神经干细胞培养与鉴定
海马神经干细胞的分离、培养与鉴定
显 示 神 经 元 、 状 胶 质 细胞 、 星 寡树 突 细胞 抗 原 阳性 。 结论 ： 海 马 分 离 出 的 细 胞 具 有 自我 更 新 、 殖 和 分 化 能 从 增
力 ， 神经 干细胞。 是
关 键 词 神 经 干 细 胞 海 马 大 鼠 细 胞 培 养
分类 号 Ｒ７ １ ０ ４ ．５
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第 １ ２卷 第 １ ９期 ２０ ０ ２年 ｌ Ｏ月
中 国 现 代 医学 杂 志 Ｃｈｎ ｏ ｍ ￣ ｏ ｏ ｅｎ Ｍ ｅ ｉｉ ｉａＪ ｕ ｆＭ ｄ Ｆ ｄｃｎｅ
Ｖｏ ． ２ Ｎｏ． ９ １１ １ ０Ｃ ．２ ０ ｔ ０２
Ｉ ＯＬＡＴＩ Ｎ ． Ｓ Ｏ ＣＵＬＴＵＲＥ ＡＮ Ｄ ＤＥＮＴＩ ＣＡＴＩ Ｎ Ｆ ＮＥＵＲＡ Ｌ Ｉ ＦＩ Ｏ Ｏ Ｓ ＴＥＭ ＣＥＬＬＳ Ｉ ＲＡ ＴＳ’ Ｈ Ｉ Ｎ ＰＰＯ ＣＡＬＭ ＰＵＳ
Ｌｉ ｕ Ｂａｉａｎ ， ｉ ｇｑ ｙ ＬｉＸ ｎ ｕｎ ， ａｎ Ｚｈ ｇｈｕ ｘｉ ， ｅ ． ａ ａｎ ｔａ１
个 克 隆 进 行 连 续 传 代 培 养 ， 免 疫 组 化 检 测 ｎｓｉ 原 和 分 化 后 神 经 细 胞 特 异 性 抗 原 。 结 果 ： 海 马 获 得 的 用 ｅｔ ｎ抗 从
细胞 群 能 够 连 续 传 代 ， 离后 的 单 个 细 胞 能 形成 事 迹 球 ， 疫 检 测 为 ｎｓｉ 性 ； 外 、 内分 化 的细 胞 分 别 分 免 ｅｔ ｎ阳 体 体
［ ｂｔａｔ Ｏｂｅｔ ｅＴｏｉ ｌｔ ｎａ ｄｉｅｔｉ ｔ ｎｏ ｅ ｒｌｔｍ ｅｓｉ ｒｔ’ ｉｐｃｌ ｕ ． ｔｏ ｓＣ ｌ Ａ ｓ ｃ］ ｊｃｉ ： ｏａｉ ｎ ｎｉｃ ｉ ｆ ｕａ ｓ ｃｌ ａｓ ｈｐｏａｍｐｓ Ｍｅｈｄ ： ｅ ｓ ｒ ｖ ｓ ｏ ｄ ｆａｏ ｎ ｅ ｌｎ ｌ
人胎脑神经干细胞的体外分离、培养与鉴定
人胎脑神经干细胞的体外分离、培养与鉴定方庆;朱庆丰;尹国才;陈新生【期刊名称】《中国医药导报》【年(卷),期】2012(9)27【摘要】Objective To explore the methods of isolation, cultivation and differentiation of human fetal neural stem cells, and to observe the characteristics of proliferation and differentiation of neural stem cells in vitro. Methods The neural stem cells were isolated from human fetal hippocampus at embryonic age 14 weeks by induction of labor with water bag. A serum free medium containing basic fibroblast growth factor (bFGF) and epidermal growth factor (EGF) was used to cultured and expanded neural stem cells. The cells were cultured, passed and differentiated. Cultured and differentiated cells were identified with immunofluorescence test. Results The human neural stem cells having the abilities of self-renew and multipotency were successfully isolated and cultured from human fetal brain with serum free medium. They were found to form typical neurospheres in suspension and express Nestin antigen. The cells could be amplified and passed continuously. Neural stem cells were induced to differentiate and express specific antigens of neuron and astrocyte in serum medium. Conclusion The neural stem cells isolated from human fetal brain have the abilities of self-replication, multipotency and amplification in vitro. It has useful appliacation in further basic and clinicalresearch.