胎盘间充质干细胞的分离和培养
(完整)胎盘间充质干细胞的分离和培养 2016.07.21
胎盘间充质干细胞的分离，原代与继代培养及鉴定刘亭2016.7。
21目录前言 (2)1分离制备PMSC组织的选取 (4)2脐带，胎盘MSC的分离与纯化 (6)2.1胎盘组织的获取，存储与清洗 (6)2-2 脐带，胎盘MSC的分离及纯化方法 (7)3 原代培养和继代培养 (11)3—1培养基 (11)3-2培养密度 (12)3-3培养条件 (13)3—4换液 (13)3—5 传代培养 (13)3—6细胞形态与生长速度 (14)3—7 MSC的冻存与复苏： (14)4细胞表面抗原检测 (14)5生长曲线 (15)6细胞周期 (15)7分化潜能 (15)参考文献 (15)附件1不同实验室从脐带血,脐带和胎盘等各组织中分离MSC的方法.. 16脐带血 (16)脐带 (17)羊膜 (19)绒毛膜 (19)蜕膜层 (20)胎盘 (21)整体灌注法 (22)附件2 背景知识 (22)附件3 PMSC实验所需试剂 (23)前言干细胞（Stem cell，SC）是一种能够自我更新且未分化并可分化成两个或两个以上其它品系的细胞。
在一定的条件下，干细胞能够分化成为多种成熟细胞类型。
按照来源和分化潜能不同，干细胞可分为胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESC）和成体干细胞(Adult stem cell，ASC）两类。
胚胎干细胞来源于早期的胚泡和胚胎内层的细胞群，并且具有向3个胚层细胞分化的能力.但是胚胎干细胞应用时产生的免疫排斥、体内实验中引发肿瘤生成以及所涉及的伦理问题等影响并制约了临床应用。
成体干细胞形成于原肠胚形成后的胎儿和成体组织,早期研究认为，成体干细胞主要分化为其来源组织的细胞类型。
然而，近几年来的很多研究表明，成体干细胞具有能够分化成为除来源以外的其他胚层组织的能力。
间充质干细胞(Mesenchymal stem cell， MSC）又称为基质干细胞，是属于成体干细胞的一种，最早从骨髓中分离而来。
胎盘间充质干细胞提取工艺流程
胎盘间充质干细胞提取工艺流程
胎盘间充质干细胞（Wharton's jelly mesenchymal stem cells）的提取工艺流程一般包括以下步骤：
1. 胎盘收集：选取安全的胎盘来源，一般为胎儿顺产后鲜胎抽提的胎盘组织。
2. 清洗处理：将收集到的胎盘进行外表面的血液和组织清洗，以去除附着的污物。
3. 割裂分离：将清洗后的胎盘割裂，使其内部的胎盘间充质暴露在外。
4. 切碎消化：将割裂后的胎盘间充质组织进行切碎处理，并使用消化酶如胶原酶等进行消化，以分离细胞。
5. 过滤筛选：通过滤网或者离心等方法，筛选掉消化后的胎盘组织渣滓，留下单个的胎盘间充质细胞。
6. 细胞培养：收集到的胎盘间充质细胞进行培养，提供适当的培养基和条件，使其能够继续增殖和扩增。
7. 细胞鉴定：通过免疫细胞化学染色、流式细胞术等方法，对细胞进行鉴定，确认其为胎盘间充质干细胞。
8. 存储冻存：将已经被鉴定的胎盘间充质干细胞进行冻存，以便后续的应用和使用。
以上是一般的胎盘间充质干细胞提取工艺流程，不同实验室和厂家可能会根据具体需要进行微调和改变。
具体的工艺流程还需要根据实际情况进行优化和调整。
01.胎盘蜕膜间充质干细胞分离与接种
胎盘蜕膜间充质干细胞分离与接种1. 设备、耗材和试剂准备1.1.设备：生物安全柜、高速冷冻离心机、CO2培养箱、恒温振荡器。
