常用的植物转基因技术

五种常用的植物转基因技术

植物转基因技术是通过各种物理的、化学的和生物的方法将从动物、植物及微生物中分离的目的基因整合到植物基因组中，使之正确表达和稳定遗传并且赋予受体植物预期性状的一种生物技术方法。1983年，首例抗病毒转基因烟草的成功培育标志着人类开始尝试利用转基因技术改良农作物。目前，植物转基因技术已在作物改良和育种领域发挥了重要作用。通过植物转基因技术，一些来自于动物、植物及微生物的有益基因如抗病／虫基因、抗非生物胁迫性状基因及特殊蛋白基因已被转化到农作物中以改良现有的农作物和培育新的农作物品种。以DNA重组技术为基础的植物转基因技术极大地扩展了基因信息的来源，打破了远缘物种间自身保持遗传稳定性的屏障。植物转基因技术已应用到玉米、水稻、小麦、大豆和棉花等许多农作物。同时，该技术也正在被尝试用于茄子和草莓等其它的作物中‘1’纠。目前，根据转基因植物的受体类型，植物转基因方法可以分为3大类：以外植体为受体的基因转化方法，如农杆菌介导法、基因枪法和超声波介导法；以原生质体为受体的基因转化方法，如聚乙二醇法、电击法、脂质体法及磷酸钙-DNA共沉淀法；以种质系统为受体的基因转化方法，如子房注射法和花粉管通道法。由于以原生质体为受体的基因转化方法有原生质体培养难度大，培养过程繁杂，培养工作量大且培养技术不易掌握；原生质体再生植株的遗传稳定性差、再生频率低并且再生周期长；相关的转化方法的转化率低、效果不理想等缺点，所以该类基因转化方法未被作为植物转基因的常规方法广泛使用。本文将对农杆菌介导法、基因枪法、超声波介导法、子房注射法和花粉管通道法的原理、基本步骤和优缺点作以简要介绍。

1以外植体为受体的基因转化方法

1.1农杆菌介导法

农杆菌介导法是最早应用、最实用有效并且具有最多成功实例的一种植物转基因方法。农杆菌是一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌。目前，用于植物转基因介导的农杆菌是根癌农杆菌和发根农杆菌。某些根癌农杆菌和发根农杆菌分别含有大小为200 -800bp的结构和功能相似的Ti质粒和Ri质粒。Ti质粒和Ri质粒含有3个功能区：参与农杆菌侵染植物过程的vir区、参与农杆菌基因整合到宿主植物基因组过程的T-DNA区、在农杆菌中启动质粒复制的ori区。在vir区上的vir操纵子群作用下，Ti 质粒和Ri质粒能将自身的T-DNA转入宿主植物细胞内，而后将T-DNA整合到植物基因组中。T— DNA 是质粒上一段10—30kb的序列，它的两端各有一段高度保守的25bp的同向重叠序列。由于T-DNA 转化无序列特异性，因此可用任何基因片段代替原来的T-DNA基因片段进行。

农杆菌介导法的原理是：在农杆菌基因ehvA，chvB， pscA，and att家族所编码的蛋白和植物伤口产生的酚类物质和糖类物质的共同作用下，农杆菌识别并附着在宿主细胞壁上。virD4和virB基因编码蛋白组成的type IV分泌系统将单链VirD2-T-DNA复合体运送到宿主细胞内。此外，VirE3、VirE2和VirF蛋白也通过该系统进入宿主细胞质中。在宿主细胞质中，VirE2蛋白与VirD2-T-DNA复合体结合。在VirD2核定位信号、某些农杆菌蛋白和宿主细胞蛋白的共同作用下，VirD2-T-DNA复合体进入细胞核。在VirD2、VirE2、某些宿主细胞核蛋白如AtKu80和DNA连接酶的作用下，T-DNA被整合到宿主基因组中，但具体过程不详。

农杆菌介导法的基本步骤是：(1)诱导目标植物外植体；(2)构建含有目的基因的质粒；(3)质粒导人合适的农杆菌菌株中及该菌株的活化过程；(4)植物愈伤组织的微伤口处理及农杆菌侵染；(5)共培养及脱菌处理；(6)愈伤组织筛选、分化与植株再生；(7)再生植株及其后代的外源基因及其表达产物的分子检测；(7)转基因T1代的目标性状鉴定。

