膜片钳技术及应用.PPT
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17
电极液的充灌
对于尖端较细的玻璃微电极，膜片 钳实验中常用的方法是：在微电极尾部施加 负压使尖端充灌电极内液，然后用注射器在 微电极尾部充灌电极内液，最后轻弹微电极 杆步使其内的气泡排出。
充灌长度为电极的1/3。
18
制备细胞标本
从理论上来讲，膜片钳实验用的细胞标 本可来自体内各种组织细胞，只要细胞表面 光滑，能与微电极尖端形成高阻封接即可。 但在标本制备上，不同组织细胞间联接牢固 程度不同，采用的分离方法也不完全相同。 大体上包括冲洗、酶解消化或机械分离以及 清洗等步骤。
21
高阻封接形成的电流图
22
膜片钳技术四种基本记录模式
细胞吸附膜片(cell-attached patch) 将两次拉制后经加热抛光的微管电极置于清
洁的细胞膜表面上，形成高阻封接，在细 胞膜表面隔离出一小片膜，既而通过微管 电极对膜片进行电压钳制，高分辨测量膜 电流，称为细胞贴附膜片。由于不破坏细 胞的完整性，
25
外面向外膜片（Outside-out patch ） 在全胞记录式的基础上，拉开电极
使之与胞体脱离，这是附在电极尖端的膜 片又可自动地将电极尖端口封住。此膜片 的外侧面向外其是在全细胞记录的基础上 改进而成。
26
膜片钳技术的应用
2008年，第二军医大学基础部生物物理研究 所的研究人员采用膜片钳和激光扫描共聚焦 显微镜，同步实时系统观察心肌细胞钙离子 的释放。
7
膜片钳实验系统虽然可因研究目的不同 而有所区别，但其基本组成是相同的，包括 膜片钳放大器和接口，显微镜和视频监视器 以及防震台和屏蔽罩等。
8
倒置显微镜、防震台、屏蔽罩、三 维操纵仪
倒 置 显 微 镜
三维操纵仪
9
膜片钳放大器
10
膜片钳实验流程
膜片钳实验方法包括： 制备玻璃微电极； 制备细胞标本； 建立高阻封接； 电流记录。
19
建立高阻封接
在显微镜下找到微电极，移动三维操 纵仪，使电极尖端接触细胞，形成高阻封接。
20
来自百度文库 建立高阻封接
高阻封接形成是进行膜片钳实验的关键 一步。微电极尖端与细胞膜形成封接的过程， 可以采用软件发出1mV脉冲电压作用于微电极， 造成膜两侧电位差发生变化，产生电极电流， 再通过显示屏，观察电极电流幅度的变化来 确定封接程度。在电极未入溶液之前，在显 示器上可见一直线。
11
制备玻璃微电极
拉制微电极 材料：硼硅酸盐毛细玻璃管。 要求：玻璃毛胚外径1.3~1.7㎜，内径
1.0~1.2㎜，壁的厚度在0.2㎜以上。管壁 越厚，拉制出的电极尖端管壁也越厚，电 极的跨壁电容就越小，噪声也就越低。
12
玻璃微电极及膜片的几何形状
13
电极拉制仪
14
拉制方法：两步拉制法。 第一步：使玻璃软化，并拉开一个距离，形
膜片钳技术
细胞生物学 樊国达 学号：
2014年12月23日
1
膜片钳技术
向细胞内注射恒定或变化的电流刺激， 纪录由此引起的膜电位的变化，这叫做电流 钳技术。在具体实验中，可通过给予细胞一 系列电流脉冲刺激，诱发细胞产生动作电位。
2
电压钳技术是通过向细胞内注射一 定的电流，抵消离子通道开放时所产生的离 子流，从而将细胞膜电位固定在某一数值。 由于注射电流的大小与离子流的大小相等、 方向相反。因此它可以反映离子流的大小和 方向。
27
基本原理
膜片钳能获得膜上钙离子通道的 离子电流，但不能对离子的移动进行实时定 位， 不能定量分析离子浓度。激光扫描共聚 焦显微镜可以对钙离子的移动进行实时定位, 但无法对单个离子通道的离子移动信号( 如 单通道电流)进行分析。
28
大鼠心室肌细胞 L2型钙通道电流(ICa,L )
29
采用膜片钳- 激光扫描共聚焦显微 镜同步实时控制系统可同时记录心肌细胞 L2 型钙离子电流信号及胞浆内 Ca2+浓度变化， 这样才能解决显微形态与功能分析同步实时 分析的问题，有助于进一步了解膜上钙离子 通道的内部机制。
5
膜片钳技术
所以，膜片钳技术是一种通过 微电极与细胞膜之间形成紧密接触的方法， 采用电压钳或电流钳技术对生物膜上的离 子通道的电活动进行记录的微电极技术。 膜片钳技术是一种特殊的电压钳/电流钳技 术。
6
膜片钳技术
用特制的玻璃微吸管吸附于细胞表面，使 之形成10～100GΩ的密封，被孤立的小膜片 面积为μm2量级，内中仅有少数离子通道。 然后对该膜片实行电压钳位，可测量单个离 子通道开放产生的pA量级的电流，这种通道 开放是一种随机过程。通过观测单个通道开 放和关闭的电流变化，可直接得到各种离子 通道开放的电流幅值分布，并分析膜电位与 离子浓度等之间的关系。
成一个细管，即拉制电极的颈部； 第二步：使用较低的热度，拉断细管部，成
为两个基本相同的玻璃微电极，此步控制 电极的尖端。一般拉制出的玻璃微电极尖 端直径为1~5μm。
15
涂胶和抛光
对玻璃微电极进行涂胶和抛光。 涂胶（疏水性涂料，如硅酮树脂）
主要是为了减小电极的跨壁电容。
16
抛光仪
