神经生物学实验讲义
神经生物学实验原理与技术
神经生物学实验原理与技术神经生物学实验是研究神经系统结构和功能的重要手段，通过实验原理与技术的应用，可以深入探索神经生物学的奥秘。
本文将从神经生物学实验的原理、常用技术和实验设计等方面进行介绍。
一、实验原理神经生物学实验的原理是基于神经系统的生理学和生物化学特性，通过对神经元的功能和相互作用进行观察和测量，揭示神经系统的工作原理。
实验原理包括以下几个方面：1.1 神经元电活动的记录与分析神经元产生的电活动是神经信号传递的基础，通过记录和分析神经元的电活动，可以研究神经元的兴奋性、抑制性和调控机制。
常用的技术包括细胞外多通道记录、膜片钳技术和全细胞钳技术等。
1.2 突触传递的观察与研究突触是神经元之间信息传递的关键结构，通过观察和研究突触的功能和调节机制，可以揭示神经元之间的相互作用和神经网络的形成与发展。
常用的实验技术包括双电极记录、电压脉冲刺激和光遗传学等。
1.3 神经递质的测定与分析神经递质是神经元之间信息传递的化学信号，通过测定和分析神经递质的含量和释放机制，可以揭示神经递质在神经系统中的作用和调控。
常用的技术包括高效液相色谱法、电化学检测和光学显微技术等。
二、常用技术神经生物学实验中常用的技术包括以下几个方面：2.1 细胞培养与维持细胞培养是神经生物学实验的基础，通过培养神经元和神经细胞系，可以进行细胞生物学和分子生物学研究。
常用的细胞培养技术包括原代细胞培养、细胞系培养和共培养等。
2.2 光遗传学技术光遗传学技术是近年来发展起来的一种新型实验技术，通过利用光敏蛋白质和光源的激发，可以实现对神经元的精确激活或抑制，从而研究神经回路和行为功能。
常用的光遗传学技术包括光遗传调控和光遗传成像等。
2.3 脑电图和脑成像技术脑电图和脑成像技术可以非侵入性地观察和记录大脑的电活动和代谢活动，通过研究脑电波形和脑区的活动模式，可以了解大脑的功能状态和神经网络的连接方式。
常用的脑电图和脑成像技术包括脑电图记录、功能磁共振成像和磁脑电图技术等。
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2、神经嵴细胞固有信息与神经嵴细 胞的分化
神经嵴细胞的分化也存在内、外因两方面 的因素。真正决定嵴细胞分化大方向的仍 然足神经嵴细胞本身所固有的信息。
神经嵴细胞固有信息的表达必然受到所迁 入的微环境的深刻影响。局部微环境在引 导、加速或者逆转，抑制嵴细胞固有特征 表达的过程中有首要作用。因而，神经脊 细胞的分化方向是嵴细胞内、外因素相互 作用的结果。
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2、神经脊研究历史
像胚胎学或者发生学本身的发展历史一样，对神经脊研究 的历史也可大致分为描述胚胎学、实验胚胎学与现代胚胎 学（发育生物学）3个互相重叠的时期。
第一期是从His到1900年。主要是论证神经脊的来源与基 本衍生物。
第二时期可称作实验胚胎学时期。从1900年到上世纪60 年代。此时期证实了神经脊细胞的多潜能性，它的衍生物 在所有经典的3个胚层的衍生物中均有同源物。
有特殊的功能。从较低等的哺乳动物到灵 长类，大脑皮质的结构与功能的变化趋势 是由简单到复杂。 从大脑皮质的进化过程了解到大脑皮质的 组织发生，其中的神经元数量（尤其是中 间神经元）和神经元间局部环路显著增加 以及组织结构显得高度有序和复杂。
