碱性蛋白酶(AKP)活性检测试剂盒说明书 可见分光光度法
生化大实验--AKP(碱磷酶)的表达与纯化
相对误差：绝对误差在真实值中所占的百分率。
精确度和偏差：精确度表示在相同条件下，进行多次实验的测定值相近 的程度。一般用偏差来衡量分析结果的精确度。 偏差：绝对偏差、相对偏差。
误差来源
1、系统误差（可测误差）： 测定过程中，某些经常发生的原因所造成的，它对测定结果的影响比较稳定， 在同一条件下重复测定中常重复出现，使测定结果不是偏高，就是偏低，而 且大小有一定规律，它的大小与正负往往可以测定出来，至少从理论上来说
留样！体积测定！
培养、表达与菌体收集
1.预培养：
挑一单菌落至 30mL LB液体培养基(含50μg/mL Carb)， 37℃、190rpm振荡培养过夜； 2.扩大培养： 取2mL～3mL预培养菌液至300mL TM培养基中(含50μg/ml Carb)，37℃、250rpm振荡培养3~4小时 3. 诱导表达： 加入IPTG（终浓度：50μmol/L ），25℃、250rpm振荡培 养12～16小时 注意：平衡！ 4. 收菌： 充分弃上清！ 4℃，6000rpm×10min， －20℃保存菌体沉淀
溶液配制
6.考马斯亮蓝溶液 500mL 考马斯亮蓝G-250 50mg溶于 25mL95%乙醇中， 加入 50mL85%磷酸, 加水至500mL，滤纸过滤（棕色瓶）
7. 1mg/mL BSA 10 mL（全班） 10 mg BSA用Buffer A溶解，10 mL 容量瓶定容
溶液配制
8. 测活液pH 8.5 100mL
50 mmol/L Tris-HCl
0.2mg/mL BSA
10mmol/L pNPP
2mmol/L MgAc2 9. 终止液 500mL
10. Buffer C 600 mL
溶液配制
碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒(磷酸苯二钠比色法)说明书
注意：由于检测仪器和操作手法等条件的不同，参考值范围会有波动，该值仅供参考，对于 要求精确计算 ALP 含量的，可以进行多点重复测定；根据测定经验显示，标准品浓度在 5U/L 以下，标准品浓度在 100U/L 以上，标准曲线会有偏差。
以系列 Phenol 标准(1～6 号)对应的金氏单位(10、20、30、40、50U/L)为横坐标，以相应的 A 标准(1～6 号)为纵坐标，绘制标准曲线。以 A 测定-A 对照的差值为实际的吸光度，用该差 值与标准曲线进行对比，求出酶活力单位。
参考区间(37℃)：
健康成年人 健康儿童
3～13 金氏单位 5～28 金氏单位
注意事项： 1、待测样品中不能含有磷酸酶抑制剂，同时需避免反复冻融。 2、如果没有分光光度计，也可以使用酶标仪测定，但应注意 96 孔板最大检测体积。 3、所测样品的值高于标准曲线的上限，应稀释样品后重新测定。 4、空白管如果显红色，说明 ALP 显色液不可用，应丢弃。 5、加入显色基液时应迅速，并且及时混匀，否则显色不充分。 6、如无法检测 510nm，亦可检测 500～530nm 范围内吸光度。 7、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
保存条件 4℃ 避光 4℃ 避光 4℃ 避光 4℃ 避光 4℃ 避光
自备材料： 1、离心管或小试管、水浴锅或恒温箱 2、分光光度计、比色杯 3、ddH2O、PBS 或生理盐水
操作步骤(仅供参考)： 1、准备样品： ①细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如果有必要可用 PBS 或生理盐水进行适当匀 浆，一般细胞数量在 106 以上，组织应在 100mg 以上，3000~4000rpm 离心取上清，-20℃ 冻存，用于碱性磷酸酶的检测。 ②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定， 尿液通常也可以直接用于测定，-20℃冻存，但为了消除样品本身颜色的干扰，需设置加了 血浆或血清但不加底物的对照。 ③高活性样品：如果样品中含有较高活性的碱性磷酸酶，可以使用原有的裂解液或 PBS 等进 行稀释，如鸡血清、血浆可稀释 5～10 倍后检测。
常用细菌检测方法
常用细菌检测方法一、[3H]脱氧胸苷摄入法测定细胞数：1、用RPMI-1640培养液洗涤对数生长期（培养3天）的CTLL-2细胞两次，每次250×g离心10分钟，洗去培养液中残存的IL-2。
2、用台盼蓝（1%Trypan blue）染色法计数细胞并决定细胞的活力，用10%小牛血清的RPMI-1640培养液悬浮细胞至1×105/ml。
3、在96孔细胞培养板中每孔加0.1ml倍比稀释的标准IL-2或待测样品，每个稀释度三个复孔，标准IL-2从40IU/ml稀释到0.019IU/ml（8～10个稀释度），阴性对照孔不加IL-2。
4、每孔加0.1ml细胞悬液，在37℃5%CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养18～24小时。
每孔加10μl（0.5μCi或1.85×104Bq）[3H]脱氧胸苷，继续培养4小时。
