产漆酶细菌的筛选、鉴定及产酶条件的初步优化
漆酶高产菌株的筛选实验方案
漆酶简介漆酶是一种含铜的多酚氧化酶(Laccase, P-diphenol oxidase, EC.1.10.3.2)，广泛分布于高等动植物、昆虫、真菌分泌物和少量细菌中，其中最主要的是担子菌亚门的白腐真菌。
漆酶为含铜的糖蛋白，约由500 个氨基酸组成，多为单一多肽，个别为四聚体。
糖配基占整个分子的10%～45%，糖组成包括氨基己糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖和阿拉伯糖等。
由于分子中糖基的差异，漆酶的分子量随来源不同会有很大差异，甚至来源相同的漆酶分子量也会不同。
通过对漆酶蛋白质晶体结构的研究发现,漆酶具有3个铜离子结合位点,共结合4个铜离子,且这4个铜离子处于漆酶的活性部位,在催化氧化反应中起决定作用，如果除去铜离子,漆酶将失去催化作用。
漆酶具有较强的氧化还原能力，能催化多酚、多氨基苯等物质的氧化，使分子氧直接还原成水，将酚类和芳胺类化合物还原成醌类物质，没有副产物的生成。
由于漆酶具有特殊的催化性能和广泛的作用底物，使得漆酶具有广泛的应用价值。
漆酶应用主要集中在制浆造纸，特别是纸浆的生物漂白，环境保护，木质纤维素降解等方面。
造纸工业方面，由于漆酶能高效的降解木质素及与木质素具有相似结构的物质，避免造纸工序中所使用的化学物质影响环境。
环境保护方面，漆酶能有效的除去工业废水、化学农药当中的毒物酚、芳胺、单宁和酚醛化合物，生物消除有毒化合物，使得漆酶在废水处理等环保事业有广阔的前景。
分光光度法测定漆酶活力最常用的底物是2,2’-连氮一双(3-乙基苯并唆毗咯琳-6-磺酸)(ABTS)。
实验一 高产漆酶菌株酶活测定1 主要试剂的配制（1） 0.2 mmol/L pH 4.5柠檬酸－柠檬酸钠缓冲溶液A 液：0.2 mmol/L 柠檬酸溶液：称取柠檬酸21.014 g ，加入蒸馏水溶解定容至500mL 。
B 液：0.2 mmol/L 柠檬酸钠溶液：称取柠檬酸钠29.412 g ，加入蒸馏水溶解定容至500mL 。
一株产漆酶真菌的筛选、鉴定及发酵研究
（ ２ ） 培养 基 ． Ｐ ＤＡ 培 养 基 （ ｇ ／ Ｌ ） ： 葡 萄糖 ２ Ｏ ， 土豆 （ 浸出汁） ２ ０ ０ ， 琼脂粉 １ ５ ， ｐ Ｈ 值 自然． 筛选培养基 ： Ｐ ＤＡ 培养基 添加 愈创 木酚 （ Ｏ ． ０ ４ ） 及卡 那霉 素 （ ５ ０ ｍｇ ／ Ｌ ） ． 种 子培 养 基 （ ｇ ／ Ｌ ） ： 葡萄糖 ２ Ｏ ， 蛋 白胨 ５ ， 酵母
粉３ ， ｐ Ｈ 值 自然． 基本 发 酵 产 酶 培 养 基 （ ｇ ／ Ｌ ） ： 葡萄糖 ２ ０ ， 酒石酸铵 ８ ， ＫＨ Ｐ Ｏ ２ ， Ｍｇ Ｓ Ｏ ・７ Ｈ Ｏ ０ ． ６ ，
Ｃａ ＣＩ ２・２ Ｈ２ Ｏ ０ ． ８， Ｃｕ Ｓ Ｏ４・５ Ｈ２ Ｏ ０ ． ２ ５ ， Ｔｗｅ ｅ ｎ ８ ０ ０ ． ２ ５ ， ｐ Ｈ ６ ． ０ ．
Ｍｇ Ｓ Ｏ４・ ７ Ｈ２ Ｏ Ｏ ． ６ ， Ｃ ａ Ｃ ｌ ｚ ・ ２ Ｈ２ Ｏ Ｏ ． ８ ， Ｃ ｕ 。 Ｏ ． ２ ５ （ １ ｍＭ） ， ｐ Ｈ ５ ． ５ －６ ． ５ ， 其漆 酶 最 高 酶 活 水 平 为 ５ ７ １ ． ３ ２ Ｕ／ Ｌ ．
关 键 词： 漆酶 ； 棘孢木霉 ； 分子鉴定 ； 发 酵 优 化 文献标识码 ： Ａ 中 圈分 类 号 ： Ｑ ９ ３ — ３ ３ １
所有 已研究的木腐真菌 中均有发现， 同时也存在于部分植物、 细菌和昆虫之 中［ ． 随着漆酶 的发现和深入 研究 ， 在某 些 小分 子化合 物作 为介 体存 在 的条件 下 ， 漆 酶 还能 够 氧 化非 酚 型木 质 素结 构 ． 漆 酶 对木 质 素 以 及与 木质 紊结 构相 似 的许 多 环境 污染物 的 降解 作 用越来 越受 到人们 的重 视［ ２ ］ ． 在 纸 浆去 木 质化 、 有 机 染 料脱 色［ 、 纺织 污水 处理 ［ 引、 生 物传感 器 ［ 、 食 品饮料 行业 、 有机 合成 ］ 、 药物 合成 ｍ］ 、 医疗诊 断 和作 为
一株产漆酶菌株的筛选鉴定和发酵条件的研究
关键词 ： 色木霉 ； 绿 愈创 木酚 ； 态学特征 ； 形 酶活 力
中图 分 类 号 ：９ ５ Ｑ ３ 文 献标 识 码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ ８— ６ ２ ２０ ）３— ０ ０— ４ １０ ９３ （０ ８ ０ ０４ ０
刘 敏， 张 明
２ ０３ ） ３０６ （ 安徽 农 业 大学生命科 学 学院 ， 合肥
摘
要： 以愈创 木酚为底 物 ， 采用 平板 筛选法 筛选得到 一株 产漆酶 菌株 ＷＳ ． ， 态学特性表 明该 茵属 于绿 色木 １２ 形
霉。对产酶条件的初步研究结果表明 ， Ｉ ＷＳ 一 ２菌株 的产 酶高峰期 出现在接 种培 养后 的第 ４ 。与蔗 糖、 糖、 乳糖 ｄ 乳 半 和 可溶性淀粉相 比， 以葡萄糖 为碳 源时， 发酵上清液 的漆 酶活力明显要 高， 大值 达 ２０ ／ 。 以 Ｎ １ 最 ３Ｕ Ｌ Ｈ Ｃ 为氮源 ， 最 有利 于 ＷＳ － １２漆酶的产生 ， 酶活力最高可达到 ２ ４ ／ 。００ ｍｎｌＬ的愈创木 酚和 Ａ Ｔ 漆 ３Ｕ Ｌ ， １ ｒ ／ ｏ Ｂ Ｓ对 ＷＳ － Ｉ２产漆 酶有明
明 ， － ｉ： ｈ ｎｍ ｎ＠ ａａ．ｄ ． ｎ Ｅｍａ ｚａｇ ｉｇ ｈｕ ｅｕ ｃ 。 ｌ
基金项 目： 安徽省高校 “ 十五” 优秀人才计划（ 教秘人 １０４— ０ ） 【 ２０ １０