%目的探索人胎脑神经干细胞的体外分离培养条件,从而在体外大量增殖神经干细胞,并观察神经干细胞增殖和分化的特点.方法采用含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮细胞生长因子(EGF)的无血清培养技术,从14周自愿水囊引产人胎脑海马皮质中分离出神经干细胞,并进行培养、传代、分化观察,应用免疫荧光细胞化学技术对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定.结果从14周人胎脑皮质中成功分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞,在无血清培养时细胞呈悬浮状态生长,形成神经球,该细胞具有连续增殖能力,可传代培养,表达神经巢蛋白抗原(Nestin);在含血清培养时诱导神经干细胞分化,分化后的细胞表达神经元细胞和胶质细胞的特异性抗原.结论在含有EGF和bFGF的无血清培养液中,从人胎脑能分离培养出具有自我复制和分化潜能的神经干细胞,并能在体外扩增,可进一步用于基础及临床研究.【总页数】3页(P19-20,24)【作者】方庆;朱庆丰;尹国才;陈新生【作者单位】安徽医科大学附属安庆医院神经外科,安徽安庆,246003;安庆师范学院生命科学系,安徽安庆,246003;安庆师范学院生命科学系,安徽安庆,246003;安徽医科大学附属安庆医院神经外科,安徽安庆,246003【正文语种】中文【中图分类】R421【相关文献】1.人胎肝间充质干细胞体外分离培养和生物学鉴定 [J], 何念海;赵文利;王宇明2.人胎肝干细胞体外分离、培养及鉴定 [J], 高沿航;李玉林;李艳茹;吴珊;全成实;王芯蕊;张丽红3.人胎脑神经干细胞体外培养及分化研究 [J], 巨容;杜江;兰和魁;王斌;封志纯4.人胎儿骨髓基质干细胞的分离、体外培养和鉴定 [J], 陈金武;吴军正;张军;李焰;刘斌5.人胎肝干细胞的体外分离培养与鉴定 [J], 毛海洲;陈耀凯;王宇明;张磊;刘国栋因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
成年大鼠脊髓神经干细胞的培养与鉴定
［ ３ １］
Ｃｏａ ， ｏ ｏｏ Ａ ， ｏ ｌ ｏ Ａ Ｃｕ ｃ ｌ ＤｉＳ ｍｍａ Ｃ ， ｔａ ． ｍ ｐ ｉｅ ａ ｄ ａ ｅ Ｉ ａｒ ｄ ｃ ｉｃ １ ｒ ｐ ｒｏ ａ ｃ ｎ ｅ ｄ ｒｙ ｐ ｔｅ ｔ ｔ ｒ ｗｔ ｏ ｏ ｅ ｄ ・ ｅ ｆｒ ｎ ｅ ｉ ｌ ｅ ｌ ａ ｉｎ ｓ ｗｉｈ ｇｏ ｈ ｈ ｒ ｎ ｅ ｍ ｍ
高峰 贺世 明 ， ， 王学廉 高国栋 ，
（． １解放军军医进修学院 ， 北京 １０ ５ ２ 第 四军医大学唐都医院神经外科 ） ０ ８３；．
［ 摘要］ 目的
从成年大鼠脊髓 中培养神经 干细胞 ， 并对 其进行 鉴定 。方 法 采用 悬浮培养 神经干 细
胞技术 ， 对成年 大鼠脊髓 组织进行 干细 胞培养， 并通过 自我增殖 实验和 免疫 细胞化 学技术进行 鉴定。结果 培养 １ ２周时 ， ～ 培养液 中即出现 神经干细胞 克隆球。该克隆球有很 强的 自我增殖 能力， 可多次传代。免疫细 胞 化学技术证明该 克隆球表达大量神经干细 胞特征 性的 中间丝—— 巢 蛋 白（ ｅｔ ） Ｎ ｓ ｎ 。结 论 正常 成年大 鼠 ｉ 脊 髓 中含 神经干细胞 ， 在体 外条件 下可大量增殖。
［］ ６
Ｃ ｅ Ｂ， ａ ｇ Ｌ， ａ ｇ Ｐ Ｉ ｓ ｌ — ｋ ｏ ｔ ａ ｔｒＩ ｈ ｎ Ｄ Ｗ ｎ Ｗ ｎ Ｈ． ｎ ｕ ｉ ｌ ｅ ｇ ｗ ｈ ｆ ｃｏ ｎ ｉ ｒ
ｒ ｔｒ ｓ ａ ｏ ｔｔｃ ｓｇ ｌｎ ｎ ｃ ｄ ｂ ｔ ａ ｏ ｉ ａ ｄｉ・ ｅａ ｄ ｐ ｐ ｏｉ ｉｎａｉｇ ｉ ｄｕ ｅ ｙ ｅ ｈ ｎ ｌ ｎ ｃ ｒ ｏ
大鼠海马神经干细胞的分离培养与免疫荧光鉴定
Ｉｏａｉ ｓ ｌ ｔｏｎ， ｕｌｕｒ ｎｄ ｉ ｃ ｔ ｅ ａ ｍｍ ｕｎｏ ｕｏ ｅ ｃ ｎｃ ｄｅ ｔｆｃ ｔｏ ｆｎｅ ｒ ｌｓｅ ｃ ｌｓｉ ａｔ ｌ ｆ ｒ ｓ ｅ ｅ ｉ ｎ ｉ ａ ｉ ｎ ｏ ｕ ａ ｔ ｍ ｅｌ ｎ ｒ ｓ ｉ
Ｃ ｅ ａ。， ａ ｇＸ ａｊ ｎ Ｚ ａ ｇＰｎ３ｅ ａ． ｈ ｎＫ ｉ Ｋ ｎ ｉｎｉ ｇ， ｈ ｎ ｉｇ，ｔ １ 一 ａ
ｐ ｏ ｅｔ ｓ ｒ ｐ ｒ ｅ ．Ｍ ｅｈ ｄ Ｔ ｉ ｓｕ ｙ ａ ｏ ｔｄ ｔ ｅ ｓ ｒ ｍ － ｒ ｅ ｃ ｌ ｒ ｏ ｉ ｅ ｉ ｈ ａ ｉ ｂ ｏ ｌ ｓ ｇ ｏ ｔ ｉ ｔ ｏ ｓ ｈ ｓ ｔｄ ｄ ｐ ｅ ｈ ｅｕ ｆｅ ｕ ｔ ｅ ｃ ｍｂ ｎ ｄ ｗ ｔ ｔ ｅ ｂ ｓｃ ｆ ｒ ｂ ａ ｔ ｒ ｗ ｈ ｕ ｈ ｉ
果