5、用多头细胞收集器将细胞收集到玻璃纤维滤纸上，用3%醋酸水溶液滤纸3次，洗去游离的[3H]TdR。
将滤纸置液体闪烁瓶中，加入5ml闪烁液。
在液体闪烁仪上计数细胞摄入的同位素活性（每分钟放射性计数，cpm），根据仪器效率换算成dpm（每分钟衰变数）。
6、用dpm值对样品稀释倍数作图。
在图上，标准IL-2的曲线与待测样品的曲线应当呈平行的S型，说明是同样的分子反应。
比较同样dpm处的不同稀释倍数，决定待测样品的相应浓度。
二、MTT检测法：1、取96孔细胞培养板，每孔中加0.1ml含2×104～10×104靶细胞的培养液（含10%小牛血清的RPMI-1640培养液），在37℃5%CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养2～3小时让细胞帖壁（如果是悬浮细胞可直接进行下一步）2、用RPMI-1640培养液2～10倍递次稀释细胞因子标准品，根据情况2～5倍递次稀释待检样品，每孔加0.1ml稀释的标准品和待检样品，每个稀释度3个重复孔。
对照孔6个：3个阳性对照孔，每孔加0.1ml含大剂量细胞因子的RPMI-1640培养液，3个阴性对照孔，每孔加0.1ml RPMI-1640培养液。
碱性磷酸酶分离纯化及比活性测定1
试剂（ml）
生理盐水 标准蛋白溶液 样品 考马斯亮蓝试剂
空白管
0.1标Biblioteka 管ABC0.1 A2液0.1 5.0 5.0 5.0 B2液0.1 5.0 C2液0.1 5.0
室温5min，各管进行A595测定 计算：样品中蛋白质的含量=A样品/A标准×C标准×稀释倍数
目录
3. 结果处理与分析
结果处理表
酶活性计算 体积 (ml) A 值
目录
检测酶提取纯化的指标
1. 酶的纯度： 用比活性代表（单位重量蛋白质样品中 的活性单位） 2. 酶的回收效率 所含酶
※在保证纯度的前提下，应尽可能提高酶的回收率
目录
实验内容
酶的提取及比活性测定
目录
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP) 的分离纯化及比活性测定
[目的] 1．掌握AKP分离纯化的实验原理、方法 及注 意事项 2．了解检测AKP活性测定的原理和方法。
25g肝组织剪碎 +0.01M醋酸镁-醋酸钠溶液75ml，匀浆机中匀浆 取肝匀浆4ml(A液）
A1：取0.1mlA液+1.9mlpH8.8Tris缓冲液，待测活性
A2：取0.1mlA液+4.9ml生理盐水，待测蛋白浓度
+2ml正丁醇，混匀2min，室温置30min，离心 （3000rpm)5min 下清液（吸取） 沉淀（弃）
蛋白含量计算 酶的总 活性 （ U） A 值
稀 释 倍 数
酶活性 (U/ml)
稀 释 倍 数
比活 酶的 性 蛋白浓度 得率 (U/mg) (mg/ml)
A 液 B液
4 2.2
100%
C液
2
目录
碱性磷酸酶测定试剂（ALPAKP）
北京华宇亿康生物工程技术有限公司Co-Health (Beijing )Laboratories Co., Ltd. 液体生化试剂使用说明书_碱性磷酸酶测定试剂（ALP/AKP ） （IFCC ，AMP 缓冲液）【注册产品标准】YZB/国 1959-2003 ◇ 【医疗器械注册证号】京药监械（准）字2005第2400405号本试剂适用于人血清或血浆中碱性磷酸酶活性的体外定量分析。
临床意义碱性磷酸酶存在于体内多种组织和器官，其病理性变化表现在：增加：（1） 肝脏疾病如胆汁淤积和肝硬化；（2） 骨骼疾病如软骨病、佝偻病、成骨肉瘤； （3） 恶性肿瘤。
减少：（1） 停止生长（克汀氏病、软骨发育不全）； （2） 先天性低磷酸酶血症。
方法学原理磷酸对硝基苯酚（4-NPP ）在碱性磷酸酶的作用下，将其磷酸基转移到2-氨基-2-甲基-1-丙醇（AMP ）受体分子上，释放出的对硝基苯酚（4-NP ）在碱性溶液中分子重排形成黄色醌，可在405nm 下检测。
黄色醌形成速率与ALP 活力成正比。
ALP 4 -NPP + H 2O → 4 -NP + 磷酸 Mg 2+, 碱性 试剂组成试剂1（R 1） 试剂2（R 2）AMP 0.35mol/L 4 -NPP 80mmol/L MgCl 2 10.5mmol/L 稳定剂 适量 适用仪器ZYA-1003：适用于日立7060/7150、岛津7200/ 7300/8000全自动生化分析仪；ZYB-1003：适用于日立7170 A /7170、奥林巴斯AU400 /600/1000全自动生化分析；ZYC-1003：适用于日立7020全自动生化分析仪； ZYD-1003：适用于贝克曼CX 系列全自动生化分析仪；ZYE-1003：适用于东芝全自动生化分析仪；TYA-1003、TYB-1003、TYC-1003：适用于其它全自动生化分析仪及各类半自动生化分析仪。
试剂贮存及稳定性试剂自生产日期起2—8℃避光存放可稳定12个月；R 1、R 2按4:1比例混为工作液2—8℃避光可稳定4周。
碱性蛋白酶使用方法
碱性蛋白酶使用方法
碱性蛋白酶是一种常用的酶类试剂，广泛应用于生物学、生物化学和分子生物学等领域。
它能够在碱性条件下高效催化蛋白质水解反应，常用于蛋白质纯化、酶切、免疫学实验等。
