绿色荧光蛋白在植物与病原菌互作研究中的应用

绿色荧光蛋白及在生物技术研究中的应用

收稿日期：００－５２１－２２．１基金项目：西省科技攻关项目（Ｊｆ１５）山西省自然科学基金项目山２ｆ）０６；【）３７国家自然科学基金项目（７１８省归国留学人员资助项目。３７５１０
２ＧＦＰ的应用特点
２世纪，Ｆ为一种新的报告基因Ｔ具得到了迅速发展，１ＧＰ作
与其他报告基因相比，Ｆ具有许多显著的特点：）ＧＰ（无需损伤细１
ｌＧＰ的结构和荧光性质Ｆ
胞即可研究细胞内事件，且无毒作用（肿属不依耪胜，；２在原核、
利用ＤＡ重组技，目的基因与ＧＰ基因构成融合基因，Ｎ将Ｆ转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。由于ＧＰ分子量小，Ｆ在活细胞内可溶且对细胞毒性较小，应用得最多和最成功的是ＧＰ与宿主蛋白构Ｆ
蛋白原有的正常功能和定位的融合蛋白效果最佳。利用ＧＰ的Ｆ
蛋白标示不同的蛋白质和细胞。由此，下村修、马丁一查尔菲和加底物或辅助因子等协助指示；）（易于构建载体，８可进行活细胞钱永健获得了２０年度诺贝尔化学奖［０８２１。
ＧＰ属于五大类报告基因之～，是虚用最多的发光蛋白。ＦＧＰ用３５ｎ的紫外光和４５ｎ的蓝光激发，在５８ｍ处Ｆ９ｌｎ７ｌｎ可０ｎ自行发出绿色荧光。之所以能够发光，因其氨基酸序列中第它是

荧光蛋白报告基因在植物寄生真菌研究中的应用

白基因在植物寄生真菌研究上的应用报道也日渐增多，现综述如下。
1 植物寄生真菌转荧光蛋白基因的方法
近年来植物寄生真菌转荧光蛋白基因已有 10 余篇报道（表 1），使用的技术包括农杆菌介导转化法（ ATMT）、原生质球转化法（ ST）和电击转化法（ EP）；使用的荧光蛋白基因有绿色荧光蛋白基因 GFP、EGFP、SGFP 和红色荧光蛋白基因 DsRed；启动子多来自真菌，如来自构巢曲霉的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子 gpd 和构巢曲霉色氨酸合成基因 trpC 的启动子 PtrpC。载体一般以各种真菌转化载体为骨架插入荧光蛋白表达框构建而成，如 Pct74、 PCBCT［12］、Psk1019［13］、 pBHt2-GFP［14］和 pCAMBIA1304-RCKK［15］等，一些载体为不能在真菌内独立复制的整合性载体。
Key words： Fungus Fluorescence protein Transgenic
1992 年，下村修首次报告从一种水母（ Aequorea victoria）中分离出一种在紫外线下会发出明亮绿光的蛋白，将其命名为绿色荧光蛋白 GFP； 1994 年， Chalfie 报告导入 GFP 基因使秀丽隐杆线虫的 6 个单独细胞有了颜色［1］；钱永健探明了 GFP 发出荧光的机制，并拓展出可用于标记的其他颜色，他们同为 2008 年的诺贝尔化学奖获得者。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin
2011 年第 9 期
合植物以及野生型植物的菌根化率，外观和发育阶段的相同性证明两种植物与菌根真菌的互作方式相同。Helber 等［23］将红色荧光 DsRed 和绿色荧光蛋白 GFP 的基因分别以及共同与构巢曲霉转录因子 StuA 核定位信号序列融合，转化到丛枝内生菌根菌（ Glomus intraradices）中，获得了分别带有 GFP 基因和 DsRed 基因以及共同带有 GFP 和 DsRed 的转化子，发现导向核基因的两个标记基因都可以可视化。 Abello 等［23］用农杆菌介导法将 GFP 基因转化进 A． implicatum，观察了转化体在接种后的臂形草组织中表达。Martino 等［25］首次报告了似欧石南属植物菌根真菌转荧光蛋白基因。Murata 等［26］利用农杆菌介导法将红色荧光蛋白基因首次在 Suillus 属表达，并阐述其在共生遗传分析中的作用。 2． 2 荧光蛋白基因在植物病原真菌研究上的应用

基于绿色荧光蛋白标记技术的植物细胞分化研究

基于绿色荧光蛋白标记技术的植物细胞分化研究植物细胞分化是植物生长发育过程中非常重要的一环，它决定了植物的形态、结构和功能，是保证植物正常生长和发育的关键因素。

绿色荧光蛋白标记技术是一种在生物体中检测或观察特定基因表达的有力工具，在植物细胞分化研究中得到了广泛的应用。

本文将从绿色荧光蛋白标记技术的基础知识、应用原理、研究进展等方面综述其在植物细胞分化研究中的应用。

一、绿色荧光蛋白标记技术的基础知识1.1 绿色荧光蛋白的发现和分离1988年，Osamu Shimomura从蓝色发光水母中发现了绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)。

随后，Martin Chalfie发现了GFP的基因序列，并且成功地将其引入小鼠、斑马鱼等模式生物细胞中，使得这些细胞发出了明亮的绿色荧光，开创了GFP应用于生物学领域的新时代。

1.2 GFP的生化特性GFP是一种含有238个氨基酸的蛋白质，其大约490-510纳米的荧光光谱在黄绿光区域。

GFP内部内嵌着一个主要负责荧光产生的色团环结构，称为荧光色团环(fluorescent chromophore)，这个环结构的形成需要一个称为四肽环化酶的酶的作用，它能够将三个氨基酸(Cys-Tyr-Gly)连接成为一个四肽。