从 新生大 鼠海马齿状 回分离的细胞群可不断增殖形成细胞克隆球 ， 并且呈 ｎｓ ｎ阳性 表达 ， ｅｔ ｉ 具有多 向分化能力 。 结论
分 离培 养 的细 胞 是 中 于细胞 ； 分离培养 ； 免疫荧光鉴定
中图 分 类 号 ： ３ ３ Ｑ ４ 文 献 标 志 码 ： Ａ 文章 编 号 ：６ ４ ４ ０ ２ １ 一２ ０ ０ — ４ １７ — ９Ｘ（０ ０）０ — ０ １ ０
（ ．Ｃ ｌ ｇ ｆ Ｌ －ｃｅ ｃｓ ｅ ｅ Ｕ ｉ ｒｉ ，Ｂ ｏ ｉ ｂ ｉ０ １ ０ ；．Ｃ ｌ ｇ 厂Ａ ｒ ｕｔｒ ，Ｈ ｂ ｉ １ ｏｌ ｅ ｏ ｓｉｎｅ ，Ｈ ｂ ｉ ｎ ｅｓ ｙ ａ ｄｎ Ｈｅｅ ７ ０ ２ ２ ｏｌ ｅ Ｑ ｇｉ ｌ ｅ ｅ ｅ ｅ ｖ ｔ ｇ ｅ ｃ ｕ Ｕ ｉ ｒｉ ｛Ｅ ｇｎ ｅｉ Ｈａ ｄ ｎ Ｈｅｅ ５ ０ １ ３ Ｄ ｐ ｒｍ ｎ ｅｒｌ ｙ ｆ ｌ ｅ ｏｐｔ ｊＨ ｂｉ ｎｖ ｓ ｙ ｏ ｎ ｉ ｒ ｇ． ｎ ａ ｂ ｉ０ ６ ０ ． ｅ ａｔ ｅ ｔｏ Ｎ ｕｏ ｇ，Ａｆ ｉ ｄ Ｈ ｓ ｉｌ０ ｅ ｅ ｅ ｔ ｅ ｎ ｆ ｏ ｉ ￣ ａ
大鼠胎脑神经干细胞的培养分化及鉴定的实验研究
胚胎神经干细胞 的体外培养体 系， ５ 的胎牛血清诱 导神经 干细胞分 化 ， 免疫荧 光染色技 术进行 对神经 用 ％ 用 千 细胞及诱 导分化 细胞 的鉴定 。结果 原代培 养 的神 经干细 胞折光性 强 ， 养第 ２ 培 ｄ开始 形成 细胞集 落 ， 第 ３ 形 成大的神经球。３～ ｄ ５代传代 的细胞 生长稳定 。经胎 牛血清诱导后第 ３ ｄ开始 ， 神经球开始 向周边发 出突 起， 悬浮 的细胞开始贴壁生长 。原代及传代培养的神经球表达 Ｎ ｓｎ阳性 ， 化细胞分别 表达 Ｎ Ｅ Ｇ Ａ ｅｔ ｉ 分 Ｓ 、 Ｆ Ｐ和 Ｇ Ｌ Ａ Ｃ阳性。结论 应用无血清培养技术可在体外培养 、 扩增 出神经 干细胞 。５ ％的胎牛血清可以诱 导神经干
Ｅｘｐ ｒｍ ｅ ａ ｔ ｄｙ ｏ ｕｌｉ ａ ｉｎ ， ｄ ｆｅ ｅ ｉ ｔｏ ｎｄ ｉ ｎｔｆｃ ｔｏ ｎ ｆ ｔ ｌｒ ｔ ｅ ｒ ｌ ｅ ｉ ｎｔ ｌｓ ｕ ｆ ｃ ｔｖ ｔｏ ｉｆ ｒ ｎｔａ ｉ ｎ ａ ｄｅ ｉ ａ ｉ ｎ ｉ ｅ ａ ａ ｓ ｎ ｕ ａ ｉ
ｓ ｍ ｅ ｓ Ｉ ｉｎｘ Ｗ ＮＧＸ ａ ｎ ， Ｈ Ｎ ｏｇｊｎ ｅ ａ． ｅａｔ ｅｔｆＮ ｕｏｕｇ ｒ ， ｅ ｔ ｃｌ ＵＪａ —ｉ Ａ ｉｏ ｇ Ｚ Ａ ＧＲ ｎ － ， ｔ １Ｄ ｐ ｒ ｎ ｅｒ ｒｅ ｔ ｅ ｌＬ ｎ， ｕ ｍ ｏ ｓ ｙｈ
豫 Ｈ ｓｉ ｌ Ｐ ． ａｊ ７ １０ ． ｈｎ ｏ ｔ Ｂ ｏ ２ ０ ４ Ｃ ｉａ ｐａ ｏ ｆ ｉ
ｆｅ ｄ ｕ ， ５ ｒ ｅ ｍｅ ｉ ｍ ％
ｏ ｈｅ ｗｏ ｂ ｖｎ ｓ ｒ ｍ ｗａ ｕｓ ｄ ｏ ｄｆｅ ｅ ｔａｉｎ．Ｉ ｆ ｔ ｍｂ ｏ ｉｅ ｅ ｕ ｓ ｅ ｆ ｒ ｉ ｒ ｎ ｉｔｏ ｆ ｍｍｕ ｅ ｌｕ ｒ ｓ ｅ ｃ ｎ ｆ ｏ ｅ ｃ ｎ ｅ
神经干细胞体外培养技术
神经干细胞体外培养与鉴定一前言神经干细胞(Neural stem cells, NSC S)是神经系统内能产生神经元和胶质细胞的未分化原始细胞【1-2】。
文献报道，NSC具有无限增殖、自我更新和多向分化能力，在适宜的环境条件下，能分化形成各种靶组织细胞【3-5】。
此外，NSC 还可用作为是细胞移植治疗的有效载体，被广泛用于神经疾病细胞或载体治疗。
根据目前的研究结果，其主要作用包括下列三方面：①NSC分化成宿主细胞来替代丢失细胞的作用；②分泌多种细胞因子发挥生物学功能；③桥接作用【6-8】。
基于NSC的上述特性，从而奠定了NSC在细胞替代治疗中有广泛应用前景，而如何获取NSC则是科学研究和临床实践中首先面临的关键问题。
本实验拟建立绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）转基因小鼠NSCs原代和传代培养技术，为后面的实验提供方法支持。
二实验所需仪器、试剂及其配制（一）实验仪器光学显微镜（Olympus,Japan）倒置荧光显微镜（LEICA DMIRB）冰冻切片机（Leica CM1900，Germany）光明DZKW型电热恒温水浴锅（北京市光明医疗仪器厂）XK96-A快速混匀器（姜堰市新康医疗器械有限公司）HT-200 电子天平（成都普瑞逊电子有限公司川制）FA1004型精密电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)MP 8001单臂脑立体定位仪(深圳市瑞沃德科技有限公司)10μl微量进样器（Pressure-Lok，PRECISION SAMPLINGCORP，BATON ROUGE，LOUISIANA，Made in USA）0.5ml、1ml Eppendorff管（Ependorff）手术器械：眼科剪、解剖剪、显微剪、显微有齿镊及无齿镊、蚊式钳、刀柄刀片等。
（二）试剂1. DMEM/F12，Hank's液（Hyclone），N2（Gibico），bFGF（Invitrogen）。