本文将介绍碱性蛋白酶的使用方法，希望能够对使用者有所帮助。
1. 确定使用条件。
在使用碱性蛋白酶前，首先需要确定实验所需的碱性条件。
一般来说，碱性蛋白酶的最适作用pH为8.0-9.5，因此在实验中需要选择适合的缓冲液来维持碱性条件。
2. 酶解反应条件。
将待酶解的蛋白样品与适量的碱性蛋白酶按照比例混合，通常在室温下进行反应。
酶解的时间可以根据需要进行调整，一般情况下15-60分钟即可完成反应。
3. 反应终止。
在酶解反应结束后，需要及时终止反应以防止酶的过度作用。
一般常用的方法是加入蛋白质酶抑制剂或直接加热至95℃以上，使
酶失活。
4. 样品处理。
酶解后的样品可以根据实验需要进行进一步处理，如进行电泳
分析、质谱分析、免疫印迹等。
5. 储存条件。
碱性蛋白酶通常以粉末形式供应，应密封保存于-20℃以下，避
免受潮和高温。
在使用过程中，应尽量避免长时间暴露于室温下。
6. 安全注意事项。
在使用碱性蛋白酶时，应注意避免吸入粉尘或接触皮肤和眼睛，避免误食。
使用过程中应佩戴口罩、手套和护目镜，避免产生粉尘。
总之，碱性蛋白酶是一种非常重要的酶类试剂，正确的使用方
法能够有效提高实验效率，获得准确的实验结果。
希望本文介绍的
使用方法能够对使用者有所帮助，祝实验顺利！。
碱性磷酸酶测定试剂盒(NPP底物-AMP缓冲液法)产品技术要求zhongshengbeikong
碱性磷酸酶测定试剂盒（NPP底物-AMP缓冲液法）适用范围：本产品用于体外定量测定人血清中碱性磷酸酶的活性。
1.1包装规格液体双剂型试剂1（R1）：80mL×3，试剂2（R2）：60mL×1；试剂1（R1）：80mL×2，试剂2（R2）：20mL×2；试剂1（R1）：60mL×3，试剂2（R2）：45mL×1；试剂1（R1）：40mL×3，试剂2（R2）：30mL×1；试剂1（R1）：40mL×3，试剂2（R2）：10mL×3。
1.2主要组成成分试剂1（R1）液体：AMP缓冲液350mmol/L（pH 10.5）2.5mmol/LMgCl2试剂2（R2）液体：对硝基苯磷酸盐 16mmol/L2.1 外观试剂盒中各组件的外观应满足：2.1.1试剂1（R1）应为无色透明溶液，无杂质、无絮状物，外包装完整无破损；2.1.2 试剂2（R2）应为淡黄色透明溶液，无杂质、无絮状物，外包装完整无破损。
2.2 净含量液体试剂净含量不少于标示值。
2.3 试剂空白吸光度在波长410nm（400nm～420nm）（光径1cm）处，试剂空白吸光度（A）应≤1.000；试剂空白吸光度变化率（△A/min）应≤0.005。
2.4准确度测定GBW(E)090593，相对偏差应不超过±10％。
2.5分析灵敏度对应于活性为120U/L的ALP所引起的吸光度变化率（△A/min）的绝对值应在0.010～0.050范围内。
2.6重复性重复测试同一样本，变异系数（CV）应≤5%。
2.7批间差测试同一样本，批间差（R）应≤6%。
2.8线性范围在[1，1200]U/L（37℃）范围内，线性相关系数（r）应≥0.990；在(20，1200] U/L（37℃）范围内，线性相对偏差应不超过±10％；在[1，20]U/L（37℃）范围内，线性绝对偏差应不超过±2U/L。
生物化学大实验-akp的浓度测定与活性检测
用于制备样品和分离细 胞或组织中的不同组分。
用于保持反应温度恒定。
用于精确移取一定量的 样品和试剂。
PART 04
实验步骤与方法
REPORTING
WENKU DESIGN
AKP的浓度测定步骤与方法
准备试剂和设备
01
根据实验要求准备所需的试剂和设备，如AKP标准品、酶标仪、
酶标板等。
配置标准品溶液
改进建议
为了更准确地测定AKP的浓度和活性，建议采取以下措施：首先，确保试剂的纯度，避免使用含有杂质或污染物 的试剂；其次，严格控制实验条件，如温度、pH值等，确保实验条件的一致性和准确性；最后，采用更先进的 检测方法和技术，如色谱法、质谱法等，以提高实验结果的准确性和可靠性。
PART 07
参考文献
数据处理
根据标准品溶液的浓度和光密 度值绘制标准曲线，并计算待
测样本中AKP的浓度。
AKP的活性检测步骤与方法
准备试剂和设备
01 根据实验要求准备所需的试剂
和设备，如底物、终止液、分 光光度计等。
配置反应体系
02 将底物溶解在适当的缓冲液中
，加入待测样本，设置空白对 照。
启动反应
03 将反应体系在恒温条件下孵育
进行AKP的浓度和活性检测。
PART 02
实验原理
REPORTING
WENKU DESIGN
AKP的浓度测定原理
酶联免疫吸附法（ELISA）
利用抗原与抗体的特异性结合，通过酶与底物反应的显色反应，测定AKP的浓 度。
分光光度法
利用特定波长下的吸光度值与AKP浓度的线性关系，通过测定吸光度值计算 AKP的浓度。
掌握AKP的浓度测定 与活性检测方法
碱性磷酸酶活性测定试剂盒说明书
碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP/ALP）活性测定试剂盒说明书分光光度法50管/24样注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：AKP/ALP是一种含锌的糖蛋白酶，在碱性环境中可水解各种天然及人工合成的磷脂单酯化合物。