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大脑皮质的神经元发生部位是在脑室的生发层 ( ventricular germinal zone)，也称脑室层 （telencephalic ventricular zone，图101A)．其中的细胞称为神经上皮细胞 (neuroepithelial cell）或称为神经祖细胞 (neurogenitor cell)。大脑皮质的组织发生是通 过神经祖细胞的分裂、增生和分化过程实现的。
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5. 生物芯片技术（biochip） 生物芯片技术是在1个平方厘米大小的薄型载体上，
通过微加工技术获得微米级结构，并与生物化学处理 等技术相结合而发展起来的一种新型技术。它可以把 多至几十万个的生命信息集成在一块芯片上，进行各 种与生命科学和医学相关的生物化学反应，对基因、 蛋白、活体细胞及组织等进行分析和检测。
免疫组织化学方法—把神经元的功能与其神经递质的 分析熔为一体。
组织培养、细胞培养—把复杂的神经元回路还原成简 单的单元进行分析。
新的电生理技术和分子生物学方法（重组DNA技术等） －神经信号发生、传递的基本单元-离子通道的结构、 功能特性及运转方式；神经递质的合成、维持、释放 及与受体的相互作用。
(2) 诱发电位有一定的类型，是由于诱发电极和记录 电极记录神经元群相对位置影响电位的波形。
(四)生物化学方法
1. 放射免疫法(radioimmunoassay, RIA)
用抗原－抗体反应原理，将抗原标记上放射性同位 素，用来测定与此抗原性质相同的物质。RIA包括以下 基本步骤：样品采集、加样、反应、分离、测定抗原－ 抗体复合物的放射性（cpm）, 与标准曲线对照计算待测 物质含量。
4. 基因敲除(gene knockout) 基因敲除是80年代初出现的一项新的基因工程技术。
采用同源重组的方法,用体外合成的无效基因或突变基因取 代相应正常基因,再应用转基因方法孵育出转基因动物,即 为基因敲除动物。通过分析基因敲除动物单基因缺陷来研 究基因调控、基因功能、建立疾病模型、药物作用及基因 治疗。
液中选择性地大量扩增某一种核酸分子的特定序列。该方法 具有极高的灵敏度和特异性，在含有多种杂质的条件下，可 选择性扩增细胞基因组中一个特定的DNA片段达数百万至数 千万倍。
第五章学习与记忆的神经生物学演示文稿
第三节 学习与记忆的神经基础
一、参与学习与记忆的脑结构 （一）海马与学习记忆 （二）杏仁核和学习记忆 （三）间脑与记忆加工 （四）联合皮层与学习记忆 （五）小脑的学习与记忆功能
二、记忆的痕迹理论 三、脑的记忆系统
（一）陈述性记忆的神经回路 （二）非陈述性记忆的神经回路
（一）海马与学习记忆
（一）学习类型 （二）记忆类型
（一）学习类型
1、联想式学习（联合型学习）：指刺激和反应之间建立联
系的学习，即由两种或两种以上刺激所引起的脑内两个以上的中枢 之间的活动形成联结而实现的学习过程。
典型的联合型学习：尝试与错误学习、经典条件反射和 操作性（工具性）条件反射
2、非联想式学习：在刺激和反应之间不形成明确联系的 学习形式。 典型的非联合型学习：习惯化和敏感化。 （1）习惯化：指当一个不具有伤害性刺激重复作用时， 机体对该刺激的反射性行为反应逐渐减弱的过程。 （2）敏感化（假性条件化）：强的刺激引起一定的伤 害后，同类的弱刺激引起反应增强的现象 。
海马在学习记忆中的功能
（1）海马对建立环境的空间位置记忆有特殊 作用，
（2）海马在考察环境刺激的耦合关系中起主 要作用。
（3）海马和杏仁核是感觉体验转化为记忆的 关键部位。
（二）杏仁核和学习记忆
（1）把感觉体验转化为记忆的另一关键部位。 （2）在记忆汇合过程中有重要作用。
（三）间脑与记忆 加工
发现，损毁海马结构， 并不影响已建立的瞬膜 条件反射，但损毁小脑 皮层，则完全不可能建 立瞬膜条件反射，已训 练好的反射也会消失
