丙型肝炎检测方法的研究进展_尹秀华

医学理论与 实践 ２０１３ 年 第２６ 卷 第２ 期 Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．２，Ｊａｎ２０１３ Ｊ Ｍｅｄ Ｔｈｅｏｒ ＆Ｐｒａｃ １７１
丙型肝炎检测方法的研究进展
尹秀华
天 津 市 宝 坻 区 中 医 医 院 检 验 科 ３０１８００
关键词 丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ，ＨＣＶ）引 起 的 传 染 病，主 要 通 过 血 液 传 播。 我 国 平 均 感 染 率 为 ３．２％。北方稍高，约为４．６％，南方为２．６％～２．９％，感染人数估计有３ ７００万。受感染的母亲传播给婴儿的发生 率 为５％ 。 丙 肝 是 严 重 威 胁 人 类 健 康 的 传 染 病 之 一 ，多 数 患 者 可 以 演 变 为 慢 性 丙 型 肝 炎 ，其 中２０％ 左 右 可 发 展 为 肝 硬 化，肝硬化患者１０年内有大约３０％发展为终末期肝病，并且 ＨＣＶ 感 染 与 原 发 肝 癌 有 较 密 切 关 系 。 随 着 医 学 检 测 方 法的不断进展，丙肝检测方法也有了很大的进展。本文对丙肝检测方法进行了综 述。 从 胶 体 金 法、ＥＬＩＳＡ 法（丙 肝 抗 体检测）、丙肝抗原检测和分子生物学的诊断几 个 方 面 进 行 阐 述。 目 前 临 床 对 丙 型 肝 炎 的 诊 断 仍 是 以 临 床 症 状 结 合 抗－ＨＣＶ 抗体、ＨＣＶ－ＲＮＡ 等实验室指标为临床诊断依据。 关 键 词 ＣＶ 抗 －ＨＣＶ 胶 体 金 ＨＣＶ－ＲＮＡ ＥＬＩＳＡ ＲＴ－ＰＣＲ 中 图 分 类 号 ：Ｒ５１２．６＋３ 文 献 标 识 码 ：Ａ 文 章 编 号 ：１００１－７５８５（２０１３）０２－０１７１－０３
为其虽然可以做出早期诊断 ，但敏感性仍有待提高 。 为了保证临床用血的安全性 ，国外已有国家将 ＨＣＶ 核酸的 检 测 作 为 常 规 项 目 。 罗 氏 诊 断 （Ｒｏｃｈｅ ｉａｇ－ ｎｏｓｔｉｃｓ）Ａｍ－ｐｌｉｃｏｒ ＨＣＶ Ｔｅｓｔ（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）的 检 测 原理是应用 ＰＣＲ 扩 增 技 术 直 接 检 测 病 毒 ＲＮＡ，并 且采用国际单位来 报 告 分 析 检 测 的 敏 感 性 ，其 操 作 步骤简单，可 以 满 足 批 量 检 测 的 需 要 。 而 ＨＣＶ 核 酸检测并非都须 依 赖 ＰＣＲ 扩 增 技 术。Ｃｈｉｒｏｎ 公 司 推 出 的 支 链 ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）技 术 就 是 一 种 不 依 赖 ＰＣＲ 的核 酸 放 大 定 量 方 法 。 先 将 血 清 ＨＣＶ－ＲＮＡ 与包被在固相板上 的 探 针 杂 交 ，固 定 后 加 入 多 个 靶 探针分别与 ＨＣＶ－ＲＮＡ ５’ＵＴＲ 的核心抗 原 区 的 不 同位点杂交，放大信号 数 １０ 倍，然 后 加 入 ｂＤＮＡ 扩 增子，与各靶探针结合 ，每个扩增子提供多个酶探针 结合位点，这样每个核酸信号得以放大数百倍 ，最后 通过底 物 发 光 检 测，ＤＮＡ 量 与 发 光 强 弱 成 正 比 。 ｂＤＮＡ 技术的最大特点是不需经过呈指数增长的扩 增过程，只需将待检测病毒裂解使核酸释放 ，并转化 为单链进 行 检 测 ，因 此 其 稳 定 性 和 重 复 性 均 较 高 。 