AKP/ALP 广泛分布于人体各脏器中，以肝脏为主。
测定原理：在碱性环境中，AKP/ALP催化磷酸苯二钠生成游离酚；酚与4-氨基安替比林和铁氰化钾反应红色亚醌衍生物，在510nm有特征光吸收；通过测定510 nm吸光度增加速率，来计算AKP活性。
自备仪器和用品：可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。
试剂组成和配制：试剂一：液体×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体×1瓶，4℃避光保存。
试剂三：液体×1瓶，4℃避光保存。
试剂四：液体×1瓶，4℃避光保存，未变成蓝绿色之前均可使用。
标准品：液体×1支（EP管中），2 μ mol/mL酚标准液，4℃保存。
粗酶液提取：1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，4℃、8000g离心10min，取上清液待测。
2. 细菌或细胞：按照细菌或细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
3. 血液可直接测定，或者适当稀释后测定。
测定步骤：1. 分光光度计预热30min，调节波长到510 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂三置于37℃水浴中预热30 min。
3. 空白管：取EP管，加入20μL蒸馏水，200μL试剂二，200μL试剂三，混匀后置于37℃水浴中保温15min；加入试剂四600μL，混匀后于510 nm测定吸光度，记为A空白管。
AKP说明书
碱性磷酸酶 (U / gprot)
=
测定管吸光度 标准管吸光度
×
标准管含酚的量 (0.003mg)
÷
取样量中的蛋白克数
= 0.081 × 0.003 ÷ (1.29 ×10−3 × 0.03) = 32.37U / gprot 0.194
南京建成生物工程研究所 南京建成科技有限公司
地 址： 南京市中央路 258－27 号 电 话：（025）83360321
基质液(ml)
0. 5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
充分混匀,37℃水浴 15 分钟
显色剂(ml)
1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
立即混匀,在 520nm 处,1cm 光径,0 管调零,测各管 OD 值
以所测得的吸光度为纵坐标，以相应的标准浓度单位为横坐标，绘制标准曲线。
×
100ml 0.05ml
= 0.404 × 0.005 × 100 = 16.16金氏单位 /100ml
0.250
0.05
1
本试剂盒仅用于科研、实验室
南京建成
（二）、组织匀浆中 AKP 的测定：
1、 操作表：
测定管
标准管
空白管
1%组织匀浆(ml)
0.03
0.1mg/ml 酚标准液(ml)
三、操作：
Байду номын сангаас
(一)、血清（浆）中 AKP 的测定： 1、操作表：
测定管
标准管
空白管
血
清（ml）
0.05
0.1mg/ml 酚标准应用液（ml）
0.05
双 蒸 水（ml）
0.05
碱性蛋白酶使用方法
碱性蛋白酶使用方法碱性蛋白酶是一种常用的酶类试剂，广泛应用于生物学、生物化学、分子生物学等领域。
它具有催化水解蛋白质的特性，能够在碱性条件下高效地降解蛋白质，因此在实验室研究和工业生产中得到了广泛的应用。
下面将介绍碱性蛋白酶的使用方法，希望能为相关研究工作和生产实践提供一些帮助。
首先，使用碱性蛋白酶前需要准备相应的工作溶液。
一般情况下，可以将碱性蛋白酶粉末溶解于适量的缓冲液中，制备成一定浓度的酶液。
在此过程中，需要注意溶解温度和时间，以免影响酶活性。
通常建议在冰上或4摄氏度条件下缓慢溶解，避免高温或长时间的搅拌。
其次，对于不同类型的样品和实验目的，需要根据具体情况确定碱性蛋白酶的使用浓度和反应条件。
一般来说，对于蛋白质含量较高的样品，可以适当增加酶液的使用量，延长反应时间；而对于蛋白质含量较低的样品，则需要控制酶液的浓度和反应时间，以避免过度降解或不完全降解的情况发生。
此外，还需根据实验要求选择合适的缓冲液和反应温度，以保证酶的最佳活性和稳定性。
在实际操作中，需要将制备好的碱性蛋白酶工作溶液加入到待处理的样品中，然后进行充分混合和反应。
在反应过程中，可以根据需要适时监测反应进程，并在合适的时间点停止反应，通常是通过加入适量的蛋白酶抑制剂或改变反应条件来实现。
此外，对于一些特殊的样品和反应条件，可能需要进行一定的优化和调整，以获得最佳的实验效果。
最后，对于反应后的样品，需要进行适当的处理和分析。
通常可以通过热处理、离心、凝胶电泳、质谱等方法来检测和分析蛋白质的降解情况和产物。
在进行实验过程中，需要注意安全操作，避免酶液的直接接触和吸入，避免对实验人员和环境造成危害。
综上所述，碱性蛋白酶是一种重要的酶类试剂，其正确的使用方法对于保证实验结果的准确性和可重复性至关重要。
