免疫学技术在科研中的应用

Part III 自身免疫病及实验研究举例
PartI 抗原或抗体的检测
抗原抗体反应的特点
抗原抗体反应的影响因素 常用的抗原抗体反应
抗原抗体反应wenku.baidu.com特点
高度的特异性
可逆性
• 抗原抗体结合除了空间构象互补外，主要以氢键、静 电引力、范德华力和疏水键等分子表面的化学基团之 间的非共价方式结合。这种非共价键不如共价键结合 稳定，极易受温度、酸碱度和离子强度的影响而解离 。
将可溶性抗原或抗体吸附在与免疫无关的颗 粒载体上，形成致敏颗粒，再与相应抗体或抗原 进行反应产生的凝集反应，称为间接凝集反应。 颗粒载体有红细胞、聚苯乙烯乳胶颗粒、活 性炭颗粒，而相应的凝集现象分别称为间接血球 凝集、间接乳胶凝集、间接炭粒凝集反应。
微粒捕获酶免疫分析技术
将已知特异性抗体致敏的免疫微粒与生物素 —亲和素—酶放大系统相结合，最后酶作用于荧 光底物，使之发荧光，通过检测荧光强度判断待 测抗原的含量。 检测肿瘤标记物CAl99、CEA、CAl25、AFP、 性激素、甲状腺素T3T4、叶酸、HIV抗体、HCG等 微量可溶性抗原。
5. 加样前样品应先离心,尤其是长时间放置的样品,以减 少蛋白质带的拖尾现象
6. 为避免边缘效应,可在未加样的孔中加入等量的样品缓 冲液
7. 样品缓冲液中煮沸的样品可在-20℃存放数月,但是反 复冻融会使蛋白质降解. 8. 为减少蛋白质条带的扩散,上样后应尽快进行电泳,电 泳结束后也应尽快转印. 9. 上样时,小心不要使样品溢出而污染相临加样孔 . 10. 取出凝胶后应注意分清上下,可用刀片切去凝胶的一 角作为标记(如左上角)转膜时也应用同样的方法对PDVF 膜做上标记(如左上角)以分清正反面和上下关系. 11. 转膜时应依次放好PDVF膜与凝胶所对应的电极,即凝 胶对应负极, PDVF膜对应正极.
免疫学技术在科研 中的应用
概 述
免疫学技术发展进程的主要阶段
自然的肉眼观察的抗原抗体反应（沉淀反应、凝集反应 ） 加速的肉眼观察的抗原抗体反应（电泳技术、分离技术 ）
标记性免疫技术提高抗原抗体反应的特异性、敏感性
半自动、自动化检验仪器与免疫反应原理结合，加快了 反应过程 标记技术、单克隆技术、高智能自动化技术的最佳组合
免疫沉淀反应后，在40C以3,000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离 心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗 6－10次 ；最后加入15μ l的2×SDS上样缓冲液，沸水煮5分钟；
用搭档。
Co-IP工作示意图
b
a
Y
ab
Y
ba
b
binding wash
a
elution
利用western blot 确定捕获蛋白
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实 验 步 骤
收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解 30min, 细胞裂解液于40C 10,000 rpm 离心10 min后取上清； 取少量裂解液以备 western blot分析，剩余裂解液加1μ g相应的抗 体加入到细胞裂解液，40C缓慢摇晃孵育过夜； 取10μ l protein A琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗 3 次，每次 3,000 rpm 离心3 min； 将预处理过的10μ l protein A琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细 胞裂解液中40C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连 ；
Overview of Immunity 免疫的类型
固有免疫 适应性免疫
innate immunity
adaptive immunity
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固有免疫
病原微生物
innate immunity
固有（innate)/天然(natural) 非特异性（non-specific)免疫 （immunity） * 种群在长期进化过程中逐渐形
2. 形成凝胶的试剂要有足够的纯度, 激活剂的浓度适 当,不仅可以决定凝胶聚合的速度, 也将影响凝胶的质 量,聚胶时的温度也将影响凝胶聚合的速度. 因此,建议 要根据不同温度下适量增减激活剂的用量以保证分离胶 从加入激活剂起至开始出现凝胶凝聚的时间为15-20分 钟最佳, 对于浓缩胶最佳聚合时间为8-10分钟开始可见 聚合.灌完分离胶加水封闭分离胶与外界氧气的结合.
即刻～96小时内 96小时后 非特异性 特异性 无增殖分化，作用迅速 特异性细胞克隆增殖、分化 无免疫记忆 有免疫记忆 作用时间 作用时间短 作用时间长 8 ————————————————————————————— 作用时效 作用特点
Outline
Part I 抗原或抗体的检测
Part II
免疫细胞的检测
免疫比浊技术原理
当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例合适时 ，在特殊的缓冲液中它们快速形成一定大小的抗原抗体复 合物，使反应液体出现浊度。利用现代光学测量仪器对浊 度进行测定从而检测抗原含量。
散射光 透射光
光源 透镜 滤光片
检测器
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单向琼脂扩散实验 （single immunodiffusion）
火箭免疫电泳（rocket immunoelectrophoresis）
原 理
是将单向扩散与电泳 技术相结合的一种方法。 将含有已知抗体的琼脂制 成琼脂板。待检样品加入 阴极侧进行电泳。抗原带 负电荷向阳极移动，并与 抗体结合。在抗原、抗体 比例适当部位形成锥形沉 淀峰，该峰的高度与抗原 量成正比。可快速测出标 本中抗原的含量。
免疫学技术主要相关内容
免疫细胞相关实验技术：单核巨噬细胞、树突状细胞、NK细胞、T细胞、B细胞， 以及这些细胞亚群； 免疫分子相关实验技术：抗原（包括抗原肽）、抗体（包括单抗、多抗、基因工
程抗体）、补体、细胞因子及其受体、HLA、TLR等；