抛光是指将玻璃微 电极靠近加热的铂丝， 从而使电极尖端变光滑 的过程。抛光主要目的 是。防止电极尖端刺破 细胞，利于高阻封接。
23
全细胞记录法(Whole-cell recording) 在高阻抗封接做好后，再给一个很
小的负压，将电极覆盖的膜吸破，使电极 内与整个细胞内相通，用这个方法可记录 进出整个细胞的电流。
24
内面向外膜片(inside-out patch) 高阻封接形成后，在将微管电极轻轻提起， 使其与细胞分离，电极端形成密封小泡， 在空气中短暂暴露几秒钟后，小泡破裂再 回到溶液中就得到“内面向外”膜片。
3
膜片钳技术
膜片钳技术与电流钳、电压钳 技术在命名上并不完全一致，后两者是从 电学概念的角度命名的，而“膜片钳”主 要是从机械物理学的角度命名的。
4
膜片钳技术
从字面上理解，膜片钳技术钳制的是“膜 片”，是指采用尖端经处理的微电极与细胞 膜发生紧密接触，使尖端下的这片细胞膜在 电学上与其他细胞膜分离，这大大降低了背 景噪声，使单通道微弱的电流得以分辨出来。
30
谢谢！
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电极液的充灌
对于尖端较细的玻璃微电极，膜片 钳实验中常用的方法是：在微电极尾部施加 负压使尖端充灌电极内液，然后用注射器在 微电极尾部充灌电极内液，最后轻弹微电极 杆步使其内的气泡排出。
充灌长度为电极的1/3。
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制备细胞标本
从理论上来讲，膜片钳实验用的细胞标 本可来自体内各种组织细胞，只要细胞表面 光滑，能与微电极尖端形成高阻封接即可。 但在标本制备上，不同组织细胞间联接牢固 程度不同，采用的分离方法也不完全相同。 大体上包括冲洗、酶解消化或机械分离以及 清洗等步骤。
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高阻封接形成的电流图
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膜片钳技术四种基本记录模式
细胞吸附膜片(cell-attached patch) 将两次拉制后经加热抛光的微管电极置于清
洁的细胞膜表面上，形成高阻封接，在细 胞膜表面隔离出一小片膜，既而通过微管 电极对膜片进行电压钳制，高分辨测量膜 电流，称为细胞贴附膜片。由于不破坏细 胞的完整性，
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外面向外膜片（Outside-out patch ） 在全胞记录式的基础上，拉开电极
使之与胞体脱离，这是附在电极尖端的膜 片又可自动地将电极尖端口封住。此膜片 的外侧面向外其是在全细胞记录的基础上 改进而成。
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膜片钳技术的应用
2008年，第二军医大学基础部生物物理研究 所的研究人员采用膜片钳和激光扫描共聚焦 显微镜，同步实时系统观察心肌细胞钙离子 的释放。
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膜片钳实验系统虽然可因研究目的不同 而有所区别，但其基本组成是相同的，包括 膜片钳放大器和接口，显微镜和视频监视器 以及防震台和屏蔽罩等。
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倒置显微镜、防震台、屏蔽罩、三 维操纵仪
倒 置 显 微 镜
三维操纵仪
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膜片钳放大器
10
膜片钳实验流程
膜片钳实验方法包括： 制备玻璃微电极； 制备细胞标本； 建立高阻封接； 电流记录。
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建立高阻封接
在显微镜下找到微电极，移动三维操 纵仪，使电极尖端接触细胞，形成高阻封接。
20
来自百度文库 建立高阻封接
高阻封接形成是进行膜片钳实验的关键 一步。微电极尖端与细胞膜形成封接的过程， 可以采用软件发出1mV脉冲电压作用于微电极， 造成膜两侧电位差发生变化，产生电极电流， 再通过显示屏，观察电极电流幅度的变化来 确定封接程度。在电极未入溶液之前，在显 示器上可见一直线。
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制备玻璃微电极
拉制微电极 材料：硼硅酸盐毛细玻璃管。 要求：玻璃毛胚外径1.3~1.7㎜，内径
1.0~1.2㎜，壁的厚度在0.2㎜以上。管壁 越厚，拉制出的电极尖端管壁也越厚，电 极的跨壁电容就越小，噪声也就越低。
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玻璃微电极及膜片的几何形状
13
电极拉制仪