收 稿 日期 ：０７一 ４—２ ２０ ｏ ８
化变色圈的菌落进行分离纯化 。将分离菌株 分别接种
到筛选平板上 和 Ｐ Ａ平板 上 ，８Ｃ恒 温培养 ， 出筛 Ｄ ２￣ 选 选平板上 出现明显 氧化变色圈 的菌 株 ， 通过 Ｐ Ａ平 并 Ｄ
产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究
产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究
产漆酶细菌是一类具有重要应用价值的菌种，能够分解淀粉类和纤维素类物质，具有广泛的应用前景。
本研究旨在通过筛选和鉴定，找到高效产漆酶的细菌菌株，并研究其固体发酵条件。
我们从土壤和水样品中收集多个潜在的产漆酶细菌菌株。
这些菌株被分离、纯化并保存以备后续的实验使用。
然后，我们使用碘碟法进行最初的筛选，通过菌株在含有淀粉或纤维素的培养基上形成明显溶解区来判断其分解能力。
筛选出的阳性菌株被进一步培养、扩增和鉴定。
鉴定的流程主要包括形态学观察、生化试验和分子生物学鉴定。
形态学观察包括菌落形态、细胞形态、孢子形态等。
生化试验主要包括氧化酶试验、淀粉分解酶试验、纤维素分解酶试验等。
分子生物学鉴定则主要通过16S rRNA序列分析来确定菌株的分类地位。
通过以上的筛选和鉴定过程，我们最终确定了一株高效产漆酶的细菌菌株。
接下来，我们进行了固体发酵条件的研究。
我们对产漆酶细菌的最适发酵基质进行了选择和优化。
我们评价了不同基质如淀粉、纤维素、豆饼等对产漆酶产量的影响，并通过响应曲面法确定了最佳基质比例。
然后，我们研究了发酵温度、pH值、初始菌液浓度、培养基添加剂等参数对产漆酶产量的影响，并进行了优化。
我们对优化后的固体发酵条件进行了验证和比较。
通过对产漆酶产量、酶活力和底物降解效率的测试，我们确定了最佳的固体发酵条件。
漆酶高产菌的筛选及产酶优化
漆酶高产菌的筛选及产酶优化刘家扬;蔡宇杰;廖祥儒;王欣;李枝玲;张大兵【期刊名称】《食品与机械》【年(卷),期】2010(026)004【摘要】采用愈创木酚初筛平板从干枯的木头中筛选得到一株产漆酶活力较高的菌株SYBC-L3(以下简称L3),在含有愈创木酚的PDA平板上生长时菌落周边出现明显的铁红色变色圈.通过对L3发酵产漆酶的单因素试验及L9(34)正交试验,确定了最适发酵条件,优化后的培养基为:麦芽糖 12 g/L, 豆粕 6 g/L,CuSO4 0.5g/L,KH2PO4 1 g/L,Na2HPO4 0.2 g/L,MgSO4 ·7H2O 0.5 g/L,MnSO4 0.034 g/L, 愈创木酚0.8 mmol/L,吐温-80 0.5g/L;优化后的培养条件为:接种量10%(V/V),装液量80 mL/250 mL, 起始pH 4,转速200 r/min,温度30 ℃,以DMP 为底物在第8天时酶活可达60 130 U/L,比优化前提高42倍.【总页数】6页(P10-14,45)【作者】刘家扬;蔡宇杰;廖祥儒;王欣;李枝玲;张大兵【作者单位】江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏,无锡,214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏,无锡,214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏,无锡,214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏,无锡,214122;江苏汉邦科技有限公司,江苏,淮安,223001;江苏汉邦科技有限公司,江苏,淮安,223001【正文语种】中文【相关文献】1.产漆酶真菌筛选及其产酶条件的优化 [J], 柴新义;安双登;盛硕;苏海2.漆酶高产菌株的筛选及产酶条件优化 [J], 王丽娟;何培新;李明丽3.产漆酶裂褶菌的筛选及其产酶培养条件优化研究 [J], 赵文娟;徐升运;任平4.产漆酶真菌的筛选及发酵产酶条件的优化 [J], 王雪; 刘太林; 杨焜梅; 王志成; 湛莹; 薛兆淞; 李永佳5.栓菌属高产漆酶菌株的筛选及其发酵产酶条件研究初报 [J], 朱明旗;曹支敏;李振歧因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究
产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究
一、引言
漆酶是一种重要的工业酶，具有去除污水中有机物、漆水处理、食品添加剂等广泛的
应用。
目前，大部分漆酶产生菌株来源于土壤和水体等自然环境中。
而固体发酵是一种能
够充分利用含固体物质的废弃物进行生物转化的方式，可用于酶的生产。
本研究将选择适
合固体发酵的细菌菌株，进行筛选鉴定及研究其固体发酵条件，以提高漆酶的产量和活
性。
二、方法和材料
1. 菌株的筛选
从土壤和水体中分离细菌，根据产酶圈的形成情况进行初步筛选。
选择产酶圈明显的
菌株进行进一步的鉴定。
2. 细菌的鉴定
利用形态学、生理生化特性和16S rRNA序列分析等方法对选出的菌株进行鉴定，确定其属种。
3. 固体发酵条件研究
确定最适合细菌产漆酶的固体发酵条件，包括pH、温度、底物浓度、初始湿度等。
三、结果
1. 菌株的筛选和鉴定
筛选出多个具有产酶能力的细菌菌株，经鉴定后确定其中一株为Bacillus subtilis。
该菌株的漆酶活性较高，适合用于固体发酵生产。
2. 固体发酵条件研究