免疫学相关标记技术：荧光、酶、放射、磁珠标记技术和发光分析原理； 免疫学相关蛋白质技术：蛋白质电泳、印迹技术（如 SDS-PAGE、双向电泳、 Western 印迹和斑点印迹）、免疫共沉淀技术等； 免疫学相关检测技术：流式细胞分析和分选技术、细胞凋亡和细胞周期检测技术 、免疫组织化学技术、免疫细胞信号转导研究技术、激光扫描共聚焦显微镜技术 等； 免疫学实验相关动物模型：自身免疫病动物模型（如自身免疫性脑脊髓炎、自身 免疫性甲状腺炎、系统性红斑狼疮等）、感染性疾病动物模型（如利什曼原虫、 弓形虫、巨细胞病毒、李斯特菌等）、肿瘤动物模型、器官移植动物模型等；
成的防御功能，乃经遗传而获得
，并非针对特定抗原。
适应性免疫（adaptive immunity）
机体接受病原体等抗原（决定基）异物刺激后所产生、仅针对相应病原体等抗原 异物发挥效应、使之从体内被清除的防御功能。 * 个体接触特定抗原（决定基）而产生。 * 仅针对该特定抗原（决定基）而发生反应。 * 后天获得；有特异性；有记忆性；作用慢而强。
对流免疫电泳（counter immunoelectrophoresis ）
原 理
是将双向扩散与 电泳技术相结合的一 种方法。将抗原和抗 体在琼脂凝胶孔中电 泳，带负电荷的抗原 向正极运动，带正电 荷的抗体向负极运动 ，二者在琼脂凝胶中 相互作用而形成沉淀 线。
免疫印迹技术
蛋白免疫印迹杂交（Western Blot，WB ）是将蛋白 样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂 交膜上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性定
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常用的抗原抗体反应
凝集反应 沉淀反应
免疫标记技术
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一、凝集反应
细菌、螺旋体和红细胞等颗粒抗原，在适当电解
质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为凝集反
应（agglutination）是最经典的免疫学检测技术。
直接凝集反应 间接凝集反应 间接凝集抑制试验
微粒捕获酶免疫分析技术
间接凝集反应
3. 未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套口 罩防护.梳子插入浓缩胶时,应确保没有气泡,可将梳子稍 微倾斜插入以减少气泡的产生,梳子拔出来时应该小心,不 要破坏加样孔,如有加样孔上的凝胶歪斜可用针头插入加 样孔中纠正但要避免针头刺入胶内.
4. 电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的 气和未聚合的丙烯酰胺,同时建议低电压短时间的预电泳, 清除凝胶内的杂质,疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳 的畅通(恒压10-20V, 20-30min)
原 理
将一定量的抗 体混入琼脂凝胶中 ，使待测抗原在凝 胶中自由扩散，与 相应抗体结合形成 沉淀环，沉淀环大 小与抗原浓度呈正 相关。
1.测定沉淀环直径 2.在标准曲线上查找相应抗原浓度
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双向琼脂扩散实验（ double immunodiffusion ）
原 理
将可溶性抗 原和抗体置于琼 脂凝胶板的对应 孔中，两者各自 在凝胶中向四周 自由扩散，当抗 原与抗体相遇， 在比例合适时形 成沉淀线。
性及定量检测的方法。其鉴定蛋白质的敏感性为1—5ng。
WB是进行蛋白质分析时最常用技术之一。
检测可溶性抗原、细胞成分的鉴定与分析，检测与自 身变性细胞核成分结合的抗体(抗核抗体)，HIV的明确诊断
。
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WB电泳、转膜装置
流 程 图
常见问题及解决方案
注意事项:
1. 免疫印迹杂交的敏感与检测系统有关. 因此, 凝胶 电泳时的蛋白上样量应该保证被检测抗原量不至于太 低, 如果过低应该重新纯化和浓缩使用,或者建议做一 次梯度稀释, 上样电泳后, 直接考马斯亮蓝染色选择 最佳上样量.
免疫共沉淀
（Co-Immunoprecipitation）
原
理
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原
之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典
方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有 效方法。 其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整 细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下 来。如果用蛋白质a的抗体免疫沉淀a，那么与a在体内结合 的蛋白质b也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白 质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作
凝胶内沉淀反应
免疫沉淀
免疫电泳技术
免疫浊度技术
沉淀反应
速率散射比浊法／免疫比浊法 琼脂扩散法
• • • • • 单向琼脂扩散 双向琼脂扩散 火箭电泳 对流免疫电泳 免疫印迹技术
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速率散射比浊法／免疫比浊法
将已知抗体与相应抗原在液相中按一定比例混合形成可 溶性免疫复合物，这些复合物微小粒子对一定波长的光 照射发生散射，可通过光路系统测定光散射(OD)值。 抗体含量固定并处于抗体过剩时，免疫复合物的多少直 接取决于抗原的浓度，抗原的终浓度通过标准品绘出的 标准曲线查出。 提高了灵敏度，通过自动化，可同时检测多个样品并进 行精确的定量分析。 检测前白蛋白、酸性蛋白酶、巨球蛋白、转铁蛋白、尿 微量蛋白及IgG、IgM、IgA及补体，药物含量分析。
二、沉淀反应