二、记忆的痕迹理论
1949年，加拿大神经心理学家Hebb（赫布）提出了 记忆痕迹理论。
内容：短时记忆的脑机制是脑内神经元快速形成的反 响回路；长时记忆的生理机制可能是脑内逐渐形成的 生物化学与突触结构形态的变化。这种理论认为：短 时记忆是脑内神经元回路中电活动的自我兴奋作用所 形成的反响振荡，这种反响振荡可能很快消退，也可 能由外部条件促成脑内逐渐发生着化学的或结构的变 化，从而使短时记忆发展成长时记忆。
神经生物学实验
体激活后第二信使、G 蛋白、膜离子流、调控蛋白及
产生磷酸化和脱磷酸化等各种反应的酶变化；
图 2 LTP 电位示意图
⑶突触前或突触后结构的可塑性，包ห้องสมุดไป่ตู้突触前树突棘体积增大，数目增多 ，
突触界面扩大及突触后致密物质增大增厚等；
⑷非神经元修饰：如胶质细胞及胶质-神经元相互作用的变化；
⑸上述某些变化或所有变化的综合表现。
（蔡 葵）
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实习二 大鼠海马 LTP 的实验观察
1. LTP 的基本概念
LTP(long-term potentiation, 长时程增强), 对突触前神经元进行高频强直
电刺激后导致突触后神经元产生突触传递效应增强的现象，该效应可持续一
个小时以上，其具体表现为：
①峰电位幅值增大；
②潜伏期缩短；
③兴奋性突触后电位(EPSP)幅值增大；
兔脑：兔的头部固定在脑定位仪上时，其前囟(Bregma，即冠状缝与矢 状缝的交点)比λ(人字缝与矢状缝的交点)高 1.5mm，在这种情况下，以通过 前囟的水平面作参考平面，而以在该平面下 12mm 处的水平面作为水平标准 平面(HO, 零平面)，在此平面上方为 V+，在此平面下方为 V-。经过前囟并 与矢状缝垂直又与水平面垂直的面，作为额面标准平面(APO)，在此平面之 前为 AP+，在此平面之后为 AP-。
单管玻璃微电极是一根尖端开口很细的硬质玻璃管，内充电解质溶液作 为电极。由于电解质溶液可以导电，利用单管玻璃微电极可以记录到中枢神 经系统神经元的电活动。用于细胞内记录的微电极，其尖端直径应小于 0.5mm，尖端的倾斜度应相当缓和，以免穿入细胞膜时造成大的伤害。这种 微电极适合于从细胞内引导电活动和测量膜电位。用于细胞外记录的微电 极，其尖端直径约在 1~5mm。一般认为尖端内径 1~4mm 的玻璃微电极适宜 于记录神经元胞体的电活动。微电极的长度应视需要而定，但插入脑组织内 的部分不宜太粗，以免插入时造成显著的损伤。制作玻璃微电极应选用熔点 高，化学稳定性高，电阻率高和膨胀系数低的硬质玻璃管。国外常用 Pyrex 玻璃管，国内一般采用 GG17 和 95 玻璃管。 3.3.2 多管玻璃微电极
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多克隆抗体 （polyclonal antibody, PcAb） 大多数天然抗原物质(如细菌或其分泌的外毒素以及各种组织成分等)往往具有多种不同的抗原决定簇，而每一决定簇都可刺激机体产生一种特异性抗体。多克隆抗体是多个抗原决定簇刺激机体后，由多个免疫淋巴细胞分泌的多种抗体的混合物。 PcAb 特异性差，易出现交叉反应。
单克隆抗体 （monoclonal antibody, McAb）
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组织（细胞）化学是介于细胞学与化学之间的一门科学。细胞化学的目的是使用细胞学和化学的方法使细胞（组织）内的某些化学成分发生反应，在局部形成有色反应物，藉此对各种活性物质在显微镜水平进行定性、定位和定量分析。 酶组织化学：利用酶对底物的催化作用，使底物发生颜色变化，其次对该酶进行定位、定量分析。