胚胎大鼠神经干细胞的分离培养及鉴定研究
ｔ ｄ ｐ ｓｔｖ １ ｔ ｈ ｘ ｅ ｔｏ ｎ ｌｍ ｍａ ｉ ｎ Ｔｈ ｏ ｅ ｓ ｖ ｒ ｅ ｒ ａ ｌ ｒ ， ｈ ｒ ｉ ｈ ｒｔ ｅ １ｖ ｌｏ ｅ ｏ ｉｉ ｅｙ ｗｉ ｔ ｅ ｅ ｔ ｎ ｆｉ ｆａ ｈ ｔ ． ｅ ｍ ｒ ｅ ｅ ｅ ｈ ａ ｔ ｆ ｉ ｅ ｔ ｅ ｍｏ ｅ ｈ ｇ ｅ ｈ ｅ ｅ ｆ ｏ ｕ
孔 令 胜 张 军 臣 张 冉 赵 万 巨 邵 彤 杨 全 祥
（ 宁 医 学 院 附属 医院 ） 济
提 法
要 目的 建 立胎 鼠神经 干细胞体 外培 养方 法并 鉴定神 经 干 细胞 ， 观察神 经干 细胞 生 长特 点。方
采 用含碱性 成 纤维细胞 生长 因子和表 皮生长 因子 的无血 清培养基 对 大鼠胚 胎 间脑组 织细胞 悬液进 行培 分 离培 养 出了大量具 有不 断增殖 的能力 、 达神 经巢蛋 白的神 经干 细胞 ， 能经过诱 导分化 为神 经元 和神 表 并
探 索神 经系统疾 病新 的治疗方 法 。我们 采用无 血清 培养 、 细胞克 隆技术 及 免 疫 细胞 化 学分 离 并 鉴定 单 神经干 细胞 ， 为进 一步研究 Ｃ ＮＳ疾病 的发病 机制和 治疗手段 提供理 论和物 质基础 。
１ 材 料 与 方 法
实验 动物 ： 孕 １ ｄ的 Ｓ ｒｇ ｅＤ ｗ ｅ （ Ｄ） 受 ４ ｐ ａ ｕ ａ ｌｙ Ｓ 胚 胎大 鼠由我校实 验动物 中心提 供 。 主 要 试 剂 ： ＭＥ Ｆ ２（ ： ）培 养 基 （ — Ｄ Ｍ／ ｔ １ １ Ｈｙ
第 ３ ｚ卷第 ２期
Ｖｏ ． ２， ． Ｉ ３ Ｎｏ ２
济 宁 医 学 院 学 报
Ｊ ＯＵＲＮＡＬ ０Ｆ ＪＮＩ ＤＩ Ｉ ＮＧ ＭＥ ＣＡＬ Ｃ Ｌ Ｇ ０Ｌ Ｅ Ｅ
大鼠胚胎神经干细胞的分离、培养和鉴定
２ 结 果
血 浆 ｔ Ａ、 ＡＩｌ 原 含 量 检 测 见 表 ｌ — Ｐ —抗 Ｐ 。观 察 组 血 浆 ｔ Ａ — Ｐ 含量 低 于 对 照 组 （ ｏ ０ ） Ｐ — 量 显 著 高 于 对 照 组 （ Ｐ＜ ． ５ ． ＡＩ ｌ含 Ｐ＜
０． ０５） 。
本文结果表明 ． 急性 脑 梗 死 患 者 血 浆 ｔ Ａ 含 量 降 低 ， ＡＩ — Ｐ Ｉ — ｌ 含 量 升 高 ， 内纤 溶 活 性 低 。 提 示 临 床 上 可 用 ｔ Ａ、 Ａｌ 体 — Ｐ 一 Ｐ １的含 量作为判断急性脑梗死患 者纤溶 活性 ， 指导 治疗的参考 指标之
一
０
表 ｌ 两 组 血 浆 ｔ Ａ、 ＡＩ 含 量 比较 （ ± ｓ — Ｐ Ｐ — ｌ ）
参 考 文 献
［ ３ Ｌ ｓ ａｚ Ｂｒｕ １ ｏ ｃｌｏＪ， ａ ｎｗａｄ Ｅ． ｓ ｕ ｌｓ ｉｏ ｅ ｃｉａ ｏ （ ］． Ｅｎ ｉ ｌ Ｔｉｓ ｅｐａ ｍ ｎ ｇ ｎ ａ ｔｖ ｔ ｒＪ Ｎ ｇ
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３ ・ ４
中国塞旦 神经疾病杂志 ２０ 年 １ 月第 ９ ０６ １ 卷第 ６ 期 Ｃ ｉ ｓＪｕｎｌ ｆ ｒｃｃｌ ｅ ｏｓ ｉ ａ ｓ ｏ．０６Ｖ Ｉ ｏ６ ｈ ｅｅ ｏｒａｏ Ｐａｔａ Ｎ ｒ ｕ ｓ ｓ ｖ２０ ， ｏ ９Ｎ ． ｎ ｉ ｖ Ｄ ｅｅＮ ．
显示 ． 性脑梗 死 患 者血 ｔ Ａ 明显 低于 对照 组 （ 急 — Ｐ Ｐ＜ ０ ０ ） ． ５ 而
１２ 标 本 制 备 所 有 实 验 对 象 人 院 第 ２ ． ｄ空 腹 、 卧 静 息 平 １ ｒ ｎ后 采 集 ， 血 中尽 量 减 少 静 脉 压 迫 时 间 。 血 液 标 本 按 ０ｉ ａ 采 ｌ： 抗 凝 （ ０ １Ｍ 枸 橼 酸 钠 ０ ２ ＋ 血 液 １ ８ ） 按 ３０ ｒ ９ 即 ．３ ． ｍｌ ． ｍ１。 ０ ０／ ａ ｎ离 ｒｉ 心 １ ｒｉ， 分 离 血 浆 放 人一Ｏ ５ ｎ取 ａ ８ ℃超 低 温 冰 箱 保存 。 １ ３ 检 测 方 法 及 试 剂 采 用 Ｅ ｌＡ 定 量 测 定 ｔ Ａ、 Ａｌ ． ＬＳ — Ｐ 一 Ｐ １水 平 ， 剂 盒 购 自美 国 诊 断 试 剂 公 司 （ Ｄ。 操 作 过 程 严 格 按 照 试 ＡＤ 药盒 说 明 书进 行 。 １４ 统 计 学 处 理 采 用 Ｓ Ｓ １． ． Ｐ Ｓ ０ ０统 计 软 件 进 行 两 样 本 均 数 比较 的 ｔ 检验 ， ＝０ ０ “ ．５作 为检 验 水 准 ， 据 以 均 数 ±标 准 差 （－ 数 Ｘ ± ｓ表 示 。 ）
人胚脑组织干细胞的分离、培养与鉴定
人胚脑组织干细胞的分离、培养与鉴定神经干细胞（neural stem cells, NSCs）是一种具有自我更新及广泛分化潜能的细胞，它处于分化的非终末状态，可通过对称或不对称分裂出新的干细胞或分化潜能逐渐变小的子细胞，终于产生中枢神经系统的三种主要细胞，即神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。