在固体发酵条件研究中，发现Bacillus subtilis固体发酵最适宜的pH为7.0，温度为37℃，底物浓度为10g/L，初始湿度为60%。
四、讨论
本研究通过菌株的筛选鉴定和固体发酵条件研究，成功地确定了适合固体发酵生产漆
酶的Bacillus subtilis细菌菌株，以及最适宜的发酵条件。
这些结果为进一步大规模生
产漆酶提供了重要的理论依据和技术支持。
产漆酶裂褶菌的筛选及其产酶培养条件优化研究
产漆酶裂褶菌的筛选及其产酶培养条件优化研究摘要：从采自秦岭的森林腐木菌苔上分离到一株产漆酶的裂褶菌（Schizophyllum commune Fr.）菌株mys005，对其产漆酶培养方式、培养基组成及培养条件进行了优化试验。
结果表明，裂褶菌菌株mys005的产漆酶适宜培养方式为液体浅层振荡培养，含有Cu2+、Mn2+、Zn2+的微量元素复合液、洋葱（Allium cepa L.）、麦（Triticum aestivum L.）麸对其产漆酶都有较大的促进作用，而愈创木酚则对其生长和产漆酶有抑制作用。
由新鲜马铃薯（Solanum tuberosum L.）200 g、K2HPO4 1.00 g、NaCl 0.50 g、MgSO4 ·7H2O 0.50 g、NaNO3 2.50 g、CaCl2·2H2O 0.10 g、FeCl3 0.02 g、吐温-80 1.20 mL溶于1 000 mL去离子水中组成的培养基在添加微量元素复合液（50 mg/mL CuCl2·2H2O+20 mg/mL MnSO4·H2O+10 mg/mL ZnSO4·7H2O）3 mL、洋葱100 g、麦麸10 g后，并且培养基起始pH 4.5、培养温度30 ℃、培养摇床转速200 r/min、培养时间7 d，则摇瓶发酵的漆酶产酶量最高可达1 121 U/mL，显示出了良好的工业开发潜力。
关键词：漆酶；裂褶菌（Schizophyllum commune Fr.）；筛选；产酶培养基；优化Isolation of Schizophyllum commune Producing Laccase and Optimization of Laccase Production ConditionsAbstract： A Schizophyllum commune Fr. strain mys005 producing laccase was isolated from the rotten wood lawn in forest of Qinlin. The culture method for laccase production，medium composition and cultivation conditions was optimized. Results showed that the suitable cultivation method for S. commune strain mys005 to produce laccase was shallow liquid shaking culture. Trace elements compound liquid containing Cu2+，Mn2+，Zn2+，onion （Allium cepa L.），wheat （Triticum aestivum L.）bran could promote laccase production；while guaiacol could inhibit the growth and laccase production. If adding trace element compound solution（50 mg/mL CuCl2·2H2O+20 mg/mL MnSO4·H2O+ 10 mg/mL ZnSO4·7H2O）3 mL，onion 100 g，wheat bran 10 g，in the medium containing fresh potato （Solanum tuberosum L.）200 g，K2HPO4 1.00 g，NaCl 0.50 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，NaNO3 2.50 g，CaCl2·2H2O 0.10 g、FeCl3 0.02 g、tween-80 1.20 mL in 1 000 mL deionized water，and keeping the starting pH at 4.5，starting temperature at 30 ℃，culture shaker speed at 200 r/min，culturing for 7 d，the laccase enzyme production yield in shake flask fermentation could be up to a maximum of 1 121 U/mL，showing great potential for industrial development.Key words：laccase；Schizophyllum commune Fr.；isolation；enzyme producing medium；optimization漆酶（Laccase，EC1.10.3.2）是一种含铜元素的多酚氧化酶，是重要的木质纤维（Ligno cellulose）降解酶之一[1]。
白腐真菌菌株的筛选及液体发酵产漆酶条件的优化研究
白腐真菌菌株的筛选及液体发酵产漆酶条件的优化研究白腐真菌菌株的筛选及液体发酵产漆酶条件的优化研究漆酶是一种酸性酶，广泛应用于木材加工、油漆去除、纸浆脱墨等领域。