1.2.耗材：5mL移液管、10mL移液管、25mL移液管、50mL离心管、75%酒精棉球、T75培养瓶、封口膜、无尘布、100mm皿、150mm皿、50mL注射器、16号针头、10mL注射器、输液器。
1.3.试剂：0.9%氯化钠注射液、75%酒精、无血清干细胞培养基、干细胞培养基添加物、双抗、2%Ⅰ型胶原酶。
1.4.器具：移液器、酒精喷壶、无菌剪刀、无菌止血钳、无菌组织镊、离心管架，常规止血钳。
2. 操作流程2.1.组织处理前2.1.1.将胎盘样本从4℃冰箱中取出，用含75%酒精的无尘布，擦拭胎盘采集袋外表面，将其放入传递窗中，开紫外消毒灭菌。
2.1.2.实验室技术人员按照《洁净实验室人员进场管理规程》进入实验操作区。
2.1.3.开启生物安全柜，用含75%酒精的无尘布擦拭台面及离心管架、器械、移液枪，待生物安全柜运行10分钟后方可进行实验操作。
2.1.4.在等待过程中，将无血清干细胞培养基从4℃冰箱中拿出来，常温下复温。
将分装为5mL的干细胞培养基添加物和分装为1mL的双抗以及1mL2%Ⅰ型胶原酶从-20℃冰箱中拿出常温复温，一支5mL的双抗放入37℃培养箱复温。
2.1.5.准备500mL的0.9%氯化钠注射液、16号针头、10mL注射器、移液管、输液器，用含75%酒精的无尘布擦拭0.9%氯化钠注射液瓶、16号针头、10mL 注射器以及复温结束的5mL双抗放入生物安全柜中，再取3支50mL离心管于生物安全柜中的离心管架上间隔摆放，离心管架摆放在右上角处。
2.1.6.将已灭菌的器械盒放入生物安全柜中，灭菌盒中包含止血钳*3、组织镊*3、弯剪*1和直剪*2。
2.1.7.使用生物安全柜中常规的止血钳拉开0.9%氯化钠注射液的拉盖，再使用酒精棉球擦拭0.9%氯化钠注射液瓶口，用10mL注射器吸取5mL双抗，加入到0.9%氯化钠注射液瓶，拔出注射器，将针头放入锐器盒中，注射器丢入垃圾桶中，打开16号针头包装，用止血钳将其夹住插入0.9%氯化钠注射液瓶中。
人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)的分离、体外培养及诱导分化
万方数据
万方数据
人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)的分离、体外培养及诱导分化
作者：丛姗， 宋瑾， 张惠娟， 李岩， 白立恒， 曹贵方， CONG Shan， SONG Jin， ZHANG Hui-Juan， LI Yan， BAI Li-Heng， CAO Gui-Fang
作者单位：丛姗,宋瑾,张惠娟,李岩,曹贵方,CONG Shan,SONG Jin,ZHANG Hui-Juan,LI Yan,CAO Gui-Fang(内蒙古农业大学兽医学院/动物组织胚胎学与发育生物学实验室,呼和浩特,010018)， 白立恒,BAI Li-Heng(内蒙古
妇幼保健医院妇产科,呼和浩特,010020)
刊名：
农业生物技术学报
英文刊名：Journal of Agricultural Biotechnology
年，卷(期)：2015,23(1)
引用本文格式：丛姗.宋瑾.张惠娟.李岩.白立恒.曹贵方.CONG Shan.SONG Jin.ZHANG Hui-Juan.LI Yan.BAI Li-Heng.CAO Gui-Fang 人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)的分离、体外培养及诱导分化[期刊论文]-农业生物技术学报 2015(1)。