采纳无血清培养和单细胞克隆法可从人胚脑皮层中分别得到具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞，并采纳免疫荧光染色对其举行鉴定。
【材料】 1．组织来源胚龄10周自然流产的人胚胎。
2．培养用试剂（1）无钙镁PBS (CMF-PBS )。
(2）消化液：0.25%和0.02% EDTA混合消化液。
3．培养基配方和制备（1)人胚脑组织干细胞培养液：DMEM/F12 (1：1)无血清培养基，含有2% B27,20ng/ml表皮细胞生长因子（epidermalgrowth factor, EGF) ,20ng/ml bFGF。
(2）人胚脑组织干细胞诱导培养液：添加20％的DMEM/Fl2 (1：1)。
4．试验器材眼科直剪、眼科直镊、眼科弯镊、玻璃平皿、200目尼龙滤网、50ml和15ml离心管、手术刀片。
【办法】 1．取材无菌条件下分别出胚胎大脑皮质组织，剥除脑膜及表面血管，在PBS液中漂洗3次。
在含有DMEM/F12的培养液中，用眼科剪将其充分剪碎。
2．消化用0.25%和0.02% EDTA混合消化液消化细胞团5分钟，吸管将细胞团打散，加入含10% FBS的培养液终止反应。
3．分别细胞将细胞悬液移入离心管中，1000r/min离心5分钟，弃上清液。
用巴斯德吸管反复吹打组织碎块至彻低散开，离心洗涤后吹打制成细胞悬液，经100目不锈钢滤网过滤，制成单细胞悬液。
4．接种与培养细胞计数，将细胞以2x106/ml密度接种至培养板上。
置37℃,5% C02饱和湿度的孵箱中培养。
直至NSCs增殖形成神经球后再换液。
首次传代后每3天半量换液。
成年小鼠海马区神经干细胞的分离 培养及鉴定
成年小鼠海马区神经干细胞的分离
朱 欢
培养及鉴定
唐金 熹 李 云 秦琬 莹 王 晓侠 伍 学恒 刘 晓灿 杨 柳 广 西 师范 大学 生命科 学 学院 ，广 西 桂 林 ５ ４ １ ０ ０ ４
摘 要 ： 目的 ：从 成 年 小鼠 海 马 区分 离 出潜 在 的 神 经 干 细 胞 （ ｎ ｅ ｕ ｒ ａ ｌ ｓ ｔ ｅ ｍ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ，Ｎ Ｓ Ｃ ｓ ） 亚 群 ， 同 时建 立 一种 简 单 有 效 的成 年 小鼠海马 区神经干细胞 的分离、培养及鉴定的方法。方法：结合酶消化法和机械 吹打法从 Ｃ ５ ７ ／ Ｂ ６小鼠脑 组织海马 区分 离出神 经细胞 ，行 Ｃ Ｄ １ ３ ３和 Ｇ Ｆ Ａ Ｐ抗体 染色，经流式细胞分选仪 分选 出 Ｃ Ｄ １ ３ ３ ＋ Ｇ Ｆ Ａ Ｐ ＋ 细胞 群 ：经无血 清培 养鉴定其体 外 自我更新与增 殖 能力 ： 用免 疫 荧 光 法鉴 定 其 体 外 分 化 潜 能 。结 果 ：从 成 年 小 鼠 海 马 区分 离 出 了一 群 可 以体 外 增 殖 的 Ｃ Ｄ １ ３ ３ ＋ Ｇ Ｆ Ａ Ｐ ＋ ￣胞 群 ， 且 该 群 细 胞 在 体 外 可 以分 化 为 Ｂ…－ ｔ ｕ ｂ ｕ ｌ ｉ ｎ阳性 神 经 元 （ ｎ ｅ ｕ ｒ ｏ ｎ ） 、Ｇ Ｆ Ａ Ｐ阳性 星形 胶 质 细胞 （ ａ ｓ ｔ ｒ ｏ ｃ ｙ ｔ ｅ ）和 Ｍ Ｂ Ｐ阳性 少 突胶 质细胞 （ ｏ Ｉ ｉ ｇ ｏ ｄ ｅ ｎ ｄ ｒ ｏ ｃ ｙ ｔ ｅ ） 。结论 ：Ｃ Ｄ １ ３ ３ ＋ Ｇ Ｆ Ａ Ｐ ＋ ￣胞 群具有体 外增殖 与分化 的能力，是一群真正的神经干细胞亚群 ，并建 立 了稳 定 且 简便 的 分 离 、 培 养 及 鉴 定 成 年 小 鼠 脑 海 马 区神 经 干 细 胞 的 方 法 。 关 键 词 ：神 经干 细胞 ：海 马 区 ；增 殖 ；分 化
人胎脑神经干细胞的体外分离、培养与鉴定
【ｂｔ ｃ ０ ｊｃｉ ｏｅｐｏ ｅｍ ｔ ｄ ｏ ｉ ｌ ｉ ， ｕ ｉ ｔｎａｄｄ ｆ ｅｔ ｔｎｏ ｕ ａ ｔ ｅｒｌ ｔ ｅ ｓ Ａ ｓ ａｔ ｂｅｔ ｅ ｘｌ ｅｔ ｅ ｏｓ ｆｓ ａ ｏ ｃｌ ａｏ ｎ ｉｅ ｎａ ｏ ｆ ｍ ｎｆａ ｎｕａ ｓ ｍ ｃｌ， ｒ 】 ｖＴ ｒ ｈ ｈ ｏ ｔ ｎ ｔ ｉ ｖ ｆ ｒ ｉｉ ｈ ｅｌ ｅ ｌ
ｓｒｍ ｆ ｅｍｅ ｉｍ ｃｎａｎｎ ａｉ ｆ ｒｂａｔ ｒｗｈｆｃ ｒ （Ｆ ） ｎ ｐｄ ｒ ｌ ｒｗ ｈｆｃｏ （Ｇ ） ａ ｓｄｔ ｕ— ｅｕ ｅ ｄｕ ｏ ｔｉｉｇｂ ｓ ｂｏ ｌｓ ｇｏ ｔ ｔ ｈ ＧＦ ａ ｄｅ ｉｅｍａ ｇｏ ｔ ａｔｒ Ｅ Ｆ ｗ ｓｕｅ ｏｅｌ ｒ ｃｉ ａｏ
Ｆ Ｎ ｉｇ ＨＵＱｎｆ Ｙ Ｎ Ｇ ｏａ Ｃ Ｅ ｉ ｈｎ Ａ Ｇ Ｑｎ Ｚ ｉ ｅ ｇｎ ｌ ｕｃｉ Ｈ ＮＸｎ ｅ￣ ２ ｓ
１Ｄｅ ａ ｔ ｎ ｆＮｅ ｒｓ ｒｅｙ Ａｎ ｉ ｇＨｏ ｐｔｌＡｆｉ ａｅ ｏＡｎ ｕ ｄｃ ｌＵｎ ｖ ｒｉ ，Ａｎ ｕ ｒｖｎ ｅ ． ｐ ｒｍｅ ｔｏ ｕ ｏ ｕ ｇ ｒ ， ｑ ｎ ｓ ｉ ｆ ｉｔｄ ｔ ｈ ｉＭｅ ｉａ ｉｅｓｔ ａ ｌ ｙ ｈ ｉＰ ｏ ｉｃ ，Ａｎ ｉ ｇ ２ ６ ０ ， ｑ ｎ ４ ０ ３