为了寻找高效的漆酶产生菌株，本研究对白腐真菌的菌株进行了筛选，并优化了其液体发酵产漆酶的条件。
第一部分：白腐真菌菌株的筛选从环境中采集了多个土壤和木材样品，并将其分离培养于漆酶富集培养基中。
经过连续传代培养，筛选出了表现出高漆酶产酶能力的白腐真菌菌株。
采用基于菌丝的形态学特征、菌落形态特征、和漆酶产酶能力的评估，鉴定了5个潜在的高漆酶产菌株（命名为菌株A、菌株B、菌株C、菌株D、菌株E）。
接下来，我们将进一步优化这些菌株的液体发酵条件。
第二部分：液体发酵条件的优化2.1 碳源在液体培养基中加入不同碳源，如木质素、纤维素、葡萄糖和麦芽糖，分别对5个菌株进行液体发酵。
结果表明，以木质素作为唯一碳源时，菌株C和菌株E的漆酶产酶能力最高，分别达到了XX U/mL和XX U/mL，比其他碳源的产酶能力高出很多。
因此，我们选择了木质素作为主要碳源。
2.2 氮源尝试了不同的氮源对菌株C和菌株E的漆酶产酶能力的影响。
我们测试了不同浓度的尿素、酵母提取物和氨基酸，结果发现在0.5%尿素和0.1%酵母提取物的情况下，菌株C和菌株E的产酶能力分别达到了XX U/mL和XX U/mL，比其他条件下的产酶能力最高。
2.3 pH值和温度进一步优化了液体培养基的pH值和温度。
在不同的pH值和温度下培养菌株C和菌株E，观察到最佳产酶条件是在pH 5.0和30°C的情况下。
在这种条件下，菌株C和菌株E的漆酶产酶能力分别达到了XX U/mL和XX U/mL。
结论：通过对白腐真菌菌株的筛选和液体发酵条件的优化研究，本研究确定了菌株C和菌株E为高漆酶产生菌株。
最佳的液体发酵条件为使用木质素作为碳源，0.5%尿素和0.1%酵母提取物作为氮源，培养基的pH值为5.0，温度为30°C。
产漆酶菌株的筛选与酶活性的测定论文
目录摘要................................................................................................................................. I Abstract.......................................................................................................................................... II 前言 . (1)1材料与方法 (2)1.1实验材料与方法 (2)1.2 培养基 (3)1.3 实验方法 (3)1.3.1 产漆酶菌株的筛选 (3)1.3.2 漆酶液态发酵及其制备 (3)2 漆酶酶活性的测定 (4)2.1 ABTS-分光光度计法 (4)2.2 分光光度法具体步骤 (4)2.3酶活性的计算 (4)3 菌株的活化 (4)3.1 培养基及主要试剂的配置 (4)3.2 菌种活化步骤 (5)4 改良CTAB法提取待测菌株全基因组 (5)4.1 基因组提取 (5)5 结果与分析 (6)6 讨论和小结 (9)1. 讨论 (9)2. 小结 (9)参考文献 (10)致谢 (11)摘要本实验从南昌农药厂土壤中分离筛选出一株能够产漆酶活性的细菌菌株，并初步分析和鉴定了该菌株。
此菌株具有生长快速、遗传稳定、菌落规则的特性。
为了从土壤中筛选产漆酶酶活相对较高的菌株，采用以愈创木酚为底物，利用平板筛选法和定性测定酶活力法筛选得到高产漆酶菌株。
以ABTS〔2,2’-连氮基-双（3-乙基苯丙噻唑啉-6-磺酸）〕为底物测定漆酶活得到产漆酶活性的菌株，菌株的产酶高峰期出现在发酵培养基培养后的第6天，最高的产漆酶活为5.33U。
通过测序和序列比对得到此菌株为溶血葡萄球菌JCSC1435（hemolytic Staphylococcus JCSC1435）。
产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究
产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究一、绪论漆酶是一种广泛存在于自然界中的酶，具有重要的工业应用价值。
在油漆等化工行业中，漆酶可以加速有机溶剂和有机物的降解，具有分解污染物、提高涂料质量等重要作用。
对于产漆酶细菌的筛选鉴定及固体发酵条件的研究具有重要的意义。
二、产漆酶菌株的筛选为了筛选出产漆酶的菌株，我们采用了固体培养的方法。
从土壤、水体等环境样品中采集菌株，然后将其进行分离纯化。
在培养基中，我们添加了有机溶剂作为唤醒剂，以刺激菌株产生漆酶。
接着，通过平板筛选法，筛选出产漆酶活性高的菌株。
用甲基橙为指示剂进行酶活性测试，并通过测定橙色环的直径来评价菌株的漆酶活性。
三、产漆酶菌株的鉴定对于筛选出的产漆酶菌株，我们进行了鉴定工作。
采用形态学观察的方法，观察菌株的形态特征，如菌落形状、色泽、边缘和胞外酶的生成情况等。
接着，通过生理生化试验，检测菌株对不同营养物质的利用情况，并对其产生的酶活性进行测定。
通过16S rRNA基因序列分析，确定菌株的种属。
四、产漆酶细菌的固体发酵条件研究为了提高漆酶的产量，我们进行了固体发酵条件的研究。
我们优化了基础培养基的配方，确定了最适合菌株生长的基础培养基组成。
接着，通过单因素实验和正交实验，优化了培养条件，包括发酵温度、pH值、初始菌量、发酵时间等。
通过对发酵产物的酶活性进行测定，确定了最佳的固体发酵条件。
五、结论通过筛选鉴定和固体发酵条件的研究，我们成功地获得了一株高产漆酶的细菌菌株，并确定了最佳的固体发酵条件。
这为产漆酶的工业化生产提供了重要的理论基础和技术支持，具有重要的应用价值。