在使用碱性蛋白酶时，需要注意制备工作溶液、确定使用浓度和反应条件、实施反应操作以及样品处理和分析等方面的细节，以确保实验顺利进行并获得理想的结果。
碱性磷酸酶实验报告
实验日期：2023年10月25日实验地点：生化实验室实验目的：1. 了解碱性磷酸酶（AKP）的分离纯化原理和方法。
2. 掌握碱性磷酸酶活性测定的原理和方法。
3. 通过实验验证碱性磷酸酶的动力学特性，计算其米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）。
实验原理：碱性磷酸酶（AKP）是一种非特异性磷酸单酯酶，主要存在于动物和微生物体内，具有磷酸基团转移活性。
在碱性条件下，AKP能水解多种磷酸单酯化合物，生成相应的醇和磷酸盐。
本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP，并通过比色法测定其活性。
实验材料：1. 兔肝匀浆液2. 丙酮3. 0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）4. 磷酸苯二钠5. 4-氨基安替比林6. 铁氰化钾7. 移液管、移液枪、试管、试管架、恒温水浴箱、分光光度计实验步骤：1. 碱性磷酸酶提取：- 将兔肝匀浆液与丙酮以体积比1:1混合，室温下静置过夜。
- 4,000 rpm离心10分钟，弃去上清液。
- 将沉淀用0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）溶解，得到碱性磷酸酶粗提液。
2. 碱性磷酸酶活性测定：- 取6支试管，分别加入0.02 mol/L磷酸苯二钠溶液、0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0）、4-氨基安替比林溶液和铁氰化钾溶液。
- 在上述溶液中加入不同浓度的碱性磷酸酶粗提液，混匀后置于恒温水浴箱中反应10分钟。
- 在510 nm波长下测定吸光度，以酶活力单位（U）表示。
3. 米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）计算：- 以酶活力单位（U）为纵坐标，底物浓度（mol/L）为横坐标，绘制酶活力曲线。
- 利用双倒数法（Lineweaver-Burk plot）计算米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）。
实验结果：1. 碱性磷酸酶活性曲线：- 随着底物浓度的增加，酶活力逐渐增加，但在一定浓度后趋于稳定。
2. 米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）：- 米氏常数（Km）为0.05 mol/L，最大反应速度（Vmax）为150 U/min。
碱性蛋白酶使用方法
碱性蛋白酶使用方法碱性蛋白酶是一种常用的酶类试剂，广泛应用于生物学、生物化学和分子生物学等领域。
它具有高效、温和、特异性强等特点，因此在实验室中被广泛使用。
下面将详细介绍碱性蛋白酶的使用方法，希望能对大家有所帮助。
首先，准备工作。
在使用碱性蛋白酶之前，需要准备好所需的试剂和设备，如碱性蛋白酶溶液、缓冲液、离心管、移液器等。
同时，要确保工作台面的清洁，并采取无菌操作，以避免外源性污染对实验结果的影响。
其次，制备工作。
将碱性蛋白酶溶液按照说明书中的浓度稀释至所需浓度，通常情况下建议在4摄氏度下保存稀释后的溶液，避免酶活性的损失。
另外，根据实验要求选择合适的缓冲液，并在制备过程中注意pH值的调节，以维持酶的活性。
接下来，样品处理。
将待处理的样品加入到含有碱性蛋白酶的缓冲液中，控制好反应的时间和温度。
在处理过程中，要注意避免酶的不必要损失，避免过高或过低的温度和pH值，以及避免长时间的反应。
然后，反应终止。
在反应达到预期的时间后，需要及时终止反应，一般可通过加入酶抑制剂或改变反应条件来实现。
此外，也可以通过加热或离心等方法来终止反应，具体方法根据实验要求来确定。
最后，结果分析。
在反应终止后，需要对样品进行后续处理，如离心、洗涤等，并进行结果的分析和检测。
根据实验要求，可以选择合适的方法来检测反应产物，如SDS-PAGE、Western blot等。
总结起来，碱性蛋白酶的使用方法并不复杂，但在实际操作中需要严格控制各个步骤，以确保实验结果的准确性和可靠性。
希望本文对大家在实验中使用碱性蛋白酶时有所帮助，同时也提醒大家在实验操作中要严格遵守相关实验室规范和安全操作规程，保障个人和他人的安全。
蛋白酶活性检测实验报告
一、实验目的1. 学习和掌握蛋白酶活性检测的基本原理和方法。
2. 了解蛋白酶的特性和作用。
3. 通过实验，学会使用相关仪器和操作技能。
二、实验原理蛋白酶是一种能够水解蛋白质的酶，其活性是指在一定条件下，蛋白酶催化蛋白质水解的能力。
蛋白酶活性检测通常采用紫外分光光度法，通过测定反应体系中蛋白质的降解程度来评估蛋白酶的活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）蛋白酶样品（2）底物：酪蛋白（3）缓冲液：磷酸盐缓冲液（pH 7.0）（4）其他试剂：硫酸铜、碘化钾、氢氧化钠等2. 实验仪器：（1）紫外分光光度计（2）恒温水浴锅（3）电子天平（4）移液器（5）试管（6）烧杯四、实验步骤1. 准备实验试剂和仪器。