Ｃｈ ｎ ； ． ｐ ｒｍｅ ｔｏ ｉ ｃ ｅ ｃ ｓ ｉ ａ ２ Ｄｅ ａ ｔ ｎ ｆＬ ｆ Ｓ ｉｎ ｅ ，Ａｎ ｉ ｇ Ｎｏ ｍａ ｉ ｅ ｓｔ ，Ａｎ ｕ ｏ ｉ ｃ ， ｑ ｎ ２ ６ ０ ， ｉ ａ ｅ ｑ ｎ ｒ ｌＵｎ ｖ ｒ ｉ ｙ ｈ ｉＰｒ ｖ ｎ ｅ Ａｎ ｉ ｇ ４ ０ ３ Ｃｈ ｎ
２２ ９第 卷 ２ ０年 月 ９ 第７ １ 期
・论
著 ・
人胎脑神 经干细胞 的体外 分离 、 养 与鉴定 培
新生树鼠句海马神经干细胞的体外培养与鉴定
【 ｂｔ ｃ】 Ｏ ｊｃ ｖ Ｔ ｖｓｇｔ ｔ ｏ ｔｎｃｌ ｒ ａｄｉ ｎｆ ａｏ ｆ ｅｒ ｔ ｌ （ Ｓ ｓ ｒ Ａ ｓ ａｔ ｒ ｂｅｔ ｅ ｏ ｎｅ ｉ ｅ ｈ ｉ ｌ ｉ ｔ ｅ ｎ ｅｔｉ ｔ ｎｏ ｎｕ￣ｓ ｍ ｃ ｌ Ｎ Ｃ ）ｆｍ ｉ ｉ ｔａ ｅ ｓ ａｏ ｕ ｕ ｄ ｉ ｉ ｃ ｅ ｅｓ ｏ
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广西医学 ２１ 年 ３ ０２ 月第３ 卷箜 ４
２５ ７
● 论著
新生树晌 海马神经干细 胞的体 外培 养与鉴定 ▲
昊元桢 欧 阳轶 强 黄 玲 杨桥樱 黄世 文 陆彩玲 蒙智娟 何 以源 郭松超
（ 广西医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室 ， 南宁市 ５０ ２ ；－ ａ ： ７４ ９７ ｑ ｃｍ ３０ １Ｅｍ ｉ ３ ２ ０６ ＠ｑ ．ｏ ） ｌ９
ห้องสมุดไป่ตู้
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干细胞培养与鉴定
37
ESC（胚胎干细胞）鉴定检测
• 染色体结构
核型分析：正常稳定的二倍体核型，小鼠（40， XX/ XY) 。
不随传代次数而改变。
38
ESC（胚胎干细胞）鉴定检测
• 核型分析：显色技术
小鼠ES核型分析：40，XY
39
ESC（胚胎干细胞）鉴定检测
• 全能性
体内分化：畸胎瘤实验 体外分化：EB（拟胚体）形成实验
• 细胞汇合度的判断
• 传代消化时间的控制 • 接种密度的控制
培养体系的选择
12
扩增传代-细胞汇合度的判断(MSC)
13
扩增传代-消化时间的控制(MSC)
细胞消化15s
细胞消化35s
细胞消化55s
14
扩增传代-接种密度的控制
不同物种、细胞类型之间接种密度有差异
MSC、ADSC：2×104/cm2~4×104/cm2
43
培养体系的选择
干细胞的研究和利用过程中，最主要的提供最适生长环境，保持培养开始时细胞群 体的状态，这就要求培养条件始终如一，近乎呆板地坚守细节和常规。
44
干细胞饲养员必备素质-细节决定成败
无菌意识，重中之重
• 规范化的无菌操作
超净台取用物品摆放、操作时细节问题 • 环境的控制
培养箱的定期消毒、水浴锅定期换水、大环境的控制等
解析：干细胞的培养与鉴定
产品经理：施真
主要内容
1. 干细胞原代提取及鉴定
2.干细胞培养体系与操作细节的重要性 3.OricellTM系列干细胞产品及售后服务
2
原代培养过程
3
原代取材
组织来源（个体年龄、健康状况）
BMSC、ADSC：成人（18-45周岁）、大鼠和小鼠（4周龄）、兔和狗（1-3 周龄） NSC：大鼠（孕龄14.5天的胚胎）；小鼠（孕龄12.5天的胚胎） ESC：小鼠（见栓后3.5天的孕鼠）
胚鼠神经干细胞培养与鉴定
【 ｅ ｒ 】Ｎ ｕ ｌｔ ｅｓ ｂＧ ；Ｐｏｆ ａｏ ；Ｒ ｔ Ｋ ｙＷｏｄ ｅｒ ｅ ｃｌ ‘ Ｆ Ｆ ｒｌ ｒ ｉ ａ ｓ ｍ ｌＩ ｔ ｉ ｔｎ ａ ｅ
神 经 干 细 胞 （ ｅｒｌ ｔｍ Ｃ ｌ Ｎ ｕａ ｓ ｅｌ Ｓ ｅ ，Ｎ Ｃ） 是 神 经 系统 的 祖 细 胞 。 胚 胎 早 期 ，脑 内 存 在 大 量 Ｎ Ｃ ， Ｓ 随 着年 龄 的增 长 ，此 细 胞 越 来 越 少 ，逐 渐 分 化 为 神 经 细胞 和 神经 胶 质 细 胞 。 大量 的 实验 结 果 显 示 ，在 ｂＧ Ｆ Ｆ作 用 下 ， Ｎ Ｃ 能 分 裂 增 殖 ， 产 生 大 量 的 Ｓ Ｎ Ｃ 。本 实验 应 用 ｂ Ｇ Ｓ Ｆ Ｆ作 用 于 ｌ ２胚 鼠脑 组 织 ， 获得 大 量 的 Ｎ Ｃ，为治 疗 神经 退行 疾 病 打基 础 。 Ｓ
取 妊 娠 １ 天 母 鼠 ３ 只 ， 乙 醚 麻 醉 后 放 人 ７ ％ ２ ５ 酒 精 中 ，无菌 取 出 １ ２天 胚 鼠 ，取 脑 组 织 ， 用 Ｈａ ｋｓ ｎ
液 洗 ３次 ， 剪 刀 剪 碎 ，加 人 Ｏ １ ５ ｆｙ ｓｎ ７ ，３ ． ２ ％ ｒｐ ｉ３ ０