人类胎盘中免疫调节性细胞的分离与鉴定
人类胎盘中免疫调节性细胞的分离与鉴定人类胎盘是在妊娠期形成并承担保护和营养作用的。
研究表明，胎盘是一个富含免疫调节细胞的微环境。
在近年来对于免疫调节性细胞研究中，胎盘细胞作为一种大量高效的免疫细胞源，具有极为重要的前景。
而免疫调节性细胞在临床中的应用也越来越受到关注。
因此，本篇文章将从胎盘细胞的来源、分离方法及如何鉴定其免疫调节性细胞等方面进行阐述。
第一部分胎盘细胞来源胎盘是连接胚胎和子宫的重要通道和器官，是保障胎儿发育和生长的重要场所。
胎盘具有含有多种类型的免疫细胞，包括单核/巨核细胞，树突状细胞，自然杀伤细胞，T细胞和B细胞等。
当然，胎盘免疫细胞中也含有大量的免疫调节性细胞。
胎盘间充质干细胞、脐带血生物库中的脐带间充质干细胞和羊膜脐带中的羊膜间充质干细胞等，都是深受广大科研工作者和医务人员关注的细胞类型。
第二部分胎盘细胞分离方法1.采用酶处理胎盘组织分离细胞这种方法是最常用的分离胎盘细胞的方法之一。
采用此法处理胎盘组织，使细胞间的粘附结合被破坏并发生细胞表面分化，从而使胎盘细胞分离。
2.采用离心法分离胎盘细胞离心法是另一种分离胎盘细胞的重要方法之一。
该方法是通过不同离心速度和时间使胎盘细胞分布不同，从而筛选出种类不同的细胞。
除此之外，还有胎盘细胞黏附法，用蛋白酶和胶原酶消化胎盘组织等方法可以分离出胎盘细胞。
第三部分胎盘细胞免疫调节性细胞鉴定1.表型检测胎盘细胞中的免疫调节性细胞可以通过表型检测进行鉴定。
目前，通过流式细胞术监测表面标记和蛋白质等，广泛用于分析人类胎盘干细胞的表型性质。
2.功能检测功能检测包括胎盘细胞的分泌功能、增殖、分化和迁移等方面，可以通过测量其生长曲线、染色体分析、生物学效应等方式进行分析。
总结总之，胎盘细胞中的免疫调节性细胞有着很大的应用前景，因此，准确高效的鉴定方法也显得尤为重要。
当然，随着科学技术的不断更新，胎盘细胞的分离和鉴定方法也将不断地进行改良和完善，以便更好地为人类健康事业做出贡献。
酶消化和整体灌注分离人胎盘间充质干细胞的比较
ＲＥＳＵＬ Ｓ Ｔ ＡＮＤ ＣＯＮＣＬＵＳＩ ＯＮ： ｈ ｅ ｗａ ｏ ｓｇｎｆ ａ ｔ ｆ ｅ ｃ ｆ ｈ ｅ Ｉ ｒ ｗ ｈ ｍ ｕｔ ｌ ｉ ｅ ｅ ｔ ｔ ｎ ｐ ｔ ｔ ｌ ｅ ｅ Ｔ ｅｒ ｓ ｎ ｉ ｉｃ ｎ ｅｒ ｎ ｅ ｏ ｅ ｃ ｌ ｇ ｏ ｉ ｄｉ ｔ ｔ ． ｌｐ ｅ ｄ ｆ ｒ ｎ ｉ ｉ ｏ ｅｎ ｉ ｔ ｅｎ ｉ ａｏ ａｂｗ
ｄ ｉ ０３ ６ ／ｉｓ ．６ ３８ ２ ．０ ０３ ．１ ｏ： ．９ ９ｊｓ ｎ１ ７ —２ ５２ １ ．２０ ２ １ ． 李 片，苗宗 宁，许云云，张学光．酶消化和整体灌注分离人胎盘问充质十 细胞的比较【】 Ｊ． 中闭组织工程研究与临床康复，２ １ ００
Ｓｕ ｏ ２１ ００ ｚｈ ｕ ７ ５ Ｊ ａ ｇ ｒ ｉｃ ｉ ｎ ｓｕ Ｐ ｏｖｎ ｅ，
摘 要 背景 ： 目前 ，分离和纯化人胎盘 间充质干细胞的方法带有一定的 卣目性 ，因为胎 盘组织 中其他 细胞 的干扰情 况严重 。 目的：探讨酶消化和整体灌注的方法分离培养人胎盘问充质干细 胞的效 果，寻找 一种 高效的分离方法 ，以建立稳定 的体外培 养体系 。
方法 ：取完接的胎盘组织 ，按照不同的培养方法分离人胎 盘问充质 干细胞 ，酶 消化组采用 Ⅳ型胶原 酶消化分离 ；整体灌注组
¨ 组 织 Ｔ 研 究 与 临 Ｊ 复 彩 ７ １ ］ 术康 ４
彩 ３ ２