2. 配制底物溶液：称取一定量的酪蛋白，加入适量磷酸盐缓冲液，溶解后备用。
3. 设置实验组：（1）取若干个试管，分别加入不同浓度的蛋白酶样品。
（2）在每个试管中加入相同体积的底物溶液。
（3）将试管放入恒温水浴锅中，设定温度为37℃，反应一定时间。
4. 设置对照组：（1）取若干个试管，分别加入相同体积的蛋白酶样品和底物溶液。
（2）将试管放入恒温水浴锅中，设定温度为37℃，反应一定时间。
5. 测定反应体系中蛋白质的降解程度：（1）取一定体积的反应体系，加入硫酸铜和碘化钾溶液。
（2）用紫外分光光度计测定反应体系的吸光度。
（3）根据吸光度计算蛋白质的降解程度。
6. 数据处理和分析：（1）绘制蛋白酶活性与酶浓度、反应时间的关系曲线。
（2）分析蛋白酶的特性和作用。
五、实验结果与分析1. 实验结果：（1）不同浓度的蛋白酶样品对底物溶液的降解程度不同。
（2）随着反应时间的延长，蛋白质的降解程度逐渐增加。
2. 分析：（1）蛋白酶的活性与酶浓度呈正相关，即酶浓度越高，活性越强。
（2）在一定反应时间内，蛋白酶活性随着反应时间的延长而增加，但当反应时间过长时，活性逐渐降低，可能是因为蛋白酶自身发生降解。
六、实验结论1. 通过本实验，掌握了蛋白酶活性检测的基本原理和方法。
α-淀粉酶（α-AL）活性检测试剂盒说明书
α-淀粉酶（α-AL ）活性检测试剂盒说明书微量法注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC0615规格：100T/48S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称规格保存条件试剂一液体20 mL×1瓶常温保存试剂二液体5 mL×2瓶2-8℃保存试剂三粉剂×2支2-8℃保存标准品粉剂×1支2-8℃保存溶液的配制：1、试剂一：若有黄色晶体析出，需加热溶解后再用；2、试剂二：临用前取1支试剂三加入1瓶试剂二中，置于常温水中并加热至煮沸，期间不断搅拌粉剂至溶解，用不完的试剂2-8℃保存4周；3、标准品：10 mg 无水葡萄糖。
临用前加1 mL 蒸馏水，配成10 mg/mL 葡萄糖标准液，2-8℃保存两周。
产品说明：淀粉水解酶，包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。
α-AL (EC 3.2.1.1)随机催化淀粉中α-1,4-糖苷键水解，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。
淀粉水解酶催化淀粉水解生成还原糖，还原糖还原3,5-二硝基水杨酸生成棕红色物质，在540nm 有吸收峰；通过测定540nm 吸光度增加速率，计算淀粉酶活性。
α-AL 耐热，但是β-淀粉酶可在70℃钝化15min 。
因此粗酶液经过70℃钝化15min ，就只有α-AL 能够催化淀粉水解。
Reducing Sugar3-Amino-5-Nitrosalicylate (540nm)注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：酶标仪/可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、96孔板/微量玻璃比色皿、研钵/匀浆器和蒸馏水。
操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）称取约0.1g 样本，加0.8mL 蒸馏水匀浆；匀浆后在室温下放置提取15min ，每隔5min 振荡1次，使其充分提取；6000g ，室温离心10min ，吸取上清液并且加蒸馏水定容至10mL ，摇匀，即为淀粉酶原液。
碱性磷酸酶（AKP）特性研究探究.doc
碱性磷酸酶(AKP)特性研究探究碱性磷酸酶(AKP)是在碱性条件下水解多种磷酸酯并具有转磷酸基作用的一组酶，并且在较高温度下仍具有活性。
本实验由含pET21a-AKP表迗质粒的大肠杆菌制备碱性磷酸酶，通过一系列分离纯化的实验提纯了碱性磷酸酶。
本实验通过对纯化之后的AKP进行酶促反应速率曲线的测定、测定激活剂和抑制剂对AKP活性的影响、测定抑制剂对酶的动力学参数的影响、测定AKP的最适温度和pH以及AKP 的变性和复性等实验来研究AKP的特性。
关键词：碱性磷酸酶(AKP);反应速率曲线；激活剂；抑制剂；变性；复性；酶活力大肠杆菌碱性磷酸酶(EC. 3. 1. 3.1)，是同二聚体金属酶，能催化非特异性磷酸单酯水解，分子量是56Kda。
它的两个单体结合成具有两个活性中心的对称的活性酶，每个活性中心包含3个金属原子，即两个锌原子和一个镁原子。
大肠杆菌碱性磷酸酶被phoA基因编码，和其他分泌蛋白质一样，以在氨基末端带有一个信号肽的前体合成，转录后穿过细胞膜进入细胞质，信号肽被除去，两个成熟的单体二聚化。
碱性磷酸酶即AKP来源广泛，可来源于细菌、真菌、藻类、无脊椎动物及脊椎动物。
AKP广泛存在于各种生物体内，参与细胞磷代谢和信号肽转导的一种磷酸酶。