但由于其放大倍数有限 ，故 对 低 水 平 ＨＣＶ－ＲＮＡ 检 测的敏感性 仍 有 待 提 高 。ＨＣＶ－ＲＮＡ 特 异 性 高，当 需要对可疑丙肝病毒感染患者标本做确证实验时发 挥重要作用 。 ［１４］ 双探针实时荧光定量法检测 ＨＣＶ－ ＲＮＡ 可以提高其 检 测 的 灵 敏 度 和 特 异 性 。 ［１５］ 丙 型 肝 炎 病 毒 抗 体 、抗 原 和 ＲＮＡ 的 联 合 检 测 已 成 为 ＨＣＶ 感染诊断的主 要 指 标 ，缩 短 了 窗 口 期，有 利 于 丙肝患者早期诊断和治疗。 ５ ＨＣＶ 基因检测
来 的 热 门 课 题。 核 心 蛋 白 可 以 和 ＮＳ３、ＮＳ５Ａ、 ＮＳ５Ｂ 蛋白共同 诱 导 成 熟 树 突 状 细 胞 凋 亡 ，从 而 抑 制宿主的 细 胞 免 疫 应 答；ＨＣＶ 核 心 蛋 白 与 肿 瘤 坏 死因子（ＴＮＦ－α）受 体 以 及 淋 巴 毒 素 Ｂ 受 体 结 合 亦 可以调控细胞凋亡 ，从而参与免疫应答的调控 ；赵景 民 等 研 究 了 慢 性 丙 型 肝 炎 肝 组 织 ＣＰＰ３２ 蛋 白 酶、 Ｆａｓ、ＦａｓＬ 的表达 发 现 慢 性 丙 型 肝 炎 肝 组 织 中 除 了 Ｆａｓ、ＦａｓＬ 表达上调外，ＣＰＰ３２ 蛋 白 酶 及 其 ＲＮＡ 也 平 行 上 调 。 他 选 择 了 ６５ 例 中 ４０ 例 经 免 疫 组 化 检 测 ＨＣＶ 抗原阳 性 的 肝 细 胞，通 过 连 续 免 疫 组 织 化 学 和原位杂 交，分 析 发 现，ＣＰＰ３２ 和 Ｆａｓ 蛋 白 酶 及 其 ＲＮＡ 主要在 ＨＣＶ ｃＡｇ阳性的 肝 细 胞 内 表 达 ，而 在 单纯 ＮＳ３ 或 ＮＳ５ 阳 性 的 肝 细 胞 中 则 表 达 较 少，另 外 ＦａｓＬ 阳性的单个 核 细 胞 也 呈 一 定 程 度 的 平 行 表 达，这一结果提示ｃＡｇ与 ＣＰＰ３２和 Ｆａｓ蛋白酶及其 ＲＮＡ 的表达有一定的相关性 。
丙型肝 炎 病 毒 是 单 股 正 链 ＲＮＡ 病 毒，属 黄 病 毒科丙型肝炎 属。ＨＣＶ 基 因 组 含 有 一 个 开 放 读 码 框（ＯＲＦ），编码１０余种结构和非结构 （ＮＳ）蛋 白，膜 蛋白分 布 于 病 毒 表 面，ＮＳ３ 蛋 白 是 一 种 多 功 能 蛋 白，氨基端具有 蛋 白 酶 活 性，羧 基 端 具 有 螺 旋 酶／三 磷酸 核 苷 酶 活 性；ＮＳ５Ｂ 蛋 白 是 ＲＮＡ 依 赖 的 ＲＮＡ 聚合酶，均为 ＨＣＶ 复制所必 需，是 抗 病 毒 治 疗 的 重 要靶位［１］。 丙型肝炎呈世界性分 布 。 丙 型 肝 炎 病 毒 （ＨＣＶ）是丙型肝炎的病原 体，其 致 病 机 制 主 要 是 通 过病理性免疫应答 导 致 肝 细 胞 损 伤 ，它 还 有 诱 发 原 发性肝癌的 可 能［２］。 据 世 界 卫 生 组 织 统 计 ，全 球 丙 型肝炎 病 毒 （ＨＣＶ）的 感 染 率 约 为 ３％，每 年 新 发 ＨＣＶ 病例约３１５万例［３］，而高度慢性 化 是 该 病 的 最 大特征［４］。 因此，控 制 ＨＣＶ 感 染 的 形 势 十 分 严 峻 ， 而早发现、早诊断和早治 疗 是 防 控 ＨＣＶ 传 染 源、阻 断传播途径最为有效的手段。目前临床对丙型肝炎 的诊断 仍 是 以 临 床 症 状 结 合 抗－ＨＣＶ 抗 体、ＨＣＶ－ ＲＮＡ 等实 验 室 指 标 为 临 床 诊 断 依 据。 现 将 ＨＣＶ 感染实验室诊断进展综述如下。 １ ＨＣＶ 的胶体金法检测