GFP的很多特性可通过改变它的核苷酸序列或蛋白质翻译后的修饰来进行调节。

二、绿色荧光蛋白标记技术在植物细胞分化研究中的应用原理2.1 基于突变筛选的植物细胞分化标记技术透过人工诱变或通过遗传突变等方法，可诱发部分植物基因的表达。

将这些基因与GFP合并编码后在自身植物基因组进行定位分析，可以标记该细胞在植物细胞分化过程中所处的位置或时期。

这种标记方法要求依赖性较高，因为研究者需要对某一个特定的基因进行变异和筛选才能得到标记，且标记区域为固定染色体某一地点。

2.2 基于转基因技术的植物细胞分化标记技术另外一种标记细胞分化的技术，是基于转基因技术，将被研究的目标基因与GFP融合编码构建植物转基因体系，作为一个构建植物转基因体系，标记细胞分化的技术来使用。

青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum) 绿色荧光蛋白标记探究

Abstract:【Objective】TheRalstonia solanacearumstrain was chromosomally tagged with the marker genesgfpandluxABbyelectroporation. The growth properties and the pathogenicity of the tagged strain and the wild typestrainwere compared in this paper.【Method】TheR.solanacearumstrain was transformed by the electroporation. The condition and processor of the invasion of the GFP-taggedstrainwas observed in the tomato tissue culture plants.【Result】Transformant was screened for the green fluorescence by fluorescence stereomicroscopy. A 3.0kb fragment of thegfpgene andluxABgene was amplified from the genome DNA of the GFP-tagged strains. Morphologically, the cells of the engineered strain were similar to wild typestrainas determined by laser scanning confocal microscopy. Luciferase activity of the GFP-tagged strain increased rapidly duringthelog phase, but decreased in the stationary phase. The green fluorescence could be kept until 20 times of subcultures. It was the same for the GFP-tagged strian and the wild typestrain inthe culture temperature, pH value and growth curve. These results confirmed that the dual marker was inserted successfully into theR.solanacearumstrain. The pathogenicity of the wild type strain and the GFP-taggedstrainwas over 90% which meansgfpgene had no effect on the pathogenicity.【Conclusion】The GFP-taggedR.solanacearumis obtainedin thisstudy. The growth propertities and the pathogenicity of the GFP-tagged strainis thesame to the wild typestrain.

绿色荧光蛋白及其在农作物研究中的应用

ＫｅｒｓＧｒｅｕｒｓｅｔｐｏｅｎｙｗｏｄｅｎｆｏｅｃｎｒｔｉ；ｌｇｎＳｌｅｉｎＩＫｋｒｅｅ；ｅｅｔＴＩｅｏｉ
在研究植物遗传转化、因表达调控及蛋白质定位与时基
高峰，４５ｎ在７ｌ还有一个肩峰。田涛等证实了ＧＰ的活ｎ处Ｆ性发色基团是一个三肽Ｓｔ５Ｔｒ６Ｇｙ７但野生型ＧＰ发ｅ６一ｙ６一ｌ，６Ｆ光较弱，至在某些植物细胞中并不表达＿。ＧＰ荧光特性甚７Ｆ
ｃｃｅｔｃｒｓａｃ１ｅｃａａｔｒｔｃｆＧＦａｄｉｐｌｃｔｎｉｅｒｓａｃｆｃｏｓｗｅｅｂｉｆｘｕｄｄ．ｍｐｓｉｎｉｅｅｒｈ．１ｈｒｃｅｉｉｓｏＰｔａｐｉａｉｎｔｅｒｈｏｒｐｒｒｌｅｐｎｅｉｆｈｓｎｓｏｈｅｅｙｏ
测都需要底物和辅助因子，研究材料具有破坏性，对在活体
中的应用受到限制，能进行实时动态追踪＿。源于水母不ｌ（ｅｕｒｉｏａ等海洋无脊椎动物的绿色荧光蛋白（Ｆ）Ａｑｏａｖｒ）ｅａｉＧＰ可吸收蓝光后发出绿光，是生物发光现象中能量传递的受体
ＹＵＬｎｈｉｔｌ（ｉｔｈｏｏｙＲｓａｃｅｔｆｈｎｈｅｏｇｓＵｉｒｉ，ｃａｇＨｂｉ４０２ｉ－ｕｅａＢｏｃｎｌｅｅｒｈＣｎｅｏｉａＴｒＧｒｅｎｖｓｙＹｉｎ．ｕｅ４３０）ｅｇｒＣｅｅｔｈ

绿色荧光蛋白的研究现状与应用

绿色荧光蛋白的研究现状与应用【摘要】绿色荧光蛋白（GFP）最早发现于水母体中，是一种十分重要的蛋白质。

由于其众多的优点，现已在分子生物和细胞生物的研究中应用十分广泛。

随着技术的进步和研究的进一步深入，GFP基因也在许多其他方面将发挥着越来越重要的作用。

【关键词】绿色荧光蛋白；生色团；报告基因2008年10月8日，瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会授予三位科学家：日裔美国科学家下村修(Osamu Shimomura)、美国科学家马丁?查尔非(Martin Chalfie)和美国华裔科学家钱永健(Roger Y．Tsien)诺贝尔化学奖，以表彰他们在绿色荧光蛋白(GFP)研究方面做出的突出贡献。

1 绿色荧光蛋白的理论研究1.1绿色荧光蛋白的发现绿色荧光蛋白最早于1962年在维多利亚多管发光水母体内被发现，同时它也存在于水螅和珊瑚等腔肠动物体内。

它的内源基团可以在蓝光或紫外光激发下发射绿光，属于生物发光蛋白。

绿色荧光蛋白在水母体内之所以能发光，主要依靠水母素的辅助。

水母素和GFP之间能发生了能量转移，在钙的刺激下，其能量可转移到GFP，刺激GFP发光。

1.2绿色荧光蛋白的结构和发光原理1992年Prasher等克隆了GFP基因的cDNA并分析了其一级结构。

野生型GFP基因组全长2600bp，由3个外显子和2个内含子组成，编码238个氨基酸，分子量约28kDa。

GFP的三维立体结构是由11个β折叠围在四周形成一个中空的圆柱体，1条α折叠贯穿在圆柱体的中间，其中有一段位于65-67位的3个氨基酸残基（Ser-Tyr-Gly）形成的杂环咪唑啉结构组成生色团，位于圆筒中央并附着在α螺旋上。