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研究方法： 20世纪从40年代，镀银染色法，根据银染溃变纤维的形态变化来判断、追踪溃变纤维的方法。 20世纪从50年代，Nauta法，一种改进的溃变镀银法，能抑制正常纤维的染色而仅染出溃变纤维。 20世纪70年代，变性束路追踪法逐渐被轴浆运输追踪法所代替。 可与逆行标记法、顺行标记法、免疫组织化学、原 blue labelling neurons
DRG
Spinal cord
20×
20×
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Fast Blue Ladelling Ganglion Cells of Retina
20×
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优点：可靠性，灵敏性， 利用其不同颜色可同时追踪和显示多重神经联系。因此可选择一种或两种以上的荧光素分别对神经元进行单标、双标或多重标记。 双重标记和多重标记可用来研究神经元轴突的分支投射。若在脑内不同核团或区域分别注射两种（或三种）不同荧光，在同一神经元胞体内能观察到两种（或三种）不同颜色的荧光，即说明该神经元的轴突分支分别投射到注射这些荧光剂的两个（或三个）脑内不同核团或区域。 需要注意的是各种荧光素逆行运输的速度不同，所以动物存活时间也有差异。双重标记是，有时需要做两次手术先注射运输慢的荧光素，过一定的时间后，再注射运输较快的荧光素。 缺 点：激发光照射下很快褪灭，因此允许观察的时间较短，保存时间也有限。 应 用：研究神经元的轴突分支至不同部位的投射。可与免疫组织化学结合，研究投射神经元的化学性质。
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神经⽣物学实验讲义实验⼀⿏脑灌注固定和取材⼀、原理固定是⽤⼈为的⽅法尽可能使组织细胞的形态结构和化学成分保持⽣活状态，防⽌组织细胞的溶解和腐败，并保持其原来的细微结构及原位保持⽣物活性物质的活性；能使细胞内蛋⽩质、脂肪、糖、等各种成分沉淀⽽凝固，尽量保持它原有的结构；使细胞内的成分产⽣不同的折射率，造成光学上的差异，使得原本在⽣活情况下看不清楚的结构，变得清晰可见；使得组织细胞各部经媒染作⽤容易染⾊；经过固定，使组织硬化，以利于以后切⽚时切薄⽚。
体循环：左⼼室→升主动脉→主动脉的各级分⽀→⽑细⾎管→各级静脉→上下腔静脉→右⼼房，完成体循环的整个循环。
⼆、实验步骤1、正常Sprague-Dawley⼤⿏，150～250g，或昆明⼩⿏，20g左右，雌雄不拘；2、动物⿇醉后，⽤左⼿持镊⼦夹起腹部⽪肤，右⼿持剪⼑⾃胸⾻剑突下腹部剪⼀⼩⼝，由此沿腹中线和胸⾻剑突中线向上将⽪肤剪⾄下颌，分离⽪下组织，将⽪肤翻向两侧，再沿腹中线和胸⾻中线向上剪开胸⾻，沿膈肌向两侧剪开，并⽤⽌⾎钳将胸⾻和胸部的⽪肤钳紧，将⽌⾎钳翻向外侧以充分暴露⼼脏，⼩⼼⽤镊⼦将⼼包膜打开；3、将灌注针（⼤⿏12#，⼩⿏7#）插⼊左⼼室并送⾄升主动脉内，⽤⽌⾎钳把灌注针固定在⼼脏上，打开灌注泵开关，同时剪开右⼼⽿，使⾎液排出。
先快速灌注0.9%NaCl（⼤⿏80-120ml，⼩⿏30ml），⾄肝脏逐渐变⽩⾊或右⼼⽿流出清亮液体为⽌，再灌注4℃预冷的固定液（⼤⿏200ml，⼩⿏50ml，根据动物体重定量），其中前1/3量快速灌注，后2/3量慢灌注，共在30分钟内灌注完；4、固定液进⼊⾎管后，⼤⿏四肢和尾巴开始抽动，表明灌注液进⼊⼤⿏⼤脑，待抽动完全停⽌，全⾝组织器官变硬后即可停⽌灌注；5、断头后，剥离颅⾻、剪断脑神经、离断脑于脊髓，取出整脑。