免疫沉淀反应: (precipitation) 可溶性抗原与相应抗体，在适宜条件下发生结合，
出现的沉淀现象。
液体内沉淀反应 絮状沉淀试验 环状沉淀试验 单向扩散试验 双向扩散试验 免疫电泳 对流免疫电泳 火箭免疫电泳 免疫固定电泳 透射免疫比浊 turbidimetermeasure 散射免疫比浊 nephelomitermeasure
可刺激机体产生特异性免疫 应答的物质
产生抗体 刺激机体 致敏淋巴 细胞
抗原决定簇
抗原
适应性免疫
固有免疫与适应性免疫的特点
————————————————————————————— 固有免疫 适应性免疫 ————————————————————————————— 细胞组成 粘膜和上皮细胞、 T淋巴细胞、B淋巴细胞、 吞噬细胞、 NK细胞、 抗原提呈细胞 NK1.1+T细胞、γ δ T细胞 B-1细胞 产生 先天具有 后天经抗原刺激而获得
抗原抗体比例影响免疫复合物的大小 抗原抗体反应的两个阶段
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抗原抗体反应的影响因素

抗原抗体浓度与比例 电解质
* 抗原抗体特异性结合后，亲水性降低，易受电解 质的影响而使表面失去较多的负电荷。

温度
* 适当的温度可增加抗原与抗体分子的碰撞机会， 加速抗原抗体复合物的形成。

酸碱度
* 抗原抗体反应的最适pH在6—8之间，pH过高或过 低，即过碱或过酸，均可影响抗原、抗体的理化 性质。