绿色荧光蛋白的发光原理是位于氨基酸第65位的Ser的羧基和67位的Gly的酰基经过亲核反应生成咪唑基，66位的Tyr通过脱氢使芳香团与咪唑基结合，形成对羟基苯甲酸咪唑环酮生色团发出荧光。

GFP的最大和次大的激发波长分别是395nm和475nm。

绿色荧光蛋白(GFP)标记的尖孢镰刀菌在西瓜抗、感寄主根系中侵染和定殖

2019,32(8)：200-201中国瓜菜文献编译绿色灾光蛋白(GFP)标记的尖孑包镰刀圉在西瓜抗、感寄主根系中侵染和定殖孙洪宝，吕桂云，许勇(编译)(北京市农林科学院蔬菜研究中心北京100097)目的与意义：西瓜枯萎病是由半知菌亚门镰砲属尖抱镰刀菌寄生引起的一种真菌土传病害，是世界范围内导致西瓜产量和品质降低的最严重病害。

明确枯萎病菌与寄主植物之间的互作机制,揭示其相互作用的分子机制，可为西瓜抗枯萎病育种和病害防治奠定理论基础。

利用绿色荧光蛋白(GFP)作为标记，研究枯萎病菌在西瓜抗、感寄主根系中侵染和定殖动态，从组织学的角度来阐释西瓜与枯萎病菌亲和互作和非亲和互作的差异。

材料与方法：1.以农杆菌AGL1为介导，将带有潮霉素抗性基因pCH-sGFP质粒转化到西瓜枯萎病菌中，成功获得了能稳定持续表达绿色荧光蛋白的枯萎病菌的突变株BEIJING1-sGFP,对转化子进行抗性鉴定表明，组成型表达sGFP的BEIJING1-sGFP不影响枯萎病菌的致病力。

2.以抗病品种'PI296341・FR'(PI)与感病品种'Black Diamond'(BD)为试验材料，种子消毒后催芽，釆用浸根法接种病菌。

3.在接种后的6h>1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d取样进行激光共聚焦显微镜观察。

结果与分析:从西瓜枯萎病菌GFP转化株中选出致病力与转化前的野生型FON1在西瓜抗、感鉴别寄主上的表现无明显差异菌株命名为BEIJINGl-sGFP,继代培养后的菌体都有稳定而强的荧光信号，但在细胞质中的液泡无荧光信号。

通过人工接种，在无菌条件下进行致病力的检测,BEIJING1-sGFP与转化前的野生型FON1在西瓜抗、感鉴别寄主上的表现无明显差异，说明GFP的转化和表达对枯萎病菌的转化株的致病力无明显影响。

用激光共聚焦显微镜观测GFP标记的西瓜枯萎病菌侵染西瓜感病品种'Black Diamond'过程。

绿色荧光蛋白在植物病理学研究中的应用

分泌型碱性磷酸酶（ｅｒｔｄａｋｌｅｐｏｐａａｅｓｃｅｅｌａｉｈｓｈｔｓ，ｎ
ＳＡＰ基因、色荧光蛋白（ｒｅｌｏｅｃｎｒＥ）绿ｇｅｎｆｒｓｅｔｐｏｕｔｉ，ＧＰ）基因、葡萄糖苷酶（ｌｃｓａｅｅｎＦ￣ｇｕｏｉｓ，ｄＧＵＳ基因、半乳糖苷酶（ａａｔｓｄｓ，／ＧＡ）￣ｇｌｃｏｉａｅ？Ｄ－基因和萤火虫荧光素酶（ｉｅｌｃｅａｅＩ基因ｆｆｌｉｒｓ，Ｆｒｙｕｆ）
造，解决了ＧＦＰ荧光强度低、选择性差和光谱狭光窄等缺陷，目前荧光颜色已涵盖紫色到红色的所有
可见光区域＿。近年来，Ｆ基因在启动子分析、４］ＧＰ转基因监测、物检定、药污染物示踪、病检测和基抗
Ａｐｉａｔｏｓｏｒｅｌｒｓｅｔｐｒｔｉｎｐｌｎｔｐｈｏｏｙｐｌｃｉｎｆｇｅｎｆｕｏｅｃｎｏｅｎｉａａｔｌｇ
ＪａｇＭｉｇ。ｉｎｎＬｉｘｎ，ｉｆＪａｉＨｕｎｌｉ，ａｇＹｕｅＭｉｏＬｉｉｎａｘａｇ，ＮｉｅｉＸｕｌ，ＢａａｘａｏＸｉｏｉｏ
ＡｂｔａｔＧｒｅｌｏｅｃｎｒｔｉ（Ｐ）ｉａｍｐｒａｔｒｐｒｅｅｅｉｉｅｓｉｎｅｒｓａｃｓｒｃｅｎｆｕｒｓｅｔｐｏｅｎＧＦｓｎｉｏｔｎｅｏｔｒｇｎｎｌｃｅｃｅｅｒｈ．Ｂａｅｎｔｅｆｓｄｏｈ