6、后固定（post-fixed）：剥出⿏脑后，切取含⽬的区域的脑段，放⼊相同固定液4～12h，4℃。
附4%多聚甲醛的配制：40g多聚甲醛⽤0.1mol/L PB（pH7.4）溶解后定容⾄1L，过滤后置于4℃保存。
神经生物学实验原理与技术
神经生物学实验原理与技术引言：神经生物学是研究神经系统结构和功能的学科，而神经生物学实验是研究神经生物学的重要手段之一。
本文将介绍神经生物学实验的原理与技术，包括细胞培养、电生理记录、免疫组织化学染色、光遗传学等。
一、细胞培养细胞培养是神经生物学实验中常用的技术之一，通过体外培养的方式可以研究神经元的结构和功能。
细胞培养的步骤包括细胞分离、培养基准备、细胞培养条件的控制等。
细胞分离可以通过酶消化、机械分离等方法进行，然后将分离得到的细胞放入培养基中进行培养。
培养基是模拟体内环境的液体，其中包含细胞生长所需的营养物质、生长因子和抗生素等。
细胞培养条件的控制包括温度、湿度、CO2浓度和培养时间等，这些条件可以影响细胞的生长和分化。
二、电生理记录电生理记录是研究神经元电活动的重要手段，通过记录神经元产生的电信号可以了解其功能和特性。
主要包括膜电位记录和膜电流记录。
膜电位记录可以通过玻璃微电极插入神经元测量细胞膜内外的电位差，从而了解神经元的兴奋性和抑制性。
膜电流记录是通过电压钳技术记录神经元通道的离子电流，从而了解离子通道的特性和功能。
电生理记录可以帮助研究者研究神经元的电信号传导机制、突触传递等重要生理过程。
三、免疫组织化学染色免疫组织化学染色是研究神经元分子表达的重要方法，通过标记特定抗原的抗体，可以在组织切片中检测特定的蛋白质或其他分子的分布和表达水平。
免疫组织化学染色的步骤包括组织固定、抗体孵育、显色反应等。
组织固定可以使用乙酸洗涤、甲醛固定等方法，将组织切片固定在载片上，以保持其形态和分子结构。
抗体孵育是将特异性抗体与组织切片进行结合，通过特定的抗原-抗体反应来检测目标分子的存在。
显色反应是将染色剂与抗体结合的部位产生颜色反应，从而可视化目标分子的分布和表达水平。
四、光遗传学光遗传学是近年来发展起来的一种研究神经元功能的新技术，通过利用光敏蛋白质的特性来控制神经元的活动。
光遗传学的主要方法包括光遗传感受器的表达和光刺激。
神经生物学实验指导
实验9-3 脊髓背根与腹根的机能【目的要求】1.学习暴露脊髓和分离脊神经背、腹根的方法。
2.了解背根和腹根的不同机能。
【基本原理】脊神经的背根是由传入神经纤维组成，具有传入机能；腹根由传出神经纤维组成，具有传出机能。
若切断背根，则相应部位的刺激不能传入中枢；若切断腹根，不能传出冲动，则其所支配的效应器也不再发生反应。
【动物与器材】蟾蜍或蛙、常用手术器械、金冠剪、弯头金冠剪、刺激器或多用仪、小型弯头露丝电极、蛙板、蛙腿夹、滴管、棉花、红色和白色细丝线、任氏液。
【方法与步骤】1.将蟾蜍或蛙毁脑后腹位固定于蛙板上。
沿背部中线剪开皮肤，向前开口至耳后腺水平，向后开口至尾杆骨中段。
用剪刀小心剪去脊椎两侧的纵行肌肉及椎间肌肉，暴露椎骨。
2.用金冠剪横向剪断环椎，然后将弯头金冠剪小心伸入椎管，自前至后逐节剪断两侧椎弓（图9-3），移去骨片，暴露全部脊髓（勿损伤脊髓）。
3.用眼科镊轻轻挑开脊髓表面的银灰色或黑色脊膜，再用任氏液冲洗马尾部，小心识别第7~10对脊神经背根和腹根（图9-4）。
用玻璃分针分离一侧第9对脊神经的背、腹根（背根近椎间孔处有淡黄色、半个小米粒大小的脊神经节），将背根穿两条白色丝线，腹根穿两条红色丝线备用。
放松两后肢即可进行实验观察。