农杆菌介导法具有操作简单、转化效率较高、重复性好、单拷贝整合、基因沉默现象少、转育周期

短、转化片段较大且插入片段明显及实验费用低等优点，因此，农杆菌介导法是目前应用最广泛的一种植物转基因方法。但是，农杆菌介导法也存在一些问题。首先，在自然条件下，农杆菌只侵染双子叶植物。对于单子叶植物，虽然可以采用人工添加酚类物质的方法，诱导农杆菌完成侵染过程，但是单子叶植物的组织培养有一定的难度。目前，只发现20多种单子叶植物能被农杆菌侵染。其次，植物细胞壁对农杆菌介导转化效果有一定影响。再次，影响农杆菌转化效率的因素较多。在设计农杆菌介导实验时，研究者要考虑农杆菌菌株类型、质粒载体类型及两者间的匹配情况；外植体的基因型、来源和发育状态；培养基成分及某些诱导条件如是否加入酚类物质等。此外，植物愈伤组织的诱导过程有时会存在困难。

1.2基因枪法

基因枪是20世纪80年代初由园艺学家Sanford等人发明的。在此基础上，Klein等以基因枪为工具发展了一套物理学转基因方法。经过10多年的改进和提高，基因枪的发展经历了3个阶段：第一代基因枪是1987年由 Sanford等设计制造的火药基因枪，它是以火药爆炸的冲力为动力；第二代基因枪是高压放电基因枪，它是以高压放电引起水滴汽化所产生的冲力为动力；第三代基因枪是压缩气体驱动基因枪，它是以高压惰性气体为动力。由于存在明显的安全性和稳定性问题，前两代基因枪现已基本被淘汰。作为一种物理学方法，基因枪技术已成功应用在烟草、水稻、小麦、甘蔗、棉花、大豆、洋葱、番木瓜和葡萄等许多农作物的品种改良上，并且该技术被用于瞬间表达研究和培育稳定的转基因植株等研究领域。

基因枪法的原理是：利用基因枪产生的高压动力冲击波将包裹外源DNA的重金属颗粒（如钨粉、金粉等）射穿植物细胞壁和细胞膜，射入植物细胞，使外源DNA随机整合到植物细胞染色体中，达到使外源DNA在受体植物中正常表达和稳定遗传的目的。

基因枪法的基本步骤是：(1)诱导目标植物外植体；(2)构建含有目的基因的质粒或制备外源DNA 样品；(3)重金属颗粒的外源基因包被过程；(4)植物愈伤组织的前处理；(5)基因枪轰击过程；(6)愈伤组织筛选、分化与植株再生；(7)再生植株及其后代的外源基因及其表达产物的分子检测。

基因枪法具有操作方法简单，转化时间短、数量大，对受体植物几乎无要求，基因用量少，可转化基因片段大，可获得较长时间的瞬时表达，实验费用低等优点。然而基因枪法也有许多缺点。首先，由于基因枪法转导的外源 DNA是随机整合到宿主基因组中的，这不利于外源DNA在宿主植物中稳定地表达和遗传。其次，因为随机整合位点不固定和外源DNA拷贝数多等问题会导致转基因后代的突变率提高、整合的外源DNA丢失及基因沉默等现象。此外，基因枪法还存在转化过程对细胞有损害、转化率低、嵌合体多、可重复性差及设备昂贵等缺点。

1.3超声波介导法

作为一种新创建的物理学基因转化方法，超声波介导法已被用于真核生物的基因转化研究和人类基因治疗领域。在农作物基因转化研究中，超声波介导法已成功地将外源DNA转导人烟草和甜菜的原生质体、玉米和小麦的未成熟胚及烟草的叶片中。目前，该方法常与农杆菌介导法共用以提高外源DNA 的转化效率。

超声波介导法的原理是：利用超声波的空化作用，在细胞膜上产生可恢复的渗透孔空洞，从而使外源DNA进入细胞。

超声波介导法的基本步骤是：(1)目标植物外植体的制备；(2)目的基因的制备；(3)超声波处理；

(4)转化受体俞伤组织的筛选与植株再生；(5)再生植株及其后代的外源基因及其表达产物的分子检测。

超声波介导法的优点有：该方法不受宿主范围的限制，可以将外源基因导入任何基因型的植物细胞内；该方法可以避免对细胞的机械性损伤，有利于原生质体的存活；该方法操作简便、设备便宜等优点。由于超声波介导法也存在外源DNA随机整合及外源DNA拷贝数多等问题。因此，该方法也会导致转基因后代的突变率提高、整合的DNA丢失及基因沉默等现象。

2以种质系统为受体的基因转化方法