绿色荧光蛋白及其应用

3 绿色荧光蛋白生色团成熟和荧光产生机理
p-HBI 生色团的成熟过程经历 GFP 多肽骨架折叠和生色团形成两个阶段，期间 4 个保守氨基酸残基发挥着特殊的功能作用［10］。
2011，31( 1)
邓超等: 绿色荧光蛋白及其应用
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图 1 野生型 avGFP 的结构 Fig． 1 The structure of wild type avGFP
4 不同类型的荧光蛋白
通过定点突变和随机突变得到了不同突变型的 avGFP 样蛋白，珊瑚类荧光蛋白的发现使人们发展出更多性质各异的荧光蛋白，发射谱覆盖 420 ～ 655 nm，应用范围不断扩大［14-15］。部分荧光蛋白及基本性质见表 1 所示。 4． 1 蓝色荧光蛋白
2 绿色荧光蛋白的结构
从维多利亚多管水母中分离出来的野生型 GFP ( avGFP ) 由 238 个氨基酸残基组成，分子质量约 27kDa，二级结构包括 11 个 β 折叠链( β-sheet strand) ， 8 个螺旋( helix) ，3 个转折( turn) ［图 1 ( a) ］，三维结构 ( PDB 登录号 1EMA 和 1GFL，1GFL 为二聚体) 为 42 × 24 ( 高 × 直径) 的 β 圆柱( β-barrel) ，圆柱两端由一些较短的 α 螺旋盖住，圆柱中央是几段 α 螺旋，生色团的三肽( Ser65-Tyr66-Gly67) 位于圆柱中央［图 1 ( b) ～ ( d) ］。该结构性质稳定，圆柱内部的微环境对维持生色团的正确构象从而产生荧光以及保护生色团不被氧气淬灭等都有重要作用［10］［图 1( e) ］。
荧光蛋白的寡聚可能会影响融合蛋白的正确定位和迁移几乎所有荧光蛋白都有寡聚趋势通过对有相互作用的侧链氨基酸进行突变可消除这种趋如蓝色荧光蛋白激发光接近紫外光一些珊瑚类荧光蛋白细胞毒性已有报道荧光蛋白发展至今人们对其在研究生物大分子相互作用及时空变化中的重要作用已没有质疑但相对于复杂的生命来说荧光蛋白还不足以解决许多问题

荧光蛋白mNeonGreen、mKOk作为FRET传能对在研究植物蛋白质互作中的应用分析

扌直逖碌妇 2021, 47(2):20 -27Plant Protection研究报告 Research Reports荧光蛋白mNeonGreen s mKOk 作为FRET 传能对在研究植物蛋白质互作中的应用分析王亚琴1**,李宗迪】，李晨羊】，李云琴2,胡涛r 谢礼2,周雪平13收稿日期：2019-12-31 修订日期：2020-02- 26基金项目：浙江大学实验技术研究项目(SJS201809):国家自然科学基金(31972235)* 通信作者 E-mail ：*****************.cn(1.水稻生物学国家重点实验室，浙江大学生物技术研究所，杭州310058； 2.浙江大学农生环测试中心，杭州310058；3.中国农业科学院植物保护研究所，北京100193)摘要蛋白质相互作用是蛋白质组学研究的重要方向之一,对解析植物病原微生物与寄主植物之间的博弈具有十分重要的意义。

荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)作为一种新技术,能够在活细胞的正常生理条件下进行检测，并具有灵敏度高，假阳性较低，实验周期短的优势，在研究蛋白质相互作用过程中得到了广泛的应用。

本研究选取了 2种新型的荧光蛋白mNeonGreen/mKOk 作为FRET 传能对，并与传统的传能对CFP/YFP 相比较，证实mNeonGreen/mKOk 背景干扰较低。

通过构建并表达荧光蛋白与目标蛋白的融合蛋白，利用FRET 技术成功地在植物细胞中验证了蛋白质间的相互作用。

本研究为FRET 技术在植物细胞中的应用提供了更多的技术支持和借鉴。

关键词蛋白质互作；荧光共振能量转移；mNeonGreen ； mKOk中图分类号：S 432. 1 文献标识码：A DOI ：10.16688/j.zwbh. 2019728Fluorescent proteins mNeonGreen and mKOk as a novel donor/acceptorpair for fluorescence resonance energy transfer in analyzingplant protein-protein interactionsWANG Yaqin 1* , LI Zongdi 1, LI Chenyang 1, LI Yunqin 2, HU Tao 1, XIE Li?, ZHOU Xueping 1,3(1 .State Key Laboratory of Rice Biology , Institute of Biotechnology , Zhejiang University, Hangzhou 310058, China ；2.Analysis Centrr of Agrobiology and Environmental Sdencss , Zhejiang University , Hangzhou 310058 , China ；3.Institute of Plant Protection , Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing 100193 , Chia)Abstract The protein-protein interaction is one of the most important fields in proteomics research , which playsan important role in understanding the molecular arms race between plant pathogens and host plants. As a new technology , fluorescence resonance energy transfer (FRET) technique has the advantages of high sensitivity , low false positive and short experiment period , and has been widely employed in detecting protein-protein interactionsin llving cells. In this work , two novel fluorescent proteins mNeonGreen and mKOk were used as a donor/acceptor pair for FRET assay. Compared with traditional fluorescent proteins pair CFP/YFP , mNeonGreen/mKOk pair had l ower background interference. By constructing and expressing fusion proteins of fluorescentproteins and target proteins , protein-protein interactions were successfuly demonstrated in plant cells by FRET. This study provides further technical support and reference for the application of FRET technique in plant cells.Key words protein-protein interaction ； fluorescence resonance energy transfer ； mNeonGreen ； mKOk荧光共振能量转移技术(fluorescence reso nance energy transfer , FRET)是指两个相互靠近的荧光发色基团中,一个分子吸收一定频率的光子被激发到更高的电子能态的同时,通过偶极子相互作用,将能量向另一分子转移(即发生能量共振转移)的现象。

绿色荧光蛋白在生物科研中的应用与发展

绿色荧光蛋白在生物科研中的应用与发展绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）是一种广泛用于生物科研的工具蛋白，它源自于一种发光生物——海葵。