（1）提起白丝线，轻轻用刺激电极钩起背根，打开刺激器，用较弱的单脉冲刺激背根(只引起同侧后肢抖动)，记录结果。
（2）用同样的方法刺激腹根，记录结果。
（3）将两条白线双结扎背根后从中间剪断神经，分别刺激其中枢端和外周端（刺激强度不变），记录结果。
（4）用同样的方法结扎并剪断腹根，重复刺激背根中枢端，记录结果。
（5）分别刺激腹根中枢端和外周端，记录结果。
【思考题】根据实验结果，说明背根和腹根的机能。
（赵静）生理学实验第二版P148-149实验9-4 损伤小白鼠一侧小脑的效应【目的要求】一侧小脑损伤后的动物，躯体运动表现异常，通过对异常运动的观察，了解小脑的运动机能。
【基本原理】小脑具有维持身体平衡，调节肌紧张和协调肌肉运动等机能。
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加尔（19世纪初 ）：德国的解剖学家，专门从事颅骨和脑 的研究。颅相学指分析人的心理与头颅形状之间关系的理 论学说。加尔从小就喜欢观察人的外表（尤其是颅骨外表） 同心理的关系。例如，他根据个人长期的个案观察，发现 眼睛明亮的人，一般记忆力较好；头骨隆起的人，可能象 征着贪婪的脑机能，是监狱中扒手的特征等。根据当时生 理和解剖知识，写了一套名为《神经系统的解剖学和生理 学》的系列著作，除了就神经系统及其机能进行严谨、保 守的阐述之外，还兼论颅相学。
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Positron Emission Tomography (PET， 正电子发射计算机断层显像)
FDG or F18 fluorodeoxyglucose
O15 Water
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18F-FDG PET脑代谢显 像，正常人与老年性痴呆 对照，患者双侧顶叶、颞 叶皮质对称性低代谢。
18F-DOPA PET脑受体显像， 正常人与帕金森氏病脑纹状体 多巴胺受体密度影像对照，患 者双侧纹状体密度明显减少
MRI vs MEG
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Magnetic Resonance Imaging (MRI)
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fMRI (functional magnetic resonance imaging)
Brain activity
Oxygen consumption
Cerebral blood flow
神经生物学实验教案
神经生物学实验教案南昌大学生命科学学院实验一脊髓、脑干【目的和内容】通过对脊髓标本、脊髓模型、挂图和脊髓横切片的观察，以了解脊髓的大体解剖结构和显微构造。
通过对脑干标本、挂图和模型的观察，了解脑干的外部形态和脑神经进出脑干的位置。
【材料和用具】锯开人椎管显露脊髓的标本、脑干标本。
人的脊髓解剖模型、人脑模型。
颈部脊髓横切片（银染色）。
【操作】一、脊髓的大体解剖结构通过挂图及人的脊髓模型观察下列结构。
（一）脊髓的位置脊髓位于椎管内，上端通过枕骨大孔与延髓相连续，下端以脊髓圆锥终于第一腰椎下缘。
（二）脊髓的外形脊髓呈前后稍扁的圆柱形，全长有两个膨大部分，上方的叫颈膨大，位于第4颈椎到第2胸椎范围内；下方的叫腰膨大，自第10胸椎处逐渐扩大，到第12胸椎处最粗，向下渐渐缩小成为脊髓圆锥。
自脊髓圆锥向下伸出一根细丝，叫终丝，止于尾骨的背面。
脊髓表面有下列数条平行的纵沟：1.前正中裂为脊髓前面正中较深的裂。
2.后正中沟为脊髓后面正中较浅的沟。