我们的研究结果对于深入了解漆酶的产生机制、酶的结构和功能，以及漆酶的应用研究也具有重要的参考意义。
灵芝漆酶活性的测定及其产漆酶条件的优化
１．２．３ 灵芝产漆酶条件的优化 依次以碳源、氮源、金属离子、ｐ Ｈ 值以及温度
五个因素做单因素试验；然后以碳源、氮源、金属离 子、ｐ Ｈ 值四个主要影响因素做正交试验，得出灵芝产 漆酶的最适条件。
２ 结果与分析
２．１ 三种底物测定漆酶活性的效果 灵芝在分别加有愈创木酚、联苯胺和α－ 萘酚的
从图 ３ 中可以很直观地看出，以酵母粉作为氮源显 色效果最明显，蛋白胨次之。这些有机氮源富含各种氨 基酸，可直接被菌丝吸收利用，所以灵芝菌丝生长快， 产漆酶也快。有机氮比无机氮更适合于灵芝的生长和产 漆酶。所以取酵母粉作为灵芝产漆酶的最适氮源。
２．２．３ 最适 ｐ Ｈ 值的确定 以麦芽糖、酵母粉为最适碳、氮源，用柠檬酸 －
※生物工程
食品科学
2008, Vol. 29, No. 03 311
直径（ｍｍ） 直径（ｍｍ）
１．２．２ 底物筛选及漆酶活性的检测 将愈创木酚、联苯胺、α－ 萘酚三种底物分别以
０．０４％ 的浓度加入 ＰＤＡ 培养基， 接种直径为 ２．５ｍｍ 的灵 芝菌丝块，每种底物做 ３ 个平行。２ ５ ℃恒温培养，观 察显色的时间，记录显色圈的大小，并以时间为横坐 标，以显色圈直径为纵坐标作图，筛选出最适底物。
２．２．４ 不同金属离子对灵芝产漆酶的影响
312 2008, Vol. 29, No. 03
食品科学
※生物工程
直径（ｍｍ）
５０ ｐＨ５．０
４０
ｐＨ５．６
ｐＨ６．２
３０
ｐＨ６．６
ｐＨ７．０
２０
ｐＨ７．６
１０
０ ０ １２ ３ ４５ ６ ７ ８ ９
漆酶高产菌株的筛选实验方案
漆酶高产菌株的筛选实验方案漆酶是一种能够分解木质素的酶，被广泛应用于漆酶工业生产中。
为了获得高产漆酶的菌株，可以采用以下筛选实验方案。
首先，准备木材素作为酶的底物。
木材素是漆酶的天然底物，因此使用木材素可以更好地模拟真实环境，提高筛选的准确性。
接下来，采集不同环境中的泥土样品。
漆酶产生菌株存在于自然环境中的泥土中，因此从不同环境中采集泥土样品能够获得更多潜在的高产漆酶菌株。
然后，制备泥土微生物的培养基。
泥土样品中的微生物需要合适的培养基进行生长，通常可以使用Czapek-Dox培养基作为基础培养基，并根据实际情况进行优化。
随后，进行菌株的分离与纯化。
将采集的泥土样品进行稀释，并分别洒在含有木材素的琼脂板上。
通过观察是否存在环带或透明圈，从木材素周围分离出对木材素具有降解能力的菌株。
然后将菌株进行连续传代，并进行单菌落的分离，最终得到纯化的菌株。
接着，筛选高产漆酶的菌株。
采用固体培养，将纯化的菌株接种到含有木材素的琼脂板上，培养一定时间后，观察琼脂板上是否出现降解区域。
根据降解区域的大小和颜色的深浅，可以初步评估出菌株的木质素降解能力。
然后，选取降解能力较强的菌株进行液体培养。
将选取的菌株接种到含有木材素的液体培养基中，进行摇瓶培养。
培养一定时间后，通过测定液体培养基中木质素的降解率来评估菌株的降解能力。
最后，通过PCR扩增和酶活测定等分子技术手段对菌株进行鉴定与验证。
通过PCR扩增菌株的漆酶基因序列，并与已知的漆酶基因序列进行比对，验证菌株是否真正具有漆酶产生能力。
同时，使用酶活测定方法对菌株中的漆酶酶活进行测定，验证菌株的漆酶活性。
以上是一种对漆酶高产菌株进行筛选的实验方案。
通过以上步骤，可以筛选到具有高降解能力和高酶活的漆酶菌株，为漆酶产业的发展提供有力支持。
8 实验3 漆酶产生菌的分离筛选
实验3 漆酶产生菌的筛选1.实验原理：菌种筛选包括分离、初筛和复筛等几个步骤，挑选具有某种能力的有用菌种，根据不同的筛选目的，采用不同的筛选路线。
白腐菌能够分泌胞外氧化酶降解木质素，被认为是最主要的木质素降解微生物。
木质素降解酶系主要包括三部份: 木质素过氧化物酶(Lip）、锰过氧化物酶(MnP)以及漆酶( Lac)。
由于漆酶能把分子氧直接还原为水，与其他木质素降解酶相比，具有更大的实际应用价值。
漆酶是一种含铜多酚氧化酶，分子量在64-390kD之间。
由于漆酶具有氧化与木质素有关的酚类和非酚类化合物以及高度难降解环境污染物的能力, 因此在食品工业、制浆和造纸工业、纺织工业、土壤的生物修复等领域具有广泛的应用前景，因此筛选高产漆酶的白腐菌显得至关重要。
由于木质素结构的复杂性，可选用木质素类典型化合物，如单聚物香草酸、愈创木酚、苯酚、磷甲基苯酚；二聚物愈创木基甘油-B-松柏醇醚(GGE）、脱氢联松柏醇(DCA), 1,2-二愈创木基丙烷-1,3-二醇等。
可选用相对便宜的愈创木酚为唯一碳源的选择性培养基，从土壤中分离就可以筛选出产漆酶的木质素降解菌。
漆酶可以使无色的愈创木酚氧化为褐色，因此愈创木酚平板可以作为漆酶的筛选平板。
对于白腐菌来说，变色圈的形成有两种：一种是变色圈在菌丝的外圈，此时菌丝圈直径度色圈直径小于1；另一种是变色圈，在菌丝的外圈形成菌丝圈直径与变色圈直径比值大于1的菌株。
菌丝圈与变色圈直径的比值可作为判断该菌是否能选择性降解木素的依据，比值小于1则该菌能选择性降解木质素；比值大于1的菌则首先降解纤维素。
由于选择性降解木质素的菌株在制浆造造纸等行业更显优势，因此本试验主要是筛选选择性降解木质素的菌株。
本次实验需6个课时，但实验周期较长。
2.实验材料2.1仪器设备电子天平、磁力搅拌器、高压灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、冰箱、纯水机、移液枪等。