GFP具有自发的荧光特性，能够发出绿色的荧光信号，并且能够与其他蛋白质一起被观察、追踪。

GFP的发现与利用，为生命科学领域带来了一场革命，被广泛应用于光遗传学、分子标记、细胞成像等多个领域。

在本文中，我们将介绍GFP的应用及其在生物科研中的发展情况。

一、GFP的发现与基本原理1992年，日本科学家下村脩祐在对海葵的研究中，发现有一种名为GFP的蛋白质，它能够在紫外光的照射下自发发出绿色荧光。

1994年，美国生物学家马丁·查尔芬（Martin Chalfie）和罗杰·钱（Roger Tsien）证实了GFP的自发荧光特性，并通过转基因技术成功将GFP导入到非常规高等生物体系中，开创了GFP的应用前景。

GFP的发光原理与其他荧光染料不同，它并不需要诱导剂的作用或化学反应的参与。

GFP的分子结构由238个氨基酸组成，可以自行折叠成一个波浪形的结构，其中蛋白“心脏”的中心是一个色团，称为色素环（chromophore），这个环的结构与化学状态有机会决定了GFP发射绿光荧光的特性。

GFP的发光特性具有“自发、可重复、非侵入性、可监测、可定量化、标记靶点准确”的优点，成为生物科学研究中广泛使用的荧光标记分子。

二、GFP在光遗传学的应用光遗传学是指应用光敏感蛋白和分子工程技术对生物活动进行精准控制和实时监测的技术。

GFP在光遗传学研究中被广泛应用，主要用于驱动离子通道、激酶和离子泵的表达。

通过对这些因子的定向表达，可以研究光敏感信号的传递、光学信息的处理和细胞感知。

GFP的分子可以通过基因克隆技术导入到目标细胞或组织中，与其他光敏感蛋白一起被利用为光敏受体。

结合光学影像技术，研究人员可以通过光刺激来操作蛋白质的表达、离子流动、膜的通透性等，从而研究细胞和生物体系中各种生理或病理情况的变化。

绿色荧光蛋白及其在植物分子生物学中的应用

分子植物育种，２００５年，第３卷，第２期，第２４０－２４４页ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ，２００５，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．２，２４０－２４４
专题介绍ＲＥＶＩＥＷ
绿色荧光蛋白及其在植物分子生物学中的应用
吴瑞张树珍＊
中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海口，５７１１０１＊通讯作者，ｚｈａｎｇｓｚ＠ｐｕｂｌｉｃ．ｈｋ．ｈｉ．ｃｎ
１．２ＧＦＰ的改进
由于野生型ＧＦＰ折叠受温度影响，发光较弱；其次， -./ 基因在植物细胞内的表达频率并不高，甚至在某些植物细胞中并不表达（ＨａｓｅｌｏｆｆａｎｄＡｍｏｓ，１９９５）。因此人们运用定点突变、ＤＮＡ－ｓｈｕｆ－ｆｌｉｎｇ等技术对野生型ＧＦＰ进行改造。
１ＧＦＰ的基础研究
绿色荧光蛋白及其在植物分子生物学中的应用２４１ＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎａｎｄＩｔｓＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ
１．１ＧＦＰ性质
从多管水母 !"#$%&’( )’*+%&’, 中分离出的ＧＦＰ是由２３８个氨基酸残基组成的单体蛋白，呈酸性，是一种球状蛋白，分子量为２７￣３０ｋＤ。其中央是一个 ! 罐（"－ｃａｎ）结构（Ｏｒｍｏｅｔａｌ．，１９９６）。ＧＦＰ生色团ＧＦＰ的生色团位于是其发出荧光的物质基础，６４￣６９的六肽内。生色团在翻译后２￣４ｈ内自动催化形成，而ＧＦＰ在合成后需经过一定的折叠过程形成正确的构象后才有功能。ＧＦＰ生色团的形成需要Ｏ２，并使６６位氨基酸残基的 #、 $ 键间脱氢。因此，厌氧条件下ＧＦＰ不能形成荧光。ＧＦＰ在４５０￣４９０ｎｍ蓝光下最稳定，在３４０￣３９０ｎｍ或３９５￣４４０ｎｍ的范围内，会发生光漂白现象；强还原剂如５ｍｍｏｌ／ＬＮａ２ＳＯ４或２ｍｍｏｌ／ＬＦｅＳＯ４能使ＧＦＰ转变为非荧光形式，但重新暴露在空气中时，ＧＦＰ荧光便会立即恢复；弱还原剂和中度氧化剂对ＧＦＰ荧光影响不大；在离体状态下，ＧＦＰ对高温（７０! ）、碱、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶有较强抗性（Ｗａｒｄａｎｄ在Ｂｏｋｍａｎ，１９８２）。ＧＦＰ荧光在ｐＨ７．０￣１２．０时稳定，ｐＨ５．５￣７．０时开始受到影响（ＢｏｋｍａｎａｎｄＷａｒｄ，在高温（＞７０" ）、极端ｐＨ或胍基氯化物条件１９８１）；下，ＧＦＰ会发生变性，而使荧光消失，一旦外界条件恢复正常，荧光将部分恢复（ＷａｒｄａｎｄＢｏｋｍａｎ，目前对ＧＦＰ的荧光发光机制还不清楚，人们１９８２）。推测其生色团的形成必须经过氧化脱氢步骤，并且不同的生物发光机制各不相同，不同的突变体发光机制也有很大差异（Ｈｅｉｍｅｔａｌ．，１９９４）。ＧＦＰ有２个次峰在４７５ｎｍ；有一个发射吸收峰，主峰在３９５ｎｍ，峰在５０８ｎｍ。ＧＦＰ的生色团至少由２种不同的化学组分组成，即中性酚和阴离子酚。４７５ｎｍ峰随ＧＦＰ分子生色团的去质子化或阴离子生色团的增加而增加，３９５ｎｍ则随着ＧＦＰ分子生色团的质子化或中性生色团的增加而增加。野生型ＧＦＰ在室温或低于ＧＦＰ几乎都能正确而快速地折叠，室温下表达时，但当高于室温时，折叠速度剧烈下降（汪恒英等，２００４，生物技术，１４（３）：７０－７２）。