3.前外侧沟为脊髓前方两侧的一对沟。
4.后外侧沟为脊髓后方两侧的一对沟。
5.后中间沟在颈髓和上部胸髓，后外侧沟和后正中沟之间的浅沟。
这些沟裂在脊髓横切片上更易观察。
在前外侧沟的全长发出一系列根丝，许多根丝组合成前根。
在后外侧沟的全长也有一系列根丝，许多根丝组合成后根。
每一节段的前、后根在椎间孔处汇合成脊神经。
在汇合前，后根有一膨大，为脊神经节。
上部的脊神经根多呈直角地进出于脊髓的两侧，并立即进入其相应的椎间孔。
中部的神经根逐渐向下斜行到相应的椎间孔。
下部的神经根更为倾斜，腰、骶、尾部的脊神经根，未出相应的椎间孔前在椎管内几乎垂直下行，围绕终丝聚集成束，称为马尾。
（三）脊髓的被膜脊髓周围包有结缔组织被膜，叫脊膜，脊膜自外向内分为：l.硬脊膜最外层，坚厚。
硬脊膜与椎管内面骨膜之间的窄腔，叫硬膜外腔，内含血管和脂肪组织等，并有脊神经根通过。
2.脊髓蛛网膜是硬脊膜和软脊膜之间的薄膜。
神经生物学实验讲义
神经生物学实验讲义（供浙江大学本科生使用）主编杜继曾陈学群浙江大学玉泉校区神经生物学和生理学教研室2004年九月十六日精要速览系列（影印版）Instant Notes Neuroscience（神经科学）课堂讲授使用教材(英文）A. Longstaff科学出版社和BIOS SCIENTIFIC PUBLISHERS LIMITED2000脑内重要神经核团和神经生物学研究方法简介Methods for neuroscience research and nuclei in brain编写牛晨颖1.实验目的理解神经核团的概念，解重要的神经核团；掌握脑立体定位图谱的使用方法；了解神经生物学研究的常用方法。
2.实验器材、试剂及实验材料手术刀、毛剪、注射器，1%戊巴比妥钠(Pentobarbital Sodium)、依文氏蓝(Evans Blue)，小鼠。
3.实验步骤3.1脑的大致结构和重要神经核团脑膜至外由内分别有：硬脑膜、蛛网膜、软脑膜，其下是大脑皮层，边缘系统等结构。
重要的核团有：PVN（室周核）、PeN（室旁核）、SON（视上核）、ME（正中隆起）、Hippocampus（海马）等。
下表给出几个重要核团的大致范围，值得注意的是：核团在不同截面上的位置和形状是不同的，因此具体位置应查阅图谱。
3.2实验内容a)戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠（40mg/kg）；b)在颅骨前囟后3~5mm处打孔；c)用微量注射器吸入3μl依文氏蓝，注入小鼠背侧三脑室。
d)小鼠断头，除去颅骨，观察脑的结构。
George Paxinos and Charles Watson，The Rat Brain in Stereofaxic coordinates，Academic press，19864.江湾Ⅰ型脑定位仪的使用6.1脑立体定位仪的原理a)脑立体定位仪分为两大类：直线式和赤道式。
b)直线式脑立体定位仪的设计原则c)利用动物颅骨表面的某些解剖标志同脑表面及深部某一结构的相对恒定关系，从外部确定脑深部各结构的位置。
(完整word版)神经生物学实验指导
生物工程专业神经生物学实验指导实验内容一：大鼠脑立体定位及帕金森病（PD)模型制作目的要求：掌握大鼠脑立体定位仪的设计原理、基本结构、用途和正确使用;PD模型制作要点和注意事项。
实验分组：4人/组实验课时：5学时实验用动物、器械和药品:健康成年SD大鼠，体重200—250g，雌雄不拘；脑立体定位仪、水平仪、电吹风;麻醉药(0.4％戊巴比妥钠：戊巴比妥钠0。