分 钟 。 用 ｌ ％ Ｆ Ｓ 中 止 反 应 ， ｌ０ ｒｍ， 离 心 ０ Ｃ Ｏ０ｐ ｔ ｍｉ ，去 上 清 。 加 人 ０ Ｏ ％ Ｄ Ａ 酶 ，吸 管 吹 打 ， Ｏ ｎ ．Ｉ Ｎ 尼 龙 网 过 滤 ，ｌ０ ｒｍ，５ ｎ离 心 ， 去 上 清 。 加 人 Ｏ ０ｐ ｍｉ Ｄ Ｍ Ｆ ２制成 细胞 悬 液 。按 ４ ０／ 接种 到培 养 ＭＥ ／ Ｉ Ｘ１ 瓶
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胚胎脊髓神经干细胞的培养和鉴定
育 以及 脊髓损 伤 后 的治 疗提 供 了一种 新的 细胞 来 源。
・对 脊髓 源 性 神 经 干 细 胞 的迁 移 、增 殖 、分 化及 其
调 控 的 研 究将 有 助 于 阐 明脊 髓 的形 成 机 制 。 ・在 脊 髓 组 织 中 ＿ 在 不 同 种 类 及 功 能 的 神 经 元 ， 何 存 如 将 脊 髓 来 源 的 神 经 干 细 胞 定 向诱 导 分 化 为 某 种 特 定 功 能
维普资讯
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中 国临 床 康 复 ２ ０ ０ ２年 ｌ 月 第 ６卷 第 ２ Ｊ ２期 Ｃ ｉｅｅＪｕｎｌ ｆ ｌ ｉａ Ｒｅａ ｉｔｔ ｎ Ｎ ｖｍｂ ｒ ０ ２ Ｖｏ ６ Ｎｏ２ ｈｎｓ ｏｒａ ｏ ｉ ｃｌ ｈｂｌａｉ ， ｏｅ ｅ ０ ， ｌ ． ．２ Ｃｎ ｉ ｏｍｏｎ —ｌ ｎ ｎ ｅ ｈｎ ｌｇ ．ｗｅ ａ ｑｕ ｒｄ ｃ ｌｎｅ ｄ ｉ ｕ ｅ ｈ ｍ ｏ ｄｉ ｅｅ ｉ ｉｎ， ａ ｈｅｓ ｇｅ ｔｍｅ ，ｉ ｏ ｃｏ ｉ ｇ ｔｃ ｏｏ ｙ ｃ ｉｅ ｍｕ ｈ ｃｏ ｓａ ｎｄ ｃ ｄ ｔｅ ｔ ｆ ｒｎｔ ｏ ｎ ｆ ａｔ ｔｔ ａｌ ｉ ｌ ｍｍｕｎ ｃｙｏ ｅｍｉｔｙ ｏ ｔｃｈ ｓｒ ｗａ ｅ ｔ ｄｅ ｉｙ ｔｅ ｃ ｏ ｅ ｄ ｔ ｉ ｅｒｎｔ ｔｄ ｅｉｓ Ｒｅ ｕｌｓ Ｔｈ ｅ ｌ ａ ｔｏ ｉｉ ｏ ｓ ｆ ｒ ｅ ｄ ｓ ｏ ｄ ｐ ｓ ｔ ｅ ｒａｃｉ ｎ ｔ ｓ ｕｓｄ ｏ ｉ ｎｔ ｈ ｌ ｎ ｓａ ｈｅ ｄｆ ｅ ｉ ｅ ｃ ｌ ． ｆ ｎ ａ ｓ ｔ ｅ ｃ ｌｓｈ ｄ ｓｒｎｇａｂｌｔ ｔ ｅＩ－ｅｎ ｗ ａ ｈ ｗｅ ｏ ｉ ｖ ｅ ｔｏ ｏ ｙ ｎ ｉ Ｎｅ ｔｎａｎｉ ｅ ， ｆ ｒｈ ｒｍｏ ｅ ｔｅ ｕｄ ｄｉｆ ｅ ｉｔ ｎｔ ｅ ｒ ｎ ， ａ ｔｏ ｙ ｅ ｄ ｏ ｉｏ ｅ ｄｒｃｙｅ ．Ｃｏ ｈ ｓｏ ｓｉ ｔｇ ｎ ｕ ｔ ｅ ｒ ， ｈ ｙｃｏ ｌ ｆｅｒｎｔ ｅｉ ｏ ｎ ｕ ｏ ｓ ｓｒｃ ｔｓ ａ ｌｇ ｄ ｎ ｏ ｔｓ ａ ｎ ｎｃ ｉ ｎ Ｔｈ ｅｌ ａ ｅ ｔｅ ａ ｉｉｙｔ ｅ ｃ ｌｓ ｈ ｖ ｈ ｂｌｔ ｏ ｓ Ｉ－ｅ ｗ ａ ｄ ｒ ｕｔｐ ｅ ｔ ｗｈｃｈ ａ ｅ ｎ ｕｒｌｓｅ ｃ ｌｓｄｅｉ ｅ ｆｏｍ ｐｎ ｌｃｏｄ． ｅｆｒｎｅ ｎ ａ ｅ ｍ ｌｉｏｔｎ ， ｉ ｒ ｅ ａ ｔ ｍ ｅ ｒｖ ｄ ｒ ｓ ｉａ ｒ Ｋｅ ｒ ： ｐ ｎ ｌｃ ｒ ｙ ｗｏ ｄｓ ｓ ｉ ａ ｏ ｄ；ｎ ｒ ｌｓｅ ｃｅｌ ｃ ｌｉａｔ ｎ； ｄ ｎｔ ｃ ｔｏ ｅｕ ａ ｔｍ ｌ； ｕ ｔｖ ｉ ｉ ｅ ｉ ａ ｉｎ ｏ ｉ ｆ
神经干细胞的鉴定
神经干细胞的鉴定
咱们先得知道神经干细胞长啥样呀。
它就像个神秘的小不点，隐藏在我们的神经系统里。
你想啊，要在那么复杂的神经系统里把它找出来，就像在大海里捞针一样。
不过呢，科学家们可有办法啦。
有一种鉴定方法是看它的形态。
神经干细胞呀，长得有点像那种圆圆的小豆子，但是又有点不规则，就好像是小朋友捏出来的不太规则的泥球。
它的大小也很特别，不大不小，刚刚好就在那个范围里，就像为了让我们能找到它而特意设计的大小似的。
还有就是看它的功能啦。
神经干细胞就像是一个小小的魔法工厂。
它能分化呢，就像孙悟空的七十二变一样。
可以变成各种各样的神经细胞，像神经元啦，神经胶质细胞之类的。
这可不得了，就好比一颗种子能长出各种各样的花朵一样神奇。
从它的表面标志物来看，这就像是它的身份证一样。
每个神经干细胞都有自己独特的表面标志物。
这就方便我们把它从一堆细胞里挑出来啦。
就像在一群小动物里，根据它们独特的花纹或者颜色就能认出谁是谁一样。
再说说它的增殖能力吧。
神经干细胞增殖起来可积极了，就像勤劳的小蜜蜂一样。
它不断地分裂，产生更多的自己，这样才能保证我们的神经系统有足够的细胞可以用呀。
虽然神经干细胞的鉴定听起来很复杂，但科学家们怀着对未知的好奇和探索的热情，一点点揭开它神秘的面纱。
每一次新的发现都像是打开了一扇通往新世界的小窗户，让我们能更好地了解自己身体里这个奇妙的小世界。
这就是神经干细胞鉴定的那些事儿啦，是不是很有意思呢？。
新生大鼠神经干细胞的体外培养和鉴定
一
１ １ ３ ４一
重庆 医科大学学报 ２ ０ ０ ７年第 ３ ２卷第 １ １ 期 （ Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｃｈ ｏ ｎ ｇ ｑ ｉ ｎ ｇ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ２ ０ ０ ７ ． Ｖ Ｏ １ ． ３ ２ Ｎ Ｏ ． ｉ ｉ ）