AKP能催化除去DNA、RNA、三磷酸核糖核苷和三磷酸脱氧核糖核苷的5’磷酸基团；去除线状DNA两端的5’磷酸可以最大限度地减少质粒DNA的自身环化；蛋白质的去磷酸化。
大肠杆菌碱性磷酸酶是一种有用的工具酶，在免疫学研究中常用作酶联试剂，将AKP与显色剂或去磷酸化后能发光的底物相互作用来揭示靶与检测酶复合物的存在。
AKP作为一种工具酶在表位连锁图谱、组织化学、免疫印迹、突变分析等方面有广泛应用，在临床上作为同工酶，疾病诊断，研究磷的代谢等。
本实验对碱性磷酸酶的特性研究主要是通过对酶活力的测定来分析的。
酶活性也称为酶活力，按照国际酶学委员会的规定，1个酶活力国际单位是指在最适反应条件（指最适pH、温度25°C等）下，1分钟内能催化1微摩尔底物转化为产物所需的酶量。
碱性蛋白酶活力测定[讲解]
![碱性蛋白酶活力测定[讲解]](https://img.taocdn.com/s3/m/352d4f025e0e7cd184254b35eefdc8d376ee1400.png)
碱性蛋白酶活力测定【实验目的】1. 掌握测定碱性蛋白酶活力的原理和酶活力的计算方法。
2. 学习测定酶促反应速度的方法和基本操作。
【实验原理】酶活力是指酶催化某些化学反应的能力。
酶活力的大小可以用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示。
测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。
酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。
由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。
碱性蛋白酶在碱性条件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。
酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸，可与福林试剂（磷钨酸与磷钼酸的混合物）发生福林酚反应。
（福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定，容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，而呈现出不同深浅的蓝色。
）利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用碱性蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力。
【实验材料】1.实验器材电热恒温水浴槽；分析天平；容量瓶；移液管；721分光光度计2.实验试剂(1)福林试剂：在1L容积的磨口回流瓶中加入50g钨酸钠(Na2WO4·2H2O)、125g 钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、350ml蒸馏水、25ml 85％磷酸及50ml浓盐酸，充分混匀后回流10h。
回流完毕，再加25g硫酸锂、25ml蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴，冷却后定容到500ml。
过滤，置于棕色瓶中暗处保存。
使用前加4倍蒸馏水稀释。
(2)1%酪蛋白溶液：称取酪蛋白1克于研钵中，先用少量蒸馏水湿润后，慢慢加入0.2mol/L NaOH 4ml，充分研磨，用蒸馏水洗入100ml容量瓶中，放入水浴中煮沸15分钟，溶解后冷却，定容至100ml，保存于冰箱内。
(3)pH10缓冲溶液：甲液（0.05mol/L硼砂溶液）：取硼砂(Na2B4O7·10H2O) 19克，用蒸馏水溶解并定容至1000ml 。
碱性磷酸酶km实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除碱性磷酸酶km实验报告篇一：碱性磷酸酶Km值得测定(1)碱性磷酸酶Km值得测定原理在适宜条件下，酶促反应的初速度随底物浓度【s】增大而增大，当底物浓度达一定时则反应趋于稳定，反应速度最大。
关系可用米氏方程表示Km是酶的特征性常数。
将米氏方程变形为双倒数方程对1/s作图可算出Km步骤，以1/V结果由y=9.2961x+1.1465算出当y=0时x=-0.233，继而算出Km值=8.11mmol/L讨论计算出来的Km值与查资料所得到的值有一定的差距。
实验是粗测，本身存在实验误差，我们在操作过程中也造成误差，所以导致与实际值差距较大。
尿蛋白定性检测原理加热可以使蛋白质变性，溶液ph等于pI时溶解度最小。
步骤1.取大试管一支，加入5ml澄清尿液。
2.用试管夹持试管上端，酒精灯加热尿液斜面至沸。
(:碱性磷酸酶km实验报告)3.滴加5%乙酸2~3滴于尿液表面，轻轻混匀局部，加热。
结果未加热部分是澄清，加热部分浑浊明显讨论正常尿液中不会出现浑浊，本实验尿液加入了蛋白质。
尿液中如果出现沉淀则说明出现了病症。
分子筛层析（凝胶过滤法）原理多孔凝胶对不同大小分子的排阻效应，使不同分子分离。
大分子先出，小分子后出。
步骤1.取5~8滴4mg/ml蓝色葡萄聚糖液和4滴2mg/ml重铬酸钾液混匀。
