血红蛋白电泳及其临床应用

血红蛋白电泳及其临床应用文件管理序列号：[K8UY-K9IO69-O6M243-OL889-F88688]血红蛋白电泳及其临床应用鄢盛恺中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院检验科，北京100730早在60多年前Pauling等（1949）在研究镰状红细胞贫血患者的血红蛋白（hemoglobin，Hb）时就发现其与正常人不同，证实这种异常的Hb在缺氧条件下是产生红细胞镰变和溶血性贫血的原因，并提出了“分子病”这一新概念。

引起了人们对Hb结构异常及异常Hb与遗传性贫血之间关系的重视。

近年来，由于生化技术和分子生物学技术的不断发展，相继发现和鉴定了许多新型异常的Hb。

电泳技术作为分离与鉴定Hb 最简便、准确的方法之一，广泛用于临床遗传性贫血（如地中海贫血）、异常血红蛋白病等疾病的临床诊治。

1 概述Hb的主要生理功能是将氧气从肺部运送到组织，同时将组织释放的二氧化碳带回到肺部完成氧气和二氧化碳的交换。

Hb是由珠蛋白和亚铁血红素连接成的一种结合蛋白质。

每一个Hb是由4个多肽链组成，而每一肽链又和一个铁卟啉结合。

和血红素连接的珠蛋白是一种组蛋白，每一个珠蛋白分子由4条肽链组成，每一条肽链和一个血红素结合，构成一个Hb单体或称为亚单位。

因此，每个Hb分子是由4个Hb单体聚合而成的四聚体。

现在已知人类的红细胞中存在3种正常的Hb，即HbA、HbA2和HbF。

从正常Hb中已发现α、β链、γ和δ4种不同肽链。

这些Hb由均由一对α链和一对非α链组成。

正常成人Hb的非α链称为β链，而胎儿Hb中的非α链称为γ链。

HbA 含量最多，它由两条α链和两条β链组成；HbA2（占3%）由两条α链和两条δ链组成。

HbF 正常含量是Hb 的2%，由两条α链和两条γ链组成。

除HbA 、HbA2和HbF 外其他的各种Hb 常被称为异常Hb 。

全世界目前已报道的异常Hb 达450余种，而且每年还有新的发现。

如美国最常见的两种Hb 变异体是HbS 和HbC ，而Hb Lepore ， HbE ， HbA2 G-philadelphia 等几类很少见。

现已证实这些异常Hb 的不同之处不在于亚铁血红素部分，而在于珠蛋白部分化学结构的差异。

主要类型有：⑴肽链中氨基酸的顺序略有差异。

此类型最为多见，约占90%。

如HbS （HbA →HbS 是由于α2β2→α2β2S ），HbC （HbA →HbC 是由于α2β2→α2β2C ）；⑵各肽链的重新组合或某些正常肽链的缺失。

如HbH （HbA →HbH 是由于α2β2→β4） ，Hb Bart’s（HbA →Hb Bart’s 是由于α2γ2→γ4） ；⑶Hb 肽链的融合。

如Hb Lepore 是δ链的一半（N 端）与β链的一端（C 端）融合而成；⑷肽链中氨基酸增多，可在中间嵌入或在C 端延长。

等。

以前发现的Hb 皆以英文字母命名，由A~Q （B 除外，加上S ）。

随着新发现的Hb 越来越多，字母不够用，现规定从Q 以后的字母不能再用以命名，而以发现地或实验室命名。

临床实验室常用的分离和鉴定Hb 的方法有醋酸纤维素薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、柱层析和一些有关的化学试验。