4 g，生理盐水100 ml）;碘酒、酒精、生理盐水、蒸馏水；5或10ul 微量注射器；手术器械，如手术刀、镊、止血钳等；大鼠脑立体定位图谱；6—羟基多巴胺（6-OHDA）溶液(按3ug/ul配制，加Vc，即6-OHDA溶液1ml：将6-OHDA3mg，VitC0.2mg，溶于灭菌生理盐水，在1。
5ml离心管中定容至1ml，分装后—20℃保存)。
实验操作及注意点：1．根据老师的讲解和指导,认识脑立体定位仪主要部件,即主框、电极移动架及动物头部固定装置（即固定上颌的结构和耳杆与耳杆固定柱）及用途。
2．脑立体定位仪的调试:摆稳定位仪,用水平仪测水平。
检验电极移动架上各个轴向滑尺是否保持互相垂直,微量注射器针尖是否光滑垂直。
检查定位仪各衔接部位的螺丝有无松动.检查头部固定装置两侧是否对称.检查耳杆使两耳杆尖端相对，以此判定耳杆固定的准确程度.然后，使两耳杆尖端相对间隔1～2 mm ,前后移动固定有注射器的注射装置纵轴,使注射器的针体向后移时，恰好通过两耳杆尖端之间的1～2 mm 间隙; 向前移时，恰好与切牙固定架的正中刻线在一条直线上.3．大鼠称重并麻醉（腹腔注射戊巴比妥钠,40mg/kg），动物麻醉不可过深或过浅，注意呼吸情况。
抓取大鼠时要轻柔，防止抓咬伤。
4．鼠颅的固定:将麻醉大鼠置于脑立体定位仪上，鼠颅依靠两耳杆及切牙钩三点固定.在向外耳道内插入耳杆时，鼠眼球向外凸出。
一旦进入鼓膜环沟内，穿破鼓膜,则会发出轻微的“嘭”声，同时出现眨眼反射,眼球不再凸出，说明耳杆进位正确。
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神经生物学实验讲义2013版
实验一鼠脑灌注固定和取材
一、原理
固定是用人为的方法尽可能使组织细胞的形态结构和化学成分保持生活状态，防止组织细胞的溶解和腐败，并保持其原来的细微结构及原位保持生物活性物质的活性；能使细胞内蛋白质、脂肪、糖、等各种成分沉淀而凝固，尽量保持它原有的结构；使细胞内的成分产生不同的折射率，造成光学上的差异，使得原本在生活情况下看不清楚的结构，变得清晰可见；使得组织细胞各部经媒染作用容易染色；经过固定，使组织硬化，以利于以后切片时切薄片。
体循环：左心室→升主动脉→主动脉的各级分支→毛细血管
→各级静脉→上下腔静脉→右心房，完成体循环的整个循环。
二、实验步骤
1、正常Sprague-Dawley大鼠，150～250g，或昆明小鼠，20g左右，雌雄不拘；
2、动物麻醉后，用左手持镊子夹起腹部皮肤，右手持剪刀自胸骨剑突下腹部剪一小口，由此沿腹中线和胸骨剑突中线向上将皮肤剪至下颌，分离皮下组织，将皮肤翻向两侧，再沿腹中线和胸骨中线向上剪开胸骨，沿膈肌向两侧剪开，并用止血钳将胸骨和胸部的皮肤钳紧，将止血钳翻向外侧以充分暴露心脏，小心用镊子将心包膜打开；
3、将灌注针（大鼠12#，小鼠7#）插入左心室并送至升主动脉内，用
止血钳把灌注针固定在心脏上，打开灌注泵开关，同时剪开右心耳，使血液排出。
先快速灌注0.9%NaCl（大鼠 80-120ml，小鼠30ml），至肝脏逐渐变白色或右心耳流出清亮液体为止，再灌注4℃预冷的固定液（大鼠200ml，小鼠50ml，根据动物体重定量），其中前1/3量快速灌注，后2/3量慢灌注，共在30分钟内灌注完；
4、固定液进入血管后，大鼠四肢和尾巴开始抽动，表明灌注液进入大鼠大脑，待抽动完全停止，全身组织器官变硬后即可停止灌注；
5、断头后，剥离颅骨、剪断脑神经、离断脑于脊髓，取出整脑。
6、后固定（post-fixed）：剥出鼠脑后，切取含目的区域的脑段，放入相同固定液4～12h，4℃。
附 4%多聚甲醛的配制：40g多聚甲醛用0.1mol/L PB（pH7.4）溶解后定容至1L，过滤后置于4℃保存。
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