【 摘
要】 目的 ： 探讨新生大 鼠神经干细胞的分离培养和鉴定 。 方法 ： 采用无血清细胞培养技术 ， 间接免疫细胞化学染色法。 结果：
新 生大 鼠脑组织分离 的细胞具有连续传代和增殖 能力 ， 表达 神经 上皮 干细 胞蛋 白， 诱 导分化后的细胞表达神经元细胞 、 星形胶 质细胞 、 少突胶质细胞特异性蛋 白。 结论 ： 该方法分离培养的神经干细胞保持 了干细胞 的未分化属性 ， 具有 自我更新和 多项分化
潜 能。
【 关键词 】神经干细胞 ； 细胞培养 ； 新生大 鼠 【 中国图书分类法分类号 】 Ｒ ３ ２ ９ ． ２ 【 文献标识码 】 Ａ 【 收稿 日期 】 ２ ０ ０ ７ — ０ ３ — ０ ７
Ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ｃ ｕ ｌ ｔ ｉ ｖ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｎ ｅ ｕ ｒ ａ Ｉ ｓ ｔ ｅ ｍ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｉ ｎ ｎ ｅ ｏ ｎ ａ ｔ ａ Ｉ ｒ ａ ｔ ｓ ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ
ｆ ｅ ａ ｔ ｕ ｒ ｅ ｓ ａ ｎ ｄ ｈ ａ ｖ ｅ ｔ ｈ ｅ ｃ ａ ｐ ａ ｃ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ ｓ ｅ ｌ ｆ － ｒ ｅ ｎ ｅ ｗａ ｌ ， ｐ ｒ ｏ ｌ ｉ ｆ ｅ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ｐ ｌ ｕ ｒ ｉ ｐ ｏ ｔ ｅ ｎ ｔ ｉ ｌｉ ａ ｔ ｙ ．
新生大鼠海马神经干细胞的分离培养及鉴定
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．1神经干细胞的原代培养
1)在无菌工作台上取24小时新生SD大鼠4只，乙醚气体麻醉后(也
可无需麻醉)，用酒精消毒皮肤。
2)无菌工作台中，用带有无菌手套的左手拿握住消毒后的新生大鼠，
充分暴露头部，右手使用已灭菌后的眼科剪打开新生大鼠脑部，按无菌操
作规则断头取脑，PBS漂洗3次后，用D．Hanks液漂洗1次，在解剖显
微镜下切取前脑侧脑室周围脑组织(含海马)，仔细剔除脑膜和血管等结缔
组织后，放入D．Hanks液中冲洗。
．3)在无菌工作台上，用眼科剪将脑组织剪碎至大约0．5mm2的小块，
用吸管反复轻柔吹打成细胞悬液。
收集细胞悬液后先后在100目和200
目铜网上过滤，从而获得单细胞悬液。
4)细胞计数：用O．4％台盼蓝与细胞悬液按比例均匀混合，血球计数
板在显微镜下计数台盼蓝呈阴性的活细胞，小细胞团按单个细胞计数。
5)细胞计数后，放入50ml一次性培养瓶中培养(4～5)x105个活离的细胞(已经凋亡或者其它细胞)无需胰蛋白酶消化液消化剥离，培养期间密切观察细胞生长情况。
(无血清条件培养液有能刺激NSC分裂增殖的细胞因子，所以只有NSC能存活)
．2神经干细胞的传代
大鼠脑NSC在培养2．-一3d成云雾状，不规则的球形细胞团，4---，6d
后成为悬浮生长的神经球。
将悬浮细胞液吸出，采用1000r／min离心
5min，弃上清，加入无血清条件培养基，仍用细口径直吸管吹打为单细胞
悬液，将细胞重悬，调整细胞浓度为(4～5)×105／ml，依照原条件继续培养。
同时取出部分细胞用于NSC的鉴定。
Nestin免疫组化检测步骤：
1)将分离出的部分NSC浓悬液，1000 r／min离心5 min，弃上清；
2)加入2ml配制好的4％多聚甲醛，室温固定15---，20分钟；
3)PBS浸洗3min 2次，去上清；
4)Triton液破膜10 min；
5)PBS浸洗3min洗3次，离心去上清，用残留的一滴PBS重悬细
胞，将细胞滴在涂有O．1％多聚赖氨酸处理过载玻片上。
自然干燥，让细
胞贴在载玻片上；
6)3％I-1202浸润细胞10 min灭活内源性过氧化物酶；
7)滴入正常5％胎牛血清室温封闭20min。
甩去多余液体，不洗；
8)滴加1：300稀释后的兔抗鼠单克隆nestin抗体4。
C过夜。
PBS
洗2 min 3次；
9)将抗体轻轻甩去，用PBS缓冲液加满洗涤3次，每次5min；
10)滴加第二抗体，37℃孵育40min后轻轻甩去二抗后用PBS洗涤3
次，每次5min；
11)滴加DAB显色剂后镜下控制显色1 5min，用清水终止显色；
研究论文
12)滴加苏木素复染2min后用自来水终止DAB显色，用O．5％盐酸
酒精分化5s后立刻用自来水轻柔冲洗至玻片变蓝。
13、)分别在80％、90％、无水乙醇染色缸中各蘸一下，滴加少量二甲。