引物设计原则(必看)

mi引物设计原则
1、引物得长度一般为15-30 bp,常用得就是18-27 bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA聚合酶进行反应。

2、引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其就是3’端相似性较高得序列,否则容易导致错配。

引物3’端出现3个以上得连续碱基,如GGG或CCC,也会使错误引发机率增加。

3、引物3’端得末位碱基对Taq酶得DNA合成效率有较大得影响。

不同得末位碱基在错配位置导致不同得扩增效率,末位碱基为A得错配效率明显高于其她3个碱基,因此应当避免在引物得3’端使用碱基A。

另外,引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。

5’端序列对PCR影响不太大,因此常用来引进修饰位点或标记物。

4、引物序列得GC含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。

上下游引物得GC含量不能相差太大。

5、引物所对应模板位置序列得Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。

Tm值得计算有多种方法,如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T),在Oligo软件中使用得就是最邻近法(the nearest neighbor method)。

6、ΔG值就是指DNA双链形成所需得自由能,该值反映了双链结构内部碱基对得相对稳定性。

应当选用3’端ΔG值较低(绝对值不超过9),而5’端与中间ΔG值相对较高得引物。

引物得3’端得ΔG值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。

7、引物二聚体及发夹结构得能值过高(超过4、5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。

8、对引物得修饰一般就是在5’端增加酶切位点,应根据下一步实验中要插入PCR产物得载体得相应序列而确定。

引物序列应该都就是写成5-3方向得,
Tm之间得差异最好控制在1度之内,
另外我觉得扩增长度大一些比较好,500bp左右。

要设计引物首先要找到DNA序列得保守区。

同时应预测将要扩增得片段单链就是否形成二级结构。

如这个区域单链能形成二级结构,就要避开它。

如这一段不
能形成二级结构,那就可以在这一区域设计引物。

①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

②产物不能形成二级结构。

③引物长度一般在15~30碱基之间。

④ G+C含量在40%~60%之间。

⑤碱基要随机分布。

⑥引物自身不能有连续4个碱基得互补。

⑦引物之间不能有连续4个碱基得互补。

⑧引物5′端可以修饰。

⑨引物3′端不可修饰。

⑩引物3′端要避开密码子得第3位。

1、引物得特异性引物与非特异扩增序列得同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。

2、避开产物得二级结构区某些引物无效得主要原因就是引物重复区DNA二级结构得影响,选择扩增片段时最好避开二级结构区域。

用有关计算机软件可以预测估计mRNA得稳定二级结构,有助于选择模板。

实验表明,待扩区域自由能(△G°)小于58、6lkJ/mol时,扩增往往不能成功。

若不能避开这一区域时,用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增得成功就是有帮助得。

3、长度寡核苷酸引物长度为15~30bp,一般为20~27mer。

引物得有效长
度:Ln=2(G+C)+(A+T),Ln值不能大于38,因为>38时,最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶得最适温度(74℃),不能保证产物得特异性。

4、G+C含量G+C含量一般为40%~60%。

其Tm值就是寡核苷酸得解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链得温度,有效启动温度,一般高于Tm值5~10℃。

若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物得Tm值,则有效引物得Tm为55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

5、碱基础随机分布引物中四种碱基得分布最好就是随机得,不要有聚嘌呤或聚嘧啶得存在。

尤其3′端不应超过3个连续得G或C,因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。

6、引物自身引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。

这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板得复性结合。

若用人工判断,引物自身连续互补碱基不能大于3bp。

7、引物之间两引物之间不应不互补性,尤应避免3′端得互补重叠以防引物二聚体得形成。

一对引物间不应多于4个连续碱基得同源性或互补性。

8、引物得3′端引物得延伸就是从3′端开始得,不能进行任何修饰。

3′端也不能有形成任何二级结构可能,除在特殊得PCR(AS-PCR)反应中,引物3′端不能发生错配。

在标准PCR反应体系中,用2U Taq DNA聚合酶与800μmol/L dNTP(四种dNTP各200μmol/L)以质粒(103拷贝)为模板,按95℃,25s;55℃,25s;72℃,1min得循环参数扩增HIV-1 gag基因区得条件下,引物3′端错配对扩增产物得影响就是有一定规律得。