２１ ０ ０—０ ８—０ 出版 ６
Ｊ ｕｎ ｌ ｆ ｈ ｉａ ｅ ａ ｉ ａｉ ｉｓ ｅ Ｅ ｇ ｅ ｎ ｅ ｅ ｒ ｈ Ａ ｇ ｓ ＇ ０ ０ Ｖ １ ４ Ｎｏ３ ｏ ｒａ Ｃ ｎｃ ｌ ｈ ｂ ｉ ｔ ｅ Ｔｓ ｕ ｎ ｍｅ ｎ ｇ Ｒ ｓ ａ ｃ ｕ ｕ ｔ ２ １ ｏ． ， ２ ｏ Ｒ ｌ ｖ ｔ ６ １
人胎盘间充质样干细胞的分离、培养及其生物学特性分析
术瓶 颈． 人体 胎 盘 为研 究对 象 ， 分 散 组 织 细 胞 的 基 础 上 ， 过 不 同时 间梯 度 贴 壁 方 法 分 离纯 化 了人 胎 盘 间 充质 以 在 通
样 干 细胞 ， 与 常规 的 直接 贴 壁 方 法作 了比较 ， 并 同时 分 析 了时 间梯 度 贴 壁 方 法 分 选 细 胞 的 增 殖 能 力 、 多分 化 潜 能 以 及 免 疫原 性 ． 究 结 果表 明 ， 间梯 度 贴 壁 法 获 得 的 细 胞 具 有 较 强 的 增 殖 能 力． 接 贴 壁 法 得 到 的 细 胞 不 具 有 分化 研 时 直 潜 能 ， 时 间 梯 度 贴 壁 法 获得 的 细胞 具 有 向成 骨 细胞 和 成 脂 肪 细 胞 方 向 分 化 的 能 力 ． 过 对 免 疫 原 性 基 因检 测 的 而 通 分析 ， 明 时 间梯 度 贴壁 法 获得 的 细胞 表 达 ＨＬ — 但 不 表 达 ＨＬ Ⅱ． 表 Ａ Ｉ， Ａ一
（ ． ｌｅ ｅｏ Ｓ ｉｎ ｅ ，ＺｈＪ ａ ｇ Ｕｎｖ ｒｉｙ，Ｈａ ｇｚ ｏ １ ０ ８，Ｃｈ ｎ １ Ｃｏｌｇ ｆ Ｌｉ ｃｅ ｃｓ ｅ ｉｎ ｉ ｅｓｔ ｎ ｈ ｕ３ ０ ５ ｉａ；２ Ｔ ｅＳ ｃｎ ｓ ｔ ｌｏ ｎ ． ｈ ｅｏ ｄ Ｈｏｐｉ ｆ Ｈａ ｇ— ａ
袁 文 佶 黄 颖 芝 ， ，高 璎 。 ，石 东燕 ，宗 晨 ，刘 立 跃 ，王 金 福
（ ．浙 江 大 学 生 命科 学 学 院 ， 江 杭 州 ３ ０ ５ ； ．杭 州 市 第 二 人 民 医 院 ， 江 杭 州 ３ ０ １ ） １ 浙 １０ ８ ２ 浙 １ ０５
摘ห้องสมุดไป่ตู้
要 ： 组 织 块 中分 离纯化 成体 干 细胞 具 有一 定 的 困 难 ， 他 细 胞 的 混 杂 成 为 获 取 高 纯 度 组 织 干 细胞 的 一 个技 从 其
一种人羊膜间充质干细胞的分离培养方法[发明专利]
![一种人羊膜间充质干细胞的分离培养方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/abeca4e97cd184254a3535e6.png)
专利名称：一种人羊膜间充质干细胞的分离培养方法专利类型：发明专利
发明人：张晓南,吴芳春,谷涌泉,侍晓云,张斌
申请号：CN202011623274.8
申请日：20201231
公开号：CN112574948A
公开日：
20210330
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供一种人羊膜间充质干细胞的分离培养方法，包括从胎盘上剥离羊膜层、清洗、剪碎和消化，其特征在于：还包括从胎盘上剥离羊膜层后，除去基底膜下的基质组织使分离的羊膜尽可能的薄和除去血细胞，然后再进行剪碎和消化；其中胎盘组织为新鲜的足月顺产胎儿的胎盘组织，且胎盘组织经过消毒、清洗后即在无菌条件下，从胎盘上分离羊膜层；且人羊膜不需要先进行上皮细胞的消化分离，而是直接用于消化分离人羊膜间充质干细胞。