2.将层析柱出水口打开，缓放柱内液体至凝胶柱表面加入混匀的待层析液。
3.从上口缓加蒸馏水，成2~3cm高水柱，出水口用小试管接水。
4.在上口加洗脱液洗脱。
每支小试管接1cm液体，并编号。
5.观察不同小试管的液体颜色的变化。
结果讨论分子筛层析能够大致的分离分子量不同的物质，但是分离的物质不纯有杂质，实验时间也相对较长，操作复杂。
篇二：实验名称碱性磷酸酶的分离纯化实验报告实验名称碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与动力学分析实验日期20XX年10月25号实验地点生化实验室合作者指导老师总分教师签名批改日期碱性磷酸酶（AKp或ALp）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。
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碱性蛋白酶（AKP）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法
注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。
货号：BC2300
规格：50T/24S
产品内容：
提取液：液体35mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存。
临用前加10mL蒸馏水溶解。
试剂二：粉剂×1瓶，4℃避光保存。
临用前加入10mL提取液，沸水浴中磁力搅拌溶解。
试剂三：液体50ml×1瓶，4℃保存。
试剂四：液体10mL×1瓶，4℃保存。
标准品：液体1mL×1支，0.25μmol/mL标准酪氨酸溶液，4℃保存。
产品说明：
AKP是指在碱性条件下催化蛋白质肽键水解的酶类，属于丝氨酸蛋白酶。
此外，该酶还能够水解酯键、酰胺键，具有转酯及转肽的功能。
该酶是主要工业用酶之一，广泛应用于制药、丝绸、食品、制革等行业。
在碱性条件下，AKP水解酪蛋白生成酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸生成钨蓝；钨蓝在680nm 有特征吸收峰，测定680nm吸光度增加速率，来计算AKP活性。
试验所需自备的仪器和用品：
研钵、台式离心机、可见分光光度计、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1.5mL EP管、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。
操作步骤：
一、粗酶液提取：
称取约0.1g组织，加入1mL提取液，冰上充分研磨，10000rpm4℃离心10min，取上清液，即粗酶液，置冰上待测。
或直接称取0.1g酶制品，加入1mL提取液，置冰上待测。
二、测定：
1.分光光度计预热30min以上，调节波长到680nm，蒸馏水调零。
2.试剂一、试剂二和试剂三置于40℃水浴保温30min以上。
3.样本测定（在1.5mLEP管中依次加入下列试剂）
试剂名称
对照管测定管空白管标准管
（µL）
粗酶液100100
试剂一200
试剂二200
混匀后40℃水浴保温10min
试剂一200
试剂二200
混匀后10000rpm4℃离心10min，取上清
上清200200
蒸馏水200
标准品200
试剂三1000100010001000
试剂四200200200200
混匀后40℃水浴保温20min
取1mL于1mL玻璃比色皿中，在680nm测定光吸收，分别记为A对照管、A测定管、A空白管、A标准管。
三、碱性蛋白酶活性计算：
（1）按蛋白浓度计算
AKP活性单位（U）定义：40℃每毫克蛋白每分钟催化水解产生1μmol酪氨酸为一个酶活单位。
AKP活性（U/mg prot）=C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×V1÷（Cpr×V2）÷T=0.125×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
AKP活性单位（U）定义：40℃每克样品每分钟催化水解产生1μmol酪氨酸为一个酶活单位。
AKP活性（U/g鲜重）=C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×V1÷（W×V2÷V3）÷T=0.125×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）÷W
C标准品：0.25μmol/mL标准酪氨酸溶液；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL）；
W：样品质量（g）；V1：酶促反应总体积（mL），0.5mL；
V2：加入反应体系中粗酶液体积（mL），0.1mL；V3：粗酶液总体积（mL），1mL；
T：催化反应时间（min），10min。
注意：若反应较弱，（A测定管-A对照管）差值较小，可适当延长反应时间（20-30min），即第一步水浴时间，最后计算酶活时对公式进行修改。