绿色荧光蛋白及其在植物分子生物学研究中的应用

专题介绍Special Topics收稿 2002 03 21 修定 2002 08 08资助国家重点基础研究计划项目(项目编号:2001CB109002)。

* 联系人。

绿色荧光蛋白及其在植物分子生物学研究中的应用赵华1,2梁婉琪2 杨永华1 张大兵2,*(1南京大学生命科学学院生物科学与技术系,医药生物技术国家重点实验室,南京210093;2上海市农业科学院生物技术中心,上海市农业遗传育种重点实验室,上海201106)Green Flu orescent Protein and Its Application in Plant Molecular BiologyZHAO Hua1,2,LIANG Wan Qi 2,YANG Yong Hua 1,Z HANG Da Bing 2(1S tate Key Laboratory o f Pharmac eutical Biotec hnology,De partment of BiologicalSc ienc e and Technology ,Sc hool o f L i f e Scie nce,Nanj ing University,Nanj ing 210093;2Shanghai K e y L aboratory of Agricultural Genetics and Bree ding ,A gri biote ch Rese arc h Cente r ,Shanghai Academy of Agricultural Scienc es,Shanghai 201106)提要绿色荧光蛋白(GF P)是海洋生物水母(A equor ia v ictor ia )体内的一种发光蛋白,近十年来成为在生物化学和细胞生物学研究和应用中用得最广泛的蛋白质之一。

文章就绿色荧光蛋白的特性及其在植物分子生物学中应用的研究进展作了概述。

关键词绿色荧光蛋白;GF P;变种;植物分子生物学绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是一种能发射强烈荧光的特殊蛋白质。

王亮,2010级,绿色荧光蛋白的应用

来源于水母Aequorea victoria的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)现已成为在生物化学和细胞生物学中研究和开发应用得最广泛的蛋白质之一. 其内源荧光基团在受到紫外光或蓝光激发时(λmax=395 nm, 小峰在479 nm)可高效发射清晰可见的绿光. GFP的高分辨率晶体结构为了解和研究蛋白质结构和光谱学功能关系提供了一个极好的机会. GFP已成为一个监测在完整细胞和组织内基因表达和蛋白质定位的理想标记. 通过突变和蛋白质工程构建的GFP嵌合蛋白在生理指示剂、生物传感器、光化学领域以及生产发光纤维等方面展示了广阔前景.1．分子标记利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签(protein taggi ng)，即利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。

由于GFP相对较小，只有238个氨基酸，将其与其他蛋白融合后不影响自身的发光功能，利用GFP的这一特性已经加深了我们对细胞内一些过程的了解，如细胞分裂、染色体复制和分裂，发育和信号转导等。

利用GFP来检测目标蛋白的定位已为我们提供了一种对细胞内的一些基本的生理过程进行更详尽观察的新方法。

除用于特定蛋白的标记定位外，GFP亦大量用于各种细胞器的标记如细胞骨架、质膜、细胞核等等。

Shi等人曾报道将GFP融合到大肠杆菌细胞膜表面用作标记蛋白，这一技术将有助于提高多肽库的筛选效率、疫苗的研制、构建细胞生物传感器用作环境检测以及探测信号转导过程等等。