地中海贫血是一种常染色体显性遗传病，是我国南方最常见和危害最大的遗传病之一。

应用电泳法鉴别患者血液中Hb 的类型及含量对于贫血类型的临床诊断及治疗具有重大意义。

全自动电泳分析系统的引进将为临床诊断地中海贫血及异常Hb病提供准确的实验室方法和依据。

近年来分子生物学技术已用于因异常Hb引起的遗传性疾病的基因诊断中。

I-12 Hb电泳2.1 原理 Hb的分离和鉴定方法很多，其中以电泳法最为常用且最为重要，很多异常Hb都是首先用电泳法发现的。

其原理是Hb中的珠蛋白和其他蛋白质一样为两性电解质，在不同的缓冲液中可带正或负电荷，在电场中向阴极或阳极移动。

由于不同的蛋白质之间（正常Hb与异常Hb）其等电点、分子大小、形状及所带电荷的不同，其移动速率不同（电泳迁移率不同），在一定的支持介质中可借以分离。

不同的电泳方法具有不同的电场强度、pH、缓冲液或支持物。

2.2 常用方法最常用的方法是碱性缓冲液电泳。

早期用醋纤膜作为支持介质，在碱性环境下（pH8.4~8.6）可快速分离HbA、HbA2和HbF 及其他多种变异体。

可是不能将HbS与HbD和HbG分开，因为后3种Hb 在这一电泳系统中具有相同的迁移率。

同样，在碱性条件下，HbC、HbE、HbO与HbA2也有相同的迁移率。

1976年美国疾病预防与控制中心（CDC）和美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）曾推荐用醋酸纤维素薄膜电泳（Helena实验室的方法与之基本相同）作为异常Hb检测的初级试验。

现多用分辨率更高的琼脂糖凝胶进行电泳分析。

而酸性缓冲液（pH6.0~6.2）电泳可用来分离那些在碱性缓冲液电泳中不能分离开的Hb，如HbS及HbC。

在此酸性条件下，HbD、HbO（或HbE）与HbS及HbC 可明显的分开。

电泳后Hb可用丽春红S、酸蓝或氨基黑10B进行染色，将电泳区带与已知的对照比较，并用光密度计进行扫描定量。

对于一些特殊的Hb如HbS、HbA2、HbF和不稳定Hb（如HbM、HbH、HbE等）可分别采用溶解度试验、柱层析法、碱变性法（Singer法）及不稳定试验（异丙醇试验）进行鉴定。

珠蛋白链电泳、等电聚焦和氨基酸序列分析可用来证实稀有的Hb存在，多用于研究。

目前已有多种自动化电泳分析仪可应用于临床常规Hb电泳，如Helena 公司的REP、SPIEF等型号，Sieba公司的HYDRASYS。

其中碱性缓冲液电泳为常用筛选方法。

2.3 电泳结果2.3.1 碱性缓冲液电泳在碱性缓冲液中所有Hb均向阳极移动，其移动顺序为：HbH>HbA3> HbA1>HbF>HbS/HbD/HbG>HbC，HbA2/HbC/HbE/HbO>CA1>CA2（CA1为碳酸酐酶1，CA2碳酸酐酶2）。

正常人可见4条区带：HbA>HbA2>CA1>CA2（若用联苯胺染色，CA1与CA2则不显色）。

在点样处有一条蛋白带，它是非Hb成分，为细胞基质和膜蛋白。

2.3.2 酸性缓冲液电泳在酸性缓冲液中，HbA、HbD、HbE和HbG向阴极移动，而HbF比它们更靠近阴极。

HbC向阳极移动得最快，HbS也向阳极移动，但比较接近点样点。

2..3.3 结果报告有两种报告方式：⑴定性：将染色后的电泳胶片用质控胶片对比即可判断胶片有无Hb。

⑵定量：染色后的电泳胶片用光密度计扫描，报告各条带的百分比值。

各区带参考值，根据不同年龄有不同的范围。

例：正常成人： Hb（A+F）94.5%~98.5%HbA2 2.5%~3.5%新生儿(1个月)： HbA 12%~40%HbF 6%~93%HbA2 0.1%~1.0%婴儿（3个月）：HbA 1.00%—65.00%HbF34.3%—82.95%HbA2 0.04—2%婴儿(6个月)： HbA 86%~98%HbF 0.84%~10.7%HbA2 0.87%~2.9%I-23 临床意义足月的初生婴儿血液中的约70%~80%的Hb为HbF，同时也存在少量的HbA和HbA2。