2.2试剂葡萄糖、KH2PO4、MgSO4•7H2O 、V B1、愈创木酚、酒石酸钾、蛋白胨、MgSO4、KH2PO4、Na2HPO4琼脂等。
一株产漆酶菌株的筛选鉴定和发酵条件的研究
一株产漆酶菌株的筛选鉴定和发酵条件的研究
一株产漆酶菌株的筛选鉴定和发酵条件的研究
以愈创木酚为底物,采用平板筛选法筛选得到一株产漆酶菌株WS1-2,形态学特性表明该茵属于绿色木霉.对产酶条件的初步研究结果表明,WS1-2菌株的产酶高峰期出现在接种培养后的第4d.与蔗糖、乳糖、半乳糖和可溶性淀粉相比,以葡萄糖为碳源时,发酵上清液的漆酶活力明显要高,最大值达230U/L.以NH4Cl为氮源,最有利于WS1-2漆酶的产生,漆酶活力最高可达到234U/L.0.01mmol/L的愈创木酚和ABTS 对WS1-2产漆酶有明显的诱导作用,3～5mg/L的Tween-80可以明显提高WS1-2的产酶水平.
作者：刘敏张明 LIU Min ZHANG Ming 作者单位：安徽农业大学生命科学学院,合肥,230036 刊名：生物学杂志 ISTIC 英文刊名：JOURNAL OF BIOLOGY 年，卷(期)：2008 25(3) 分类号：Q935 关键词：绿色木霉愈创木酚形态学特征酶活力。
产漆酶真菌的筛选及其固态发酵条件研究
产漆酶真菌的筛选及其固态发酵条件研究蒋冬冬;李莉;赵新海;张庆华;关艳丽;钟丽娟;朱巍巍;郭玲玲【摘要】用愈创木酚平板法对14株白腐真茵进行初筛,通过测定漆酶活力进行复筛,筛选出1株生活力较强,产漆酶活力高的菌株MZ-1,经ITS-5.8S rDNA序列分析,初步鉴定为Trametes versicolor.在固态发酵培养基的基础上,对该菌株产漆酶的培养基组成进行正交优化,得到最优发酵培养基:麸皮:秸秆粉:豆柏:玉米粉为3:3:2:1,可溶性淀粉2%,(NH4)2SO4+蛋白胨1%,KH2PO4 0.1%,料水比1:2.接种4个菌塞,温度为30℃.发酵8 d后酶活可达到1 555.57 U/g.【期刊名称】《微生物学杂志》【年(卷),期】2010(030)006【总页数】5页(P55-59)【关键词】漆酶;固态发酵;发酵条件;正交优化【作者】蒋冬冬;李莉;赵新海;张庆华;关艳丽;钟丽娟;朱巍巍;郭玲玲【作者单位】沈阳农业大学,辽宁,沈阳,110161;辽宁省微生物科学研究院,辽宁,朝阳,122000;辽宁省微生物科学研究院,辽宁,朝阳,122000;辽宁省微生物科学研究院,辽宁,朝阳,122000;辽宁省微生物科学研究院,辽宁,朝阳,122000;辽宁省微生物科学研究院,辽宁,朝阳,122000;辽宁省微生物科学研究院,辽宁,朝阳,122000;辽宁省微生物科学研究院,辽宁,朝阳,122000【正文语种】中文【中图分类】Q93漆酶(laccase,ECI.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶,与抗坏血酸氧化酶和哺乳动物血浆铜蓝蛋白同源,都属于蓝色多铜氧化酶家族。
在自然界中,漆酶分布于多种植物、真菌体内以及少数昆虫和细菌中[1]。
漆酶皆为糖蛋白,其含糖量和种类因来源不同而有所不同,该酶具有广泛的底物专一性。
不同漆酶之间的作用范围也不尽相同,涉及的底物主要包括单酚、对-苯二酚、甲氧基酚、抗坏血酸和二胺化合物(如苯二胺、多巴胺)等[2]。
产漆酶真菌的筛选及发酵产酶条件的优化
产漆酶真菌的筛选及发酵产酶条件的优化作者：王雪刘太林杨焜梅王志成湛莹薛兆淞李永佳来源：《安徽农学通报》2019年第23期摘要：从4种白腐真菌（金针菇Flammulina velutipes、秀珍菇Pleurotus geesteranus、鸡腿菇Coprinus comatus、黑木耳Auriculariaheimuer）中通过愈创木酚与漆酶形成显色圈时间、大小、颜色深浅的方式筛选出产漆酶能力最强的菌株为金针菇。
研究了碳源、氮源、各种理化因素等培养条件对漆酶分泌的影响，并通过正交实验设计优化产酶条件。
单因素结果表明：pH 为5时，漆酶分泌最高，酶活分别为235U/mL;培养温度28°C时，漆酶分泌最高，酶活分别为269U/mL;培养时间7d，漆酶分泌最高，酶活分别为311U/mL;蔗糖作碳源、豆粕作氮源，且碳氮总量不变时，碳氮比为10∶1时漆酶分泌最高，酶活为309U/mL。
正交试验表明：蔗糖10g/L，豆粕1g/L，在250mL的三角瓶中，pH为6，温度28°C时，金针菇在第5天达产酶高峰，峰值酶活为330U/mL。
关键词：漆酶;筛选;金针菇;培养条件中图分类号; TQ92 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）23-0031-04Screening of Laccase-producing Fungi and Optimization of Fermentation Conditions for FermentationWang Xue et al.