这些都为传统生物学研究提供了新思路和新方法，成为交叉学科研究的热点。

2．药物筛选许多新发展的光学分析方法已经开始利用活体细胞来进行药物筛选，这一技术能从数量众多的化合物中快速筛选出我们所感兴趣的药物。

荧光探针分布是利用信号传导中信号分子的迁移功能，将一荧光蛋白与信号分子相偶联，根据荧光蛋白的分布情况即可推断信号分子的迁移状况，并推断该分子在迁移中的功能。

利用绿色荧光蛋白GFP研究稻瘟病菌与水稻的互作

利用绿色荧光蛋白GFP研究稻瘟病菌与水稻的互作许有嫔;贺闽;陈学伟;廖海澄;陈金华;罗橼;宿加;邹成东;李伟滔;王静;马炳田【摘要】稻瘟病菌Magna porthe oryzae严重威胁水稻的产量与质量,明确稻瘟病菌与水稻互作过程及机理,对防治稻瘟病具有重要意义.本研究利用稻瘟病菌常用致病菌株GUY11和ZB25,构建了绿色荧光蛋白GFP的过量表达菌株,并通过荧光显微观察菌株侵染寄主水稻过程中侵染结构的形成与发育,包括孢子萌发、附着胞形成、侵染钉形成、侵染菌丝增殖、坏死斑形成及产孢.另外,通过比较过量表达菌株对稻瘟病高抗水稻和易感水稻的侵染过程,发现侵染过程的差异主要集中于侵染钉的穿透和侵染菌丝的定殖.本研究为分析稻瘟病菌对寄主水稻的定殖规律提供了一种有效工具.%Blast disease caused by the fungus Magnaporthe oryzae leads to tremendous loss in production and quality of rice worldwide.To effectively control rice blast disease,we need to understand the infection process and pathogenic mechanism of M.oryzae.Green fluorescent protein (GFP) has been widely used as a labelling tool in life science research.Here we report the construction of a vector overexpressing GFP and the successful introduction of the vector into two commonly used M.oryzae strains Guy11 and ZB25.By using the resulting fungal transformants overexpressing GFP,we observed the successional and dynamic plant infection processes by M.oryzae including conidial germination,germ tube elongation,formation of an appressorium and penetrationpeg,proliferation of infection hyphae within the rice tissue,appearance of blast lesion,development of conidiophore and production of conidia at the blast lesion.We also compared the infection processes of M.oryzaebetween interactions with compatible rice host and incompatible host,and found that M.oryzae underwent normal appressorium on both rice hosts.After the formation of appressorium,M.oryzae was able to develop penetration peg and invasive hyphae within rice tissue in a compatible interaction,but lost these abilities in an incompatible interaction.Our study proves that the M.oryzae expressing GFP facilitates our observation of the processes of M.oryzae infection on rice plant,thus providing an effective tool for examination of pathogen-plant interaction.【期刊名称】《植物保护》【年(卷),期】2017(043)006【总页数】9页(P53-61)【关键词】稻瘟病菌;绿色荧光蛋白;侵染过程;水稻【作者】许有嫔;贺闽;陈学伟;廖海澄;陈金华;罗橼;宿加;邹成东;李伟滔;王静;马炳田【作者单位】四川农业大学水稻研究所,四川省教育厅作物重大病害实验室,杂交水稻国家重点实验室,杂交水稻长江流域协同创新中心,成都611130;四川农业大学水稻研究所,四川省教育厅作物重大病害实验室,杂交水稻国家重点实验室,杂交水稻长江流域协同创新中心,成都611130;四川农业大学水稻研究所,四川省教育厅作物重大病害实验室,杂交水稻国家重点实验室,杂交水稻长江流域协同创新中心,成都611130;四川农业大学水稻研究所,四川省教育厅作物重大病害实验室,杂交水稻国家重点实验室,杂交水稻长江流域协同创新中心,成都611130;四川农业大学水稻研究所,四川省教育厅作物重大病害实验室,杂交水稻国家重点实验室,杂交水稻长江流域协同创新中心,成都611130;四川农业大学水稻研究所,四川省教育厅作物重大病害实验室,杂交水稻国家重点实验室,杂交水稻长江流域协同创新中心,成都611130;四川农业大学水稻研究所,四川省教育厅作物重大病害实验室,杂交水稻国家重点实验室,杂交水稻长江流域协同创新中心,成都611130;四川农业大学水稻研究所,四川省教育厅作物重大病害实验室,杂交水稻国家重点实验室,杂交水稻长江流域协同创新中心,成都611130;四川农业大学水稻研究所,四川省教育厅作物重大病害实验室,杂交水稻国家重点实验室,杂交水稻长江流域协同创新中心,成都611130;四川农业大学水稻研究所,四川省教育厅作物重大病害实验室,杂交水稻国家重点实验室,杂交水稻长江流域协同创新中心,成都611130;四川农业大学水稻研究所,四川省教育厅作物重大病害实验室,杂交水稻国家重点实验室,杂交水稻长江流域协同创新中心,成都611130【正文语种】中文【中图分类】S435.111.41水稻是我国主要粮食作物之一,保障水稻生产安全对我国国民经济发展至关重要[1]。

绿色荧光蛋白在生物医学研究中的应用

绿色荧光蛋白在生物医学研究中的应用绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein, GFP）是一种广泛应用于生物医学研究中的蛋白质标记物。

它最初来源于海葵（Aequorea victoria）中的一个蛋白质，因其绿色荧光而被人们发现，并被广泛用于标记生物分子的研究中。

本文将介绍绿色荧光蛋白在生物医学研究中的应用及其优缺点。

I. GFP技术在药物筛选中的应用药物筛选是一种重要的生物医学研究手段，它通过筛选大量的化合物，找到具有治疗作用的药物。

GFP技术则可以帮助科学家在筛选过程中更加方便地观察细胞中的药物靶点。

以前的药物筛选往往需要使用化学荧光染料，这些染料的发光可能会被药物所抑制，影响筛选结果。

而使用GFP标记靶点，则可以直接观察靶点在细胞内的表达情况，无需使用化学荧光染料。

此外，GFP标记靶点也使得科学家可以在单个细胞的水平上观察相应的实验结果，增加了研究的可靠性和精度。

因此，GFP技术在药物筛选中有着广泛的应用前景。

II. GFP技术在细胞成像中的应用GFP技术在细胞成像中也有着广泛的应用。

在一些研究中，科学家将GFP标记在细胞组织或器官中的某一种蛋白质上，以追踪其在细胞中的运动情况。

由于GFP具有高度的特异性和稳定性，因此可以准确的观察标记蛋白质的表达情况。

这种技术使得科学家可以观察特定细胞或组织的病理生理进程，并为疾病的提早诊断和治疗提供了可能性。

III. GFP技术在基因治疗中的应用基因治疗是一种新兴的治疗疾病的手段，其目的是通过简单而直接的方式将治疗的基因导入到细胞中，来治疗一些疾病。

GFP技术可以帮助科学家更好的观察基因治疗的效果。

在基因治疗过程中，科学家可以使用GFP将目标基因标记出来，然后通过观察GFP标记的表达情况，来判断基因治疗的效果。

这种方法非常简单、直接，而且可以提供非常可靠的数据支持，为基因治疗的推广打下了坚实的基础。

IV. GFP技术的优缺点GFP技术具有许多优点，其中最重要的一点是其易于使用和轻松操作。

绿色荧光蛋白及其在植物研究中的应用

绿色荧光蛋白及其在植物研究中的应用
黄国存;朱生伟
【期刊名称】《植物学通报》
【年(卷),期】1998(015)005
【摘要】绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）是海洋生物水母（Ａｅｑｕｏｒｅａｖｉｃｔｏｒｉａ）体内的一种发光蛋白，分子量２７ｋＤ，由２３８个氨基酸组成。

该蛋白６５￣６７位Ｓｅｒ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ沽种氨在酸环化加氧形成特殊的生色团结构。