不久HbF浓度迅速下降，同时HbA相应增加，绝大多数于出生后6个月至2年后，HbF降至成人的正常水平。

HbA2增高是β轻型地中海贫血的一个重要特征。

HbA2减低见于缺铁性贫血及其它Hb 合成障碍性疾病（常见如α地中海贫血）。

电泳发现异常Hb如HbH、Hb Bart’s、HbC-S、HbK等则可确诊为相应的Hb分子病。

据广东省人民医院资料统计，该院一年所做Hb电泳5800人次（所有产前检查及贫血待查病人），共检出地中海贫血和异常Hb病患者1375人，阳性率23.7%。

其中（1）α地中海贫血基因携带者（HbH病患者、PCR确诊α-地中海贫血、新生儿Hb Bart’s区带者）1018人，阳性率17.6%。

（2）β-地中海贫血基因携带者327人，阳性率5.6%。

(3)异常HbJ、HbK、HbN、HbG、HbD和HbE共30人占总人数0.52%。

3.1 α-地中海贫血是由于珠蛋白基因缺失或突变，导致α珠蛋白肽链合成障碍所致。

我国多数是α珠蛋白基因缺失。

3.1.1 静止型α-地中海贫血无临床症状、体征、无贫血，红细胞形态正常。

HbA2和HbF正常，新生儿期可出现1%~3%Hb Bart’s，出生后3个月消失。

父母任一方有α-地中海贫血。

3.1.2 标准型轻型患者无症状。

呈轻型小细胞低色素性贫血。

有轻度红细胞形态改变。

HbA2含量为正常低限（1.5%~2.5%），β/α约1.4/1，HbF正常。

新生儿期Hb Bart 可达5%~8%，6个月完全消失。

父母任一方有α-地中海贫血。

3.1.3 HbH病临床表现有轻、中度贫血，2/3以上病例有肝脾肿大，常反复出现黄疸。

在妊娠、感染及使用氧化剂时，Hb显着下降。

父母双方常有α-地中海贫血。

实验室检查：有溶血性贫血的特征，骨髓中红细胞系统增生极度活跃。

HbH明显增高（2.5％~40％），HbA2及HbF 含量正常。

Hb电泳可出现HbH区带。

红细胞渗透脆性试验降低，红细胞包涵体阳性。

3.1.4 Hb Bart’s 胎儿水肿综合征临床表现：该病为α-地中海贫血中最严重者，胎儿常于妊娠后期死亡或早产。

胎儿生下时，全身水肿，皮肤苍白，黄疸，肝脾肿大，常于产后数小时内死亡。

父母双方均有HbH病或标准型α-地中海贫血。

实验室检查：有溶血性贫血的特征，骨髓红系增生活跃。

红细胞形态靶形红细胞明显增多，外周血可见有核红细胞。

Hb电泳：Hb Bart成分>80％，抗碱Hb增加，出现少量Hb Portland或少量HbH。

3.2 β-地中海贫血是由于β珠蛋白链合成减少或完全不能合成所致。

完全不能合成β珠蛋白链的地贫基因称为β0，合成减少的称为β+。

3.2.1 重型临床表现：又称库利氏贫血（Cooleyanlsnua）患者症状严重，多在儿童期夭折。

少数症状较轻，可活至成年，此型又常称为中间型。

库利氏贫血在婴儿期6~9个月开始出现贫血，黄疸、肝脾肿大。

儿童患者发育不良、智力迟钝、骨骼改变如颧骨隆起，眼距增宽，鼻梁低平。

Ｘ线可见外板骨小梁条纹清晰呈直立的毛发样等。

多在幼儿时死于重度贫血或感染。

若能生长超过10岁，可出现个体矮小，性功能、甲状腺及甲状旁腺等功能低下，可继发血色病，出现心律系乱、心力衰竭、肝硬化、糖尿病等。

父母常均有轻型?-地中海贫血。

实验室检查： Hb<60g/L，呈小细胞低色素性贫血，靶形细胞多见，网织红细胞增多；骨髓红系统轻度增生。

Hb电泳：HbF>30％。

3.2.2 轻型临床表现：无症状或有轻度分血症状，肝脾无肿大或轻度肿大。