（Food Engineering College，Tianshi College，Tianjin 301700，China）Abstract：From four species of white rot fungi，Flammulina velutipes，Pleurotus geesteranus，Coprinus comatus，Auriculariaiaheimuer，the strains with the highest laccase production capacity were selected as Flammulina velutipes by comparing the formation cycle time，size and color of guaiacol and laccase.The effects of culture conditions such as carbon source，nitrogen source and various physical and chemical factors on laccase secretion were studied，and the conditions for enzyme production were optimized by orthogonal experimental design. The single factor results showed that the laccase secretion was the highest at pH 5 and the enzyme activity was 235 U/mL. The laccase secretionwas the highest at 28°C，and the enzyme activity was 269 U/mL. The laccase secretion was reached at 7 days. The peak activity was 311 U/mL;sucrose was used as carbon source and soybean meal was used as nitrogen source. When the total carbon and nitrogen specific gravity was unchanged，the laccase secretion was the highest at 10：1，and the enzyme activity was 309 U/mL. Orthogonal test showed that：sucrose 10g/L，soybean meal 1g/L，in a250mL volumetric flask，pH is 6，the temperature of 28 °C，Flammulina velutipes reached the peak of enzyme production on the 5th，the peak enzyme activity was 330U/mL.Key words：Laccase;Screening;Flammulina velutipes;Culture conditions漆酶最早是在漆樹的液汁中发现的，在分类中属于多酚氧化酶，蛋白分子中含铜元素，属于蓝铜家族氧化酶。
漆酶产生菌初筛条件的优化研究
漆酶产生菌初筛条件的优化研究
王宜磊;朱陶
【期刊名称】《唐山师范学院学报》
【年(卷),期】2003(025)002
【摘要】运用不同底物,不同浓度,不同基础培养基进行了漆酶产生菌初筛条件的优化,找到了愈创木酚、邻联甲苯胺、联苯胺三种较好的底物,及其他们的最适使用浓度和最佳观察时间.
【总页数】3页(P26-27,81)
【作者】王宜磊;朱陶
【作者单位】菏泽师范专科学校,生物系,山东,菏泽,274015;菏泽师范专科学校,生物系,山东,菏泽,274015
【正文语种】中文
【中图分类】Q936
【相关文献】
1.一株漆酶产生菌的筛选与发酵条件研究 [J], 张强
2.高活性漆酶产生菌的发酵条件优化 [J], 马瑛;贾红华;周华;韦萍
3.产漆酶裂褶菌的筛选及其产酶培养条件优化研究 [J], 赵文娟;徐升运;任平
4.反-Prelog规则羰基还原酶产生菌Debaryomyces castellii ZJB-12032产酶条件优化研究 [J], 姚震;罗希;王亚军;郑裕国
5.一株脂肪酶产生菌的筛选及产酶条件优化研究 [J], 欧阳敏;孙晗笑;莫雪梅;李秀英;张光
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产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究
产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究一、引言漆酶是一种重要的酶类，具有较宽的应用领域。
它能够氧化各种酚类物质，具有氧化还原作用，广泛应用于染料、造纸、医药等工业领域。
而细菌资源是一种潜在的产漆酶资源。
对产漆酶细菌的筛选鉴定及固体发酵条件的研究具有重要的理论和应用价值。
二、产漆酶细菌的筛选鉴定1. 筛选菌种产漆酶细菌的筛选是通过对大量的细菌进行筛选和鉴定，以找到高产漆酶的菌株。
筛选菌种的方法有多种，最常见的是通过对土样、水样、沉积物等环境中的微生物进行分离培养，通过酶活性的检测和分析来判断细菌的产酶能力。
近年来，随着分子生物学技术的发展，常规分离培养方法的不足逐渐显现出来。
也可以通过PCR扩增和基因测序的方法对微生物进行鉴定，找到潜在的高产漆酶菌株。
2. 鉴定菌种对于通过分子生物学技术找到的潜在高产漆酶菌株，还需要进行鉴定验证。
鉴定菌种的方法有生理生化鉴定和分子生物学鉴定两种。
生理生化鉴定主要通过对细菌在不同培养基、不同温度、不同pH等条件下的生理生化特性进行鉴定，分子生物学鉴定主要通过对菌株的16S rRNA基因进行测序和比对，从而确定其分类地位和亲缘关系。
三、固体发酵条件的研究1. 发酵基质的选择发酵基质的选择对漆酶的产量和质量有着重要影响。
常见的发酵基质有玉米芯、小麦麸、大豆皮等，这些基质均为农副产品废弃物，具有丰富的碳源和氮源，适合用于漆酶的生产。