野生型ＧＦＰ发光较弱，而且ｇｆｐ－ｃＤＮＡ含有隐蔽型剪切位点，而加工改造的ＧＦＰ在植物中能够正常表达并且加强了荧光信号。

ＧＦＰ作为新的报告基因和遗传标记被广泛应用于植物研究之中。

【总页数】7页(P24-30)
【作者】黄国存;朱生伟
【作者单位】中国科学院植物研究所;河北农林科学院农业生物生理生化研究所【正文语种】中文
【中图分类】Q946.1
【相关文献】
1.绿色荧光蛋白在微生物与植物互作研究中的应用研究进展 [J], 潘虹;雷珍珍;许可静;叶晶龙;廖甜甜;乐超银
2.绿色荧光蛋白基因(GFP)在抗虫转基因植物研究中的应用 [J], 朱生伟;秦红敏;孙敬三;田颖川
3.绿色荧光蛋白在植物病理学研究中的应用 [J], 蒋明;吕枷薪;黄余磊;苗立祥;倪雪
莉;鲍笑笑
4.绿色荧光蛋白在植物与病原菌互作研究中的应用 [J], 史志丹; 宋培玲; 郝丽芬; 皇甫海燕; 燕孟娇; 杨永青; 郭晨; 贾晓清; 皇甫九茹; 李子钦; 张宝辉; 陈斐斐
5.绿色荧光蛋白及其在植物分子生物学研究中的应用 [J], 赵华;梁婉琪;杨永华;张大兵
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绿色荧光蛋白作为分子标记物在微生物学中的应用

绿色荧光蛋白作为分子标记物在微生物学中的应用田　涛,王　琦3(中国农业大学农学与生物技术学院,北京　100094)摘　要　荧光染料在微生物学中的应用受到广泛的关注。

近年来,来源于发光性生物的荧光蛋白进一步丰富了微生物学的研究手段。

其中绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP,来源于水母)具有独特的应用价值。

在活体研究中,GFP相对于其它报告蛋白(如β2半乳糖苷酶)在原位、实时的微生物生理生化研究中有很多优越性。

对GFP作为分子标记物在微生物学中的应用进行回顾,对GFP在微生物与宿主相互作用、生物膜(biofilm)、生物降解、细菌与原生动物相互作用、基因转导、基因表达、蛋白质定位以及生物传感器等领域的应用进行讨论,并扼要介绍了一些应用于荧光观察和定量分析的方法。

关键词　绿色荧光蛋白;标记;微生物;表达中图分类号　Q93-31 文献标识码　A 文章编号　1005-7021(2005)01-0068-06The Application of G reen Fluorescent Protein(GFP)asMolecular Marker in MicrobiologyTIAN Tao,WAN G Qi(Coll.of A gron.&Biotech.Chi na A gric.U niv.Beiji ng100094)Abstract　The application of fluorescent dyes in microbiology has been paid close extensive attention.Recently,flu2 orescent proteins originated from bioluminescent organisms have enriched research means in microbiology,among them green fluorescent protein(GFP)stemmed from jellyfish possesses unique application values.Study in vivo, GFP has many superiorities over other reported proteins,sayβ2galactosidase,in microbio2physiological and biochemi2 cal studies in situ and real time.In this paper,the applications of GFP as molecular marker in microbiology were re2 viewed,the applications of it on interactions between microbes and hosts,bio2membrane,biodegradation,interac2 tions between bacteria and protozoa,gene transfer,gene expression,protein location,as well as biosensors were also discussed.S ome observation and quantitative analysis methods applied on fluorescence were also briefly introduced. K eyw ords　green fluorescent protein(GFP);marker;microbe;expression 自然界中的许多生物都具有发光的能力,如细菌、真菌、萤火虫、深海鱼类和腔肠动物等。

植物邻近蛋白标记技术

植物邻近蛋白标记技术植物邻近蛋白标记技术是一种用于研究植物细胞内蛋白互作关系的重要方法。

通过标记目标蛋白和其邻近蛋白，可以揭示它们在细胞内的相互作用、功能及调控机制。

本文将介绍植物邻近蛋白标记技术的原理、方法和应用。

一、原理植物邻近蛋白标记技术基于蛋白质相互作用的原理，通过将目标蛋白与报告蛋白进行标记，以观察它们在细胞内的相互作用关系。

常用的标记方法包括荧光蛋白标记、酶标记和生物素标记等。

二、方法1. 荧光蛋白标记法：利用荧光蛋白如绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)等，通过基因工程技术将其与目标蛋白融合，使目标蛋白表达时同时表达荧光蛋白。

通过荧光显微镜观察标记蛋白的分布和相互作用情况。

2. 酶标记法：将酶如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)等与目标蛋白结合，通过酶促反应来检测标记蛋白的分布和相互作用情况。

常用的检测方法有免疫组化和酶活性测定。

3. 生物素标记法：将生物素与目标蛋白结合，再利用亲和素-生物素结合蛋白的高度特异性，使用带有亲和素的探针检测标记蛋白的分布和相互作用情况。

三、应用1. 研究蛋白互作网络：通过植物邻近蛋白标记技术，可以鉴定目标蛋白的邻近蛋白，进而构建蛋白互作网络图，揭示蛋白复合物的组成和功能。

2. 研究蛋白功能与调控：通过观察目标蛋白与其邻近蛋白的相互作用，可以揭示目标蛋白的功能及其调控机制。

例如，通过标记转录因子与其结合的共激活蛋白，可以研究转录调控的机制。

3. 研究蛋白定位与运输：通过标记蛋白的特定部位或整个蛋白，可以研究蛋白在细胞内的定位及运输方式。

例如，标记高尔基体定位蛋白可以揭示蛋白的分泌途径和运输机制。

4. 研究病原菌与宿主互作：通过标记病原菌与宿主细胞内的相互作用蛋白，可以研究病原菌的侵染机制及宿主的抵抗机制，从而为控制病害提供理论依据。

植物邻近蛋白标记技术的发展为植物细胞内蛋白互作研究提供了有力的工具，为我们深入了解蛋白功能及其调控机制提供了新的途径。