剂自身原因造成 ，但 金 标 法 仍 可 作 为 筛 查 丙 型 肝 炎 病毒抗体比较适合的方法推广应用 ，对于早期发现 、 预防和 控 制 丙 型 肝 炎 ，具 有 重 要 的 临 床 价 值 和 应 用 ［６］。 ２ ＥＬＩＳＡ 法检测丙肝抗体
目前我国最常使用的检测丙肝抗体的方法就是 ＥＬＩＳＡ 法。它具有简单、快 速、方 便 的 特 点，但 对 灰 区结果判 读 的 可 靠 性 通 常 较 差 。ＥＬＩＳＡ 试 剂 为 筛 检试剂，存 在 一 定 数 量 的 假 阴 性 和 假 阳 性 结 果 ，在 ＨＣＶ 流 行 率 低 的 人 群 中，如 无 偿 献 血 者 抗－ＨＣＶ ＥＬＩＳＡ 试剂的 假 阳 性 和 假 阴 性 问 题 都 一 直 比 较 突 出［７，８］。ＥＬＩＳＡ 在 检 测 过 程 中 影 响 因 素 诸 多 如 类 风 湿 因 子 、高 免 疫 球 蛋 白 血 症 、标 本 中 超 氧 化 物 歧 化 酶 （ＳＯＤ）的干 扰、用 于 固 相 包 被 的 ＨＣＶ 基 因 工 程 抗 原不纯等均可造成假阳性结果［９］。 在 检 测 过 程 中 影 响因素也很多如加样时间过长 、检验速度过快 、洗板 等均可造成假 阳 性 结 果 。 ［１０］ 目 前 国 产 和 进 口 ＨＣＶ 抗 体 检 测 ＥＬＩＳＡ 试 剂 盒 各 批 次 试 剂 的 国 家 生 物 制 品质量检定结果比较其灵敏度 、阴性符合率、阳性符 合率结果相似 ，难分优劣，均达到国家标准。国产试 剂实验操作相对 简 单 ，物 流 周 期 短，有 效 期 长，价 格 合理 ，更适合于 临 床 。 ［１１］ 丙 肝 抗 体 检 测 特 异 性 和 灵 敏 度 高 ，是 目 前 医 院 输 血 前／术 前 血 检 中 检 测 丙 肝 的 主要方法，在 日 常 输 血 前／术 前 常 规 检 测 中，ＥＬＩＳＡ 法检测丙肝抗体具有重要的临床价值。近年来酶联 免疫反应加速仪的 应 用 将 替 代 常 规 温 育 法 ，酶 联 免 疫反应加速仪具有 加 速 抗 原 抗 体 反 应 的 作 用 ，在 缩 短工作时间的基础上 ，可以提高 ＥＬＩＳＡ 检测的灵敏 度 ，有 利 于 临 床 “灰 区 ”标 本 结 果 的 正 确 判 读 ，对 临 床 正确 、快速诊断 ，避免 漏诊 有 很 大的积极意义 。 ［１２］ ３ ＨＩＶ 核心抗原检测
ＨＣＶ 感染后一 般 到 抗 体 转 阳 有 一 个 较 长 的 窗 口期，约ｌ％～３％的患者抗－ＨＣＶ 可持 续 阴 性，而 基 因组的复制出现得 很 早 ，感 染 后 数 天 即 出 现 病 毒 血 症，已有输血后即有丙型肝炎病毒感染发生的报道 。 ＨＣＶ－ＲＮＡ 检测大约在 １～２ 周 内 就 能 检 测 出 患 者 是否患有丙肝 病 毒 感 染 ，大 大 的 缩 短 了 窗 口 期 。 它 的检测分两种 方 法 即 定 性 和 定 量 检 测 。 由 于 ＨＣＶ 为 ＲＮＡ 病毒，因 此 通 常 应 用 ＲＴ－ＰＣＲ 在 体 外 进 行 病毒扩增，做定 性 或 定 量 检 测 。 近 几 年 发 展 起 来 的 ＰＣＲ 技术主 要 有 荧 光 定 量 ＰＣＲ、竞 争 性 定 量 ＰＣＲ 和交替定量 ＰＣＲ 等，这些 技 术 可 以 监 控 ＨＣＶ 在 体 内的复制情 况，为 慢 性 ＨＣＶ 患 者 的 病 情 诊 断 和 疗 效评价提供了依据。 实 时 荧 光 定 量 ＰＣＲ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）也可以对血清中 ＲＮＡ 做 定 量 检 测，并 以 此 作 为临床治疗 ＨＣＶ 的 一 项 观 察 指 标，但 也 有 报 道 认