目前，常见的固体发酵基质优化方法包括改变基质成分比例、添加辅料等，以提高漆酶的产量。
2. 发酵条件的优化固体发酵对于漆酶的生产有着重要的影响，包括温度、pH值、湿度、通气等条件都会影响漆酶的产量和质量。
常见的发酵条件优化方法包括响应面法、单因素试验法、正交试验法等，通过对各个发酵参数进行调整，找到最适合漆酶生产的发酵条件。
四、结语产漆酶细菌的筛选鉴定及固体发酵条件的研究是一个复杂而又重要的课题。
通过对有效菌种的筛选鉴定和固体发酵条件的研究，为漆酶的产业化生产提供了理论基础和技术支撑。
8 实验3 漆酶产生菌的分离筛选
8 实验3 漆酶产生菌的分离筛选8实验3漆酶产生菌的分离筛选实验3漆酶产生菌的筛选1.实验原理：菌种筛选包括分离、初筛和复筛等几个步骤，挑选具有某种能力的有用菌种，根据不同的筛选目的，采用不同的筛选路线。
白腐菌能排泄胞外氧化酶水解木质素，被指出就是最主要的木质素水解微生物。
木质素水解酶系则主要包含三部份:木质素过氧化物酶(lip）、锰过氧化物酶(mnp)以及漆酶(lac)。
由于漆酶能够把分子氧轻易还原成为水，与其他木质素水解酶较之，具备更大的实际应用领域价值。
漆酶就是一种含铜多酚氧化酶，分子量在64-390kd之间。
由于漆酶具备水解与木质素有关的酚类和非酚类化合物以及高度容易水解环境污染物的能力,因此在食品工业、制浆和造纸工业、纺织工业、土壤的生物复原等领域具备广为的应用领域前景，因此甄选高产漆酶的白腐菌变得至关重要。
由于木质素结构的复杂性，可选用木质素类典型化合物，如单聚物香草酸、愈创木酚、苯酚、磷甲基苯酚；二聚物愈创木基甘油-b-松柏醇醚(gge）、脱氢联松柏醇(dca),1,2-二愈创木基丙烷-1,3-二醇等。
可选用相对便宜的愈创木酚为唯一碳源的选择性培养基，从土壤中分离就可以筛选出产漆酶的木质素降解菌。
漆酶可以使无色的愈创木酚氧化为褐色，因此愈创木酚平板可以作为漆酶的筛选平板。
对于白腐菌来说，变色圈的构成存有两种：一种就是变色圈在菌丝的外圈，此时菌丝圈直径度色圈直径大于1；另一种就是变色圈，在菌丝的外圈构成菌丝圈直径与变色圈直径比值大于1的菌株。
菌丝圈与变色圈直径的比值可以做为推论该菌与否能够选择性水解木素的依据，比值大于1则该菌能够选择性水解木质素；比值大于1的菌则首先水解纤维素。
由于选择性水解木质素的菌株在制浆所造造纸等行业更显出优势，因此本试验主要就是甄选选择性水解木质素的菌株。
本次实验需6个课时，但实验周期较长。
2.实验材料2.1仪器设备电子天平、磁力搅拌器、高压杀菌锅、无尘室工作台、恒温培养箱、冰箱、纯水机、移液枪等。
产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究
产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究1. 研究背景漆酶是一类能分解漆酚的酶，具有广泛的应用前景。
目前，产漆酶的菌株主要有放线菌、细菌、真菌等。
其中，细菌产漆酶的效率较高，且易于工业化生产。
因此，筛选和鉴定高效产漆酶的细菌株，并对其进行固体发酵条件研究，具有重要的意义。
2. 筛选鉴定产漆酶细菌2.1 筛选菌株来源从野外土壤、河流水样、废弃物等样品中筛选，收集到的样品应多样性、覆盖面积广，可增加筛选到合适菌株的概率。
2.2 筛选方法2.2.1 选择富含漆酚的培养基常用的培养基有Potato Dextrose Agar（PDA）培养基、Czapec-Dox培养基、Mineral Salt Medium（MSM）培养基等。
其中，富含漆酚的选择性培养基可增加筛选到产漆酶菌株的几率。
2.2.2 测定漆酶活性将潜在菌株接种在含有漆酚的培养基上，培养一定时间后取样测定漆酶活性。
活性高的菌株可以被选择用于后续研究。
2.2.3 16S rRNA序列分析选择漆酶活性高的菌株进行16S rRNA序列分析，依据序列相似度、系统发育关系等参数，确定其分类学地位。
3. 固体发酵条件研究3.1 基质选择从可获得性、成本低、未对环境造成污染等方面考虑，选择米糠、玉米秸秆等当地廉价自然资源作为基质。
3.2 酸碱条件在漆酶的适宜pH范围内选择适宜的酸碱调节剂，使固体发酵过程中的pH值稳定，不影响菌株的生长及漆酶产生。
3.3 湿度控制在不影响氧气传递的前提下，控制固体基质中的湿度。
可通过加水或旋转鼓的调节实现。
3.4 温度调节根据菌株的生长特性，将其生长温度控制在适宜的范围内。
培养室可安装自动温控仪，实现对温度的控制。
4. 结论筛选鉴定高效产漆酶的细菌株，并对其进行固体发酵条件研究，可为产漆酶的工业化生产提供重要的理论和实践基础。
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产漆酶细菌的筛选 、 鉴定及产酶条件的初步优化
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关键 词 ： 漆酶； 鉴定 ； 考 克氏 菌
中图分 类号 ： Ｑ ８ １ 文献标 志码 ： Ａ 文 章编 号 ： ｌ ６ ７ ３ —１ ６ ８ ９ （ ２ ０ １ ６ ） ０ ６ —０ ６ ６ ０ —０ ７
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摘要 ：从甘蔗 渣 滤泥 中 筛得 一株 具 有漆 酶 活性 的细 菌 Ｓ ＹＢ Ｃ ｓ ｔ ａ ｒ Ｘ，通过 １ ６ Ｓ ｒ Ｒ Ｎ Ａ 基 因序 列分 析， 并结 合 生理 生化 实验 及形 态 学观察 ， 鉴 定 为考克 氏菌属 （ Ｋ ｏ ｃ ｕ ｒ ｉ ａ ） ； 利 用液 态发 酵法研 究了碳