Biomarker Discovery 生物标志物发现的蛋白质组学
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Thermo Fisher
S C I E N T I F I C
The World Leader in Serving Science
Biomarker Discovery 生物标志物发现的蛋白质组学
Protein Biomarker Discovery 发现蛋白的生物标志物
蛋白生物标志物发现是理解病理的非常重要的一步，也是在药物研发过程中，鉴 定潜在药物和诊断目标物的重要一步。 需使用一个相对定量的差别分析方法，发现这些假定的、跟疾病有关的标志物， 并要求严格的实验方法来减少样本－样本之间的差异性。 定量方法
iTRAQ定量技术
PepQuan：用于同位素标记的定量分析软件
Label-Free 定量技术（不用昂贵的同位素试剂）
Global protein identification and quantification technology using two-dimensional liquid chromatography nanospray mass spectrometry.
•可以通过检测和搜索，来判断体系中，蛋白是否表达。 •同时，峰面积的差异（比值）可以推导出不同的体系中，蛋白被表达的量不同， 和表达量的相对比较。
Biomarkers (新方法)
Sample loop SCX
Autosampler
Sample
RP
10 l/min 200 nl/min Waste Waste Waste
RT: 23.17 AA: 3126382858 BPtide: DGAGDVAFVK Ratio 1:1
Peptide: VLPVPQK Ratio 0.5:1
Biomarkers (新方法)
建立方法的模型体系
Prove of concept: 一个蛋白的峰面积是否和其浓度正相关？
用于鉴定的MS/MS数据 :
Peptide: DGAGDVAFVK Protein: Serotransferrin
2. Quantitation定量 全扫描MS的峰面积用于相对定量 Sample A:
Relative Abundance 100 75 50 25 A
100 Relative Abundance
RT: 25.30 AA: 24048812740 BP: 490.4
75 50 25 0 100 75 50 25 0 20
C
RT: 23.37 AA: 1430502253 BP: 780.5
0
100 75 50 25 0 20 25 Time (min) 30 B
D
Sample B:
RT: 25.17 AA: 21669592737 BP: 490.3
Test: 肌红蛋白myoglobin用胰蛋白酶酶解后，用LC-MS/MS分析，浓度从 10 fmol ～100 pmol
Biomarkers (新方法)
Prove of concept: 肌红蛋白myoglobin用胰蛋白酶酶解后，用LC-MS/MS 分析，浓度从 10 fmol ～100 pmol
举例：发现生物标记物Biomarkers的新方法
我们的目标: 不要凝胶! 不用同位素标记! 当然也不用SELDI! 定量复杂混合物中的蛋白的方法：使用LC-MS/MS实验，用肽产生的 峰面积定量 理论上, 肽的峰面积同浓度成正比。因此，来自于一种蛋白的肽的峰 面积，就同这种蛋白在混合物体系中的浓度成正比。 如果一种蛋白在一种体系中和另一种体系中的表达量不同，或者是 有/无的差异，或者是浓度的差异，在LC-MS/MS中，就可以体现：
Anal Chem. 2003 Dec 1;75(23):6658-65
Chelius D, Zhang T, Wang G, Shen RF. The peak areas (integrated ion counts over the peptide elution time) of all identified peptides are calculated, and the relative concentration of each protein is determined by comparing the peak areas of all peptides from that protein in one sample versus those from the other. Using this strategy, we compared the relative level of protein expression of A431 cells (an epidermal cell line) grown in the presence or absence of epidermal growth factor (EGF). Our results are consistent with the published observations of the transient effects of EGF
• • • DIGE：2D凝胶电泳和荧光显色分析 昂贵的同位素标记方法：ICAT、iTRAQ、SILAC等 Label-Free的方法：完全不用同位素标记
Thermo Scientific完整的工作流程提高了检测方法的可靠性——那些被检测到的
差别，即真实地反映了生物意义上的差别
ICAT定量
Differential Quantitation of 491 Proteins
Sampe Pump
MS Pump Protein Ratio Protein 1 Protein 2 Protein 3 1 1 1 0.5 2
Mass spec data
Analyze separatly
Digest Sample 1 Sample 2
Protein 4 Protein 5
1. Identification，鉴定蛋白的有无
100 95 90 85
15399
Relative Abundance
80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 60 70 60
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Biomarker Discovery 生物标志物发现的蛋白质组学
Protein Biomarker Discovery 发现蛋白的生物标志物
蛋白生物标志物发现是理解病理的非常重要的一步，也是在药物研发过程中，鉴 定潜在药物和诊断目标物的重要一步。 需使用一个相对定量的差别分析方法，发现这些假定的、跟疾病有关的标志物， 并要求严格的实验方法来减少样本－样本之间的差异性。 定量方法
iTRAQ定量技术
PepQuan：用于同位素标记的定量分析软件
Label-Free 定量技术（不用昂贵的同位素试剂）
Global protein identification and quantification technology using two-dimensional liquid chromatography nanospray mass spectrometry.