ＨＣＶ 主 要 的 抗 原 有 Ｃ、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、 Ｎｓ４、ＮＳ５等，其 中 核 心 抗 原 （ｃＡｇ）是 由 ＨＣＶ 基 因 组中保守部位编码 而 来 ，该 抗 原 的 相 关 研 究 是 近 年
１７ ２ Ｊ Ｍｅｄ Ｔｈｅｏｒ ＆Ｐｒａｃ Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．２，Ｊａｎ ２０１３ ２０１３ 年 第２６ 卷 第２ 期 医学理论与实践
ＨＣＶ 一 般 通 过 被 污 染 的 血 液 和 血 液 制 品 传 播，尽早检出 ＨＣＶ 感 染 者 是 实 现 丙 型 肝 炎 早 期 诊 断、阻断 ＨＣＶ 传播的重要途径。利用重组 ＨＣＶ 抗 原开发的抗 ＨＣＶ 抗 体 检 测 技 术，目 前 检 测 的 特 异 性 已 高 达 ９９％ 以 上。 但 是 在 ＨＣＶ 感 染 后 至 抗 ＨＣＶ 抗体产生之前还有一 段 较 长 时 期 约 ４０～７０ｄ， 称为感染后血 清 阳 转 前 的 窗 口 期 。ＨＣＶ 核 心 抗 原 作为 ＨＣＶ 感 染 者 体 内 出 现 的 早 期 感 染 的 标 志，几 乎与 ＨＣＶ－ＲＮＡ 同 时 出 现。 一 般 情 况 下，丙 型 肝 炎 病毒感染者 在 感 染 后 数 周 内 血 清 ＨＣＶ 抗 原 出 现， 在 ＨＣＶ 感染后至 抗 ＨＣＶ 抗 体 产 生 之 前 还 有 一 段 感染后血清阳转前的窗口期（ＰＷＰ）ＨＣＶ，核心 抗 原 的 平 均 检 出 时 间 只 比 ＨＣＶ－ＲＮＡ 晚 约 １ｄ。 ＨＣＶ 抗原检测耗时短，方法与常规酶免疫实验相似 ，不用 添 加 仪 器 设 备 ，大 大 缩 短 了 窗 口 期 。 但 是 ，当 机 体 出 现 抗 ＨＣＶ 抗体之后，体内 ＨＣＶ 核心抗原和抗体相 结合，抗原检 出 率 降 低 或 不 能 检 出 。 因 此，ＨＣＶ 核 心抗 原可应用 于 ＨＣＶ 感 染早期 诊 断 。 ［１３］ 此 法 可 以 作为补充检测，但 受 检 测 方 法、仪 器 等 条 件 限 制，灵 敏度较差。 ４ 核酸 ＲＮＡ 的检测
胶体金法快速检测技术是近年来发展起来的一 种 新 技 术 。 从 １９８９ 年 诞 生 至 今 ，已 被 广 泛 应 用 于 免 疫 检 测 的 各 个 领 域 ，具 有 简 便 、快 速 、标 本 用 量 少 、不 需仪器设备等优点。它采用特异性抗原抗体反应及 免疫层析 技 术。 对 于 Ｓ／ＣＯ（标 本 的 测 定 值 与 临 界 值之 间 的 比 值 ）值 较 低 的 抗 ＨＣＶ 血 清 标 本 特 异 性 低而易造 成 阴 性 结 果。 但 是 其 有 效 性 仍 然 值 得 肯 定，其特异性、敏感性基本均达到 ＥＬＩＳＡ 水平，与国 内相关报道一致［５］。 它在急诊及临 床 Hale Waihona Puke Baidu 用 中 具 有 较 强 的 优 势 ，已 在 生 物 医 学 领 域 ，尤 其 是 医 学 检 验 得 到 广泛应用，可作为 筛 查 丙 型 肝 炎 病 毒 抗 体 的 重 要 手 段。金标法是一 种 操 作 简 便 、快 捷、观 察 直 观、省 时 的检测抗－ＨＣＶ 的方法。虽然临床 存 在 一 定 的 假 阴 性和假阳性率，可 能 因 环 境 因 素 和 人 为 因 素 以 及 试