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拉制方法：两步拉制法。 第一步：使玻璃软化，并拉开一个距离，形
膜片钳技术
细胞生物学 樊国达 学号：
2014年12月23日
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膜片钳技术
向细胞内注射恒定或变化的电流刺激， 纪录由此引起的膜电位的变化，这叫做电流 钳技术。在具体实验中，可通过给予细胞一 系列电流脉冲刺激，诱发细胞产生动作电位。
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电压钳技术是通过向细胞内注射一 定的电流，抵消离子通道开放时所产生的离 子流，从而将细胞膜电位固定在某一数值。 由于注射电流的大小与离子流的大小相等、 方向相反。因此它可以反映离子流的大小和 方向。
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基本原理
膜片钳能获得膜上钙离子通道的 离子电流，但不能对离子的移动进行实时定 位， 不能定量分析离子浓度。激光扫描共聚 焦显微镜可以对钙离子的移动进行实时定位, 但无法对单个离子通道的离子移动信号( 如 单通道电流)进行分析。
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大鼠心室肌细胞 L2型钙通道电流(ICa,L )
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采用膜片钳- 激光扫描共聚焦显微 镜同步实时控制系统可同时记录心肌细胞 L2 型钙离子电流信号及胞浆内 Ca2+浓度变化， 这样才能解决显微形态与功能分析同步实时 分析的问题，有助于进一步了解膜上钙离子 通道的内部机制。
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膜片钳技术
所以，膜片钳技术是一种通过 微电极与细胞膜之间形成紧密接触的方法， 采用电压钳或电流钳技术对生物膜上的离 子通道的电活动进行记录的微电极技术。 膜片钳技术是一种特殊的电压钳/电流钳技 术。
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膜片钳技术
用特制的玻璃微吸管吸附于细胞表面，使 之形成10～100GΩ的密封，被孤立的小膜片 面积为μm2量级，内中仅有少数离子通道。 然后对该膜片实行电压钳位，可测量单个离 子通道开放产生的pA量级的电流，这种通道 开放是一种随机过程。通过观测单个通道开 放和关闭的电流变化，可直接得到各种离子 通道开放的电流幅值分布，并分析膜电位与 离子浓度等之间的关系。
成一个细管，即拉制电极的颈部； 第二步：使用较低的热度，拉断细管部，成
为两个基本相同的玻璃微电极，此步控制 电极的尖端。一般拉制出的玻璃微电极尖 端直径为1~5μm。
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涂胶和抛光
对玻璃微电极进行涂胶和抛光。 涂胶（疏水性涂料，如硅酮树脂）
主要是为了减小电极的跨壁电容。
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抛光仪
抛光是指将玻璃微 电极靠近加热的铂丝， 从而使电极尖端变光滑 的过程。抛光主要目的 是。防止电极尖端刺破 细胞，利于高阻封接。
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全细胞记录法(Whole-cell recording) 在高阻抗封接做好后，再给一个很
小的负压，将电极覆盖的膜吸破，使电极 内与整个细胞内相通，用这个方法可记录 进出整个细胞的电流。
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内面向外膜片(inside-out patch) 高阻封接形成后，在将微管电极轻轻提起， 使其与细胞分离，电极端形成密封小泡， 在空气中短暂暴露几秒钟后，小泡破裂再 回到溶液中就得到“内面向外”膜片。
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膜片钳技术
膜片钳技术与电流钳、电压钳 技术在命名上并不完全一致，后两者是从 电学概念的角度命名的，而“膜片钳”主 要是从机械物理学的角度命名的。
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膜片钳技术
从字面上理解，膜片钳技术钳制的是“膜 片”，是指采用尖端经处理的微电极与细胞 膜发生紧密接触，使尖端下的这片细胞膜在 电学上与其他细胞膜分离，这大大降低了背 景噪声，使单通道微弱的电流得以分辨出来。
30
谢谢！
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