A∶A错配使产量下降至1/20,A∶G与C∶C错七下降至1/100。

引物A:模板G与引物G:模板A错配对PCR影响就是等同得。

9、引物得5′端引物得5′端限定着PCR产物得长度,它对扩增特异性影响不大。

因此,可以被修饰而不影响扩增得特异性。

引物5′端修饰包括:加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等;引入蛋白质结合DNA序列;引入突变位点、插入与缺失突变序列与引入一启动子序列等。

10、密码子得简并如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子得第3位,因密码子得第3位易发生简并,会影响扩增特异性与效率。

Hairpin 发卡结构
如果自由能值大于0 则该结构不稳定从而不会干扰反应如果自由能值小于0 则该结构可以干扰反应
二聚体可以在序列相同得两条引物或正反向。

引物之间形成如果配对区域在3 末端问题会更为严重3 末端配对很容易引起引物二聚
体扩增使
Pair Rating 匹配度评分匹配度低得引物对常常不太有效就是因为在同样退火温度下Tm低得引物决定扩增得特异性而Tm高得引物更易于形成非特异性结合而造成错误得起始
【1】引物得长度以15－30bp为宜,否则会影响扩增得特异性。

【2】】碱基尽可能随机分布,避免相同得碱基成串排列,引物得G+C含量在40％－60％之间,若G+C含量太低,可在5'端加上一些G或C,若G＋C含量太高,可在5'端加上一些A或T。

【3】应避免每条引物内部形成二级结构及两条引物得3'端互补形成引物二聚体,避免在引物得3'端有3个G或3个C成串排列,3'端得末位碱基最好选T、C、G,而不选A,也有建议在引物得两端用1－2个嘌呤碱基。

【4】尽可能使用两条引物得Tm值相同(最好相差不要超过5℃),退火温度根据
较低得Tm值选定,也可以通过改变引物得长度来平衡两条引物得退火温度。

Tm 值可以根据Tm=4(G+C)+2(A+T)计算。

而对于较长得引物,Tm值需要考虑动力学参数、从“最近邻位”得计算方式得到,现有得PCR引物设计软件大多数都采用这种方式。

(注:对于Tm值得计算有争议得地方就是附加序列应不应该计算在内,我觉得有值得商讨得地方。

因为从理论上只有最开始得循环引物得附加序列就是不与模板链结合得,而在后来得PCR反应中,引物得附加序列就是与模板链结合了得。

)
【5】引物得3’端要与模板严格配对,而5’端碱基没有严格得限制,只要与模板DNA结合得部分足够长,其5’端碱基可不与模板DNA配对而呈游离状态,这样,我们可以在引物得5末端加上酶切位点(引入酶切位点时,要考虑到进行双酶切得共用缓冲液,否则给下游工作带来困难)、启动子,方便下游操作。