•可以通过检测和搜索，来判断体系中，蛋白是否表达。 •同时，峰面积的差异（比值）可以推导出不同的体系中，蛋白被表达的量不同， 和表达量的相对比较。
Biomarkers (新方法)
Sample loop SCX
Autosampler
Sample
RP
10 l/min 200 nl/min Waste Waste Waste
RT: 23.17 AA: 3126382858 BPtide: DGAGDVAFVK Ratio 1:1
Peptide: VLPVPQK Ratio 0.5:1
Biomarkers (新方法)
建立方法的模型体系
Prove of concept: 一个蛋白的峰面积是否和其浓度正相关？
用于鉴定的MS/MS数据 :
Peptide: DGAGDVAFVK Protein: Serotransferrin
2. Quantitation定量 全扫描MS的峰面积用于相对定量 Sample A:
Relative Abundance 100 75 50 25 A
100 Relative Abundance
RT: 25.30 AA: 24048812740 BP: 490.4
75 50 25 0 100 75 50 25 0 20
C
RT: 23.37 AA: 1430502253 BP: 780.5
0
100 75 50 25 0 20 25 Time (min) 30 B
D
Sample B:
RT: 25.17 AA: 21669592737 BP: 490.3
Test: 肌红蛋白myoglobin用胰蛋白酶酶解后，用LC-MS/MS分析，浓度从 10 fmol ～100 pmol
Biomarkers (新方法)
Prove of concept: 肌红蛋白myoglobin用胰蛋白酶酶解后，用LC-MS/MS 分析，浓度从 10 fmol ～100 pmol
举例：发现生物标记物Biomarkers的新方法
我们的目标: 不要凝胶! 不用同位素标记! 当然也不用SELDI! 定量复杂混合物中的蛋白的方法：使用LC-MS/MS实验，用肽产生的 峰面积定量 理论上, 肽的峰面积同浓度成正比。因此，来自于一种蛋白的肽的峰 面积，就同这种蛋白在混合物体系中的浓度成正比。 如果一种蛋白在一种体系中和另一种体系中的表达量不同，或者是 有/无的差异，或者是浓度的差异，在LC-MS/MS中，就可以体现：
Anal Chem. 2003 Dec 1;75(23):6658-65
Chelius D, Zhang T, Wang G, Shen RF. The peak areas (integrated ion counts over the peptide elution time) of all identified peptides are calculated, and the relative concentration of each protein is determined by comparing the peak areas of all peptides from that protein in one sample versus those from the other. Using this strategy, we compared the relative level of protein expression of A431 cells (an epidermal cell line) grown in the presence or absence of epidermal growth factor (EGF). Our results are consistent with the published observations of the transient effects of EGF
• • • DIGE：2D凝胶电泳和荧光显色分析 昂贵的同位素标记方法：ICAT、iTRAQ、SILAC等 Label-Free的方法：完全不用同位素标记
Thermo Scientific完整的工作流程提高了检测方法的可靠性——那些被检测到的
差别，即真实地反映了生物意义上的差别
ICAT定量
Differential Quantitation of 491 Proteins
Sampe Pump
MS Pump Protein Ratio Protein 1 Protein 2 Protein 3 1 1 1 0.5 2
Mass spec data
Analyze separatly
Digest Sample 1 Sample 2
Protein 4 Protein 5
1. Identification，鉴定蛋白的有无
100 95 90 85
15399
Relative Abundance
80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 60 70 60