大节约样品和试剂用量 •不受样品中离子型和非离子型去污剂影响 •检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝
原理
样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解 产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变 成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨， 借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被 中和的程度可计算得样品之氮含量。
以甘氨酸为例，其反应式如下：
NH2CH2COOH + 3H2SO4 == 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1) 2NH3 + H2SO4 ==(NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4 + 2NaOH ==2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3)
讨论
每种方法的适用范围 每种方法的影响因素 还有无其他方法
试剂
1. 消化液：30% H2O2∶浓H2SO4∶H2O=3∶2∶1 2. 30% NaOH溶液 3. 2% H3BO3溶液 4. 混合催化剂（粉末K2SO4- CuSO4混合物） K2SO4与CuSO4以3∶1比例充分研细混匀。 5. 0.01mol/L标准盐酸溶液
6. 混合指示剂（田氏指氏剂）取0.1%甲烯蓝无水乙醇溶液50ml、0.1%甲基红-无水乙醇溶 液200ml，混合，贮于棕色瓶中备用。该指示 剂酸性时为紫红色，碱性时为绿色，变色范 围很窄（pH5.2～5.6）且很灵敏。
γ–球蛋白溶液。
Folin－酚试剂法（Lowry法）
蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合， 形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚 试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物， 在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质 浓度的线性关系作标准曲线并测定样品 中蛋白质的浓度。该化合物在750nm有最 大吸收峰。
试剂：一：1，4%碳酸钠；2，0.2N氢氧 化钠；3，1%硫酸铜；4,2%酒石酸钾钠。 1和2等体积混合，3和4等体积混合，然后 将两液以50：1混合(甲)。当天使用。二： 1NFolin--酚试剂(乙)。 方法：标准曲线； 试管中加0、0.2、0.40、0.60、1.00毫升酪 蛋白溶液（500微克/毫升），加水补足1 毫升，平行做两份。按序各加5毫升试剂 （甲），摇匀，室温置放10分钟，再依 次加入1N（0.5毫升）Folin----酚试剂 （乙），摇匀，30摄氏度保温30分钟。然 后在分光光度机上比色测定（A750）。
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度
考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内， 蛋白质和染料结合符合比尔定律 ，因此 可以通过测定染料在595nm处光吸收的增 加量得到与其结合的蛋白质量。该法简 单、迅速、干扰物质少、灵敏度高（比 Lowry法灵敏4倍）。
Coomassie Dye-Based 蛋白质定量
O CH2CH3
（mg），再根据样品的体积计算出样品的浓度。 五、注意事项 1.须于显色后30min内测定，且各管由显色到比色时间应
尽可能一致。 2.*样品蛋白质含量应在标准曲线范围内。 3.比色杯的使用
测量后的计算方法
使用
一
实验结果 求出待测蛋白质溶液的光密度后，
从标准曲线上查出其蛋白质浓度，按稀 释倍数求出每毫升蛋白质溶液的蛋白质 含量。
基本原理： 碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+， Cu+与BCA 试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的 吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白 的浓度。
紫外吸收法测蛋白质含量
蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸 残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸 收紫外光的性质。
吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度 值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶 液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。 利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与 蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含 量的测定。