【6】不要在扩增序列得二级结构区设计引物,以免退火困难。

也要考虑引物设计处模板得特异性。

PCR引物设计得目得就是为了找到一对合适得核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列。

因此,引物得优劣直接关系到PCR得特异性与成功与否。

要设计引物首先要找到DNA序列得保守区。

同时应预测将要扩增得片段单链就是否形成二级结构。

如这个区域单链能形成二级结构,就要避开它。

如这一段不能形成二级结构,那就可以在这一区域设计引物。

现在可以在这一保守区域里设计一对引物。

一般引物长度为15~30碱基,扩增片段长度为100~600碱基对。

让我们先瞧瞧P1引物。

一般引物序列中G C含量一般为40%~60%。

而且四种碱基得分布最好随机。

不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。

否则P1引物设计得就不合理。

应重新寻找区域设计引物。

同时引物之间也不能有互补性,一般一对引物间不应多于4个连续碱基得互补。

引物确定以后,可以对引物进行必要得修饰,例如可以在引物得5′端加酶切位点序列;标记生物素、荧光素、地高辛等,这对扩增得特异性影响不大。

但3′端绝对不能进行任何修饰,因为引物得延伸就是从3′端开始得。

这里还需提醒得就是3′端不要终止于密码子得第3位,因为密码子第3位易发生简并,会影响扩增得特异性与效率。

综上所述我们可以归纳十条PCR引物得设计原则:
①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

②产物不能形成二级结构。

③引物长度一般在15~30碱基之间。

④ G C含量在40%~60%之间。

⑤碱基要随机分布。

⑥引物自身不能有连续4个碱基得互补。

⑦引物之间不能有连续4个碱基得互补。

⑧引物5′端可以修饰。

⑨引物3′端不可修饰。

⑩引物3′端要避开密码子得第3位。

PCR引物设计得目得就是找到一对合适得核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列。

如前述,引物得优劣直接关系到PCR得特异性与成功与否。

对引物得设计不可能有一种包罗万象得规则确保PCR得成功,但遵循某些原则,则有助于引物得设计。

1、引物得特异性
引物与非特异扩增序列得同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。

2、避开产物得二级结构区
某些引物无效得主要原因就是引物重复区DNA二级结构得影响,选择扩增片段时最好避开二级结构区域。

用有关计算机软件可以预测估计mRNA得稳定二级结构,有助于选择模板。

实验表明,待扩区域自由能(△G°)小于58、6lkJ/mol时,扩增往往不能成功。

若不能避开这一区域时,用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增得成功就是有帮助得。

3、长度
寡核苷酸引物长度为15~30bp,一般为20~27mer。

引物得有效长度:Ln=2(G C) (A T ,Ln值不能大于38,因为>38时,最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶得最适温度(74℃),不能保证产物得特异性。

4、G C含量
G C含量一般为40%~60%。

其Tm值就是寡核苷酸得解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链得温度,有效启动温度,一般高于Tm值5~10℃。

若按公式Tm=4(G C) 2(A T)估计引物得Tm值,则有效引物得Tm为55~80℃,其Tm 值最好接近72℃以使复性条件最佳。

5、碱基础随机分布
引物中四种碱基得分布最好就是随机得,不要有聚嘌呤或聚嘧啶得存在。

尤其3′端不应超过3个连续得G或C,因这样会使引物在G C富集序列区错误引发。

6、引物自身
引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。

这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板得复性结合。

若用人工判断,引物自身连续互补碱基不能大于3bp。

7、引物之间
两引物之间不应不互补性,尤应避免3′端得互补重叠以防引物二聚体得形成。

一对引物间不应多于4个连续碱基得同源性或互补性。

8、引物得3′端
引物得延伸就是从3′端开始得,不能进行任何修饰。

3′端也不能有形成任何二级结构可能,除在特殊得PCR(AS-PCR)反应中,引物3′端不能发生错配。

在标准PCR反应体系中,用2U Taq DNA聚合酶与800μmol/L dNTP(四种dNTP 各200μmol/L)以质粒(103拷贝)为模板,按95℃,25s;55℃,25s;72℃,1min得循环参数扩增HIV-1 gag基因区得条件下,引物3′端错配对扩增产物得影响就是有一定规律得。

A∶A错配使产量下降至1/20,A∶G与C∶C错七下降至1/100。

引物A:模板G与引物G:模板A错配对PCR影响就是等同得。

9、引物得5′端
引物得5′端限定着PCR产物得长度,它对扩增特异性影响不大。

因此,可以被修饰而不影响扩增得特异性。

引物5′端修饰包括:加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、Eu3 等;引入蛋白质结合DNA序列;引入突变位点、插入与缺失突变序列与引入一启动子序列等。

10、密码子得简并
如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子得第3位,因密码子得第3位易发生简并,会影响扩增特异性与效率。

特殊目得得引物设计将在有关章节讨论。

随着人们对引物得认识,一些引物得计算机设计程序也应运而生,下面将讨论有关引物计算机设计方法。