采用本发明的人羊膜间充质干细胞的分离培养方法分离得到的人羊膜间充质干细胞纯度高、活力强、增值快。
结论建立了人羊膜间充质干细胞分离、培养及鉴定方法。
hAMSCs具有骨髓间充质干细胞的表型特征。
申请人：北京昱龙盛世生物科技有限公司
地址：100095 北京市海淀区上地信息路1号1号楼18层1801
国籍：CN
代理机构：北京驰纳智财知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：李佳佳
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干细胞的提取和培养方法介绍
干细胞的提取和培养方法介绍干细胞被广泛认为是生物学领域内最具潜力的研究对象之一，因其具备自我更新和多能分化的能力而备受科学家关注。
为了更好地理解干细胞在生物体内的作用和应用其潜力进行研究，有效的提取和培养方法是至关重要的。
本文将介绍几种常见的干细胞提取和培养方法，包括胚胎干细胞（ESC）、诱导性多能干细胞（iPSC）、成体干细胞和间充质干细胞。
胚胎干细胞（ESC）是最早被发现的一类干细胞，具有自我更新以及多能分化的特性。
提取ESC的方法通常是通过将内细胞团从早期胚胎中分离出来并将其培养在基质上，如鹅卵石胎盘或凝胶基质中。
内细胞团是胚胎早期形成的一层细胞，可以发展成各种不同类型的细胞，如肌肉、神经和心脏细胞。
随着科学技术的进步，科学家发现可以通过重新编程细胞来生成诱导性多能干细胞（iPSC）。
iPSC具有和胚胎干细胞相似的自我更新能力和多能分化能力，但不需要从胚胎中获得。
iPSC的提取方法主要包括细胞重新编程，即通过转导特定的基因或使用李斯特病毒进行基因转移，将成体细胞重新编程为干细胞。
成体干细胞是体内已分化的特定组织或器官中存在的干细胞。
这些干细胞具有自我更新和有限的分化能力。
成体干细胞可以从多种来源中提取，例如骨髓、脂肪组织和肌肉组织。
提取成体干细胞的方法通常是通过穿刺或手术获取组织样本，然后分离和培养出其中的干细胞群。
间充质干细胞是一类存在于成体组织中的多潜能干细胞，可以分化为多种类型的细胞，如脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞。
间充质干细胞主要存在于骨髓、脐带血和脂肪组织中。
提取间充质干细胞的方法主要通过采用骨髓穿刺、脂肪组织切割或脐带血采集等操作，然后将提取到的细胞进行培养和扩增。
无论是胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、成体干细胞还是间充质干细胞，提取和培养方法都需要遵循一些基本原则。
首先，细胞提取过程应该尽量避免对细胞的损伤，以确保细胞的完整性和功能。
其次，培养环境应提供适当的营养物质、生长因子和细胞外基质，以促进干细胞的增殖和分化。
胎盘蜕膜间充质干细胞分离培养SOP
胎盘蜕膜间充质干细胞分离培养SOP一、样本接收1.正常足月顺产男婴，与产妇及其家属签署知情同意书后，在产房无菌条件下获取胎盘，放至无菌袋中，4℃运输至细胞中心。
2.观察运输箱的温度是否符合要求，采集瓶有无渗漏。
3.查看客户信息是否与交接表一致。
4.样本采集瓶外表面喷酒精擦拭消毒，并粘贴样本编码，填写样本接收记录，传入洁净区准备制备。
二、胎盘蜕膜间充质干细胞分离与接种1.准备耗材试剂：15cm培养皿、15ml离心管、50ml离心管、离心管架、10ml 移液管、T75培养瓶、离心管架、无尘布、封口膜、100目滤网过筛、灭菌手术刀、灭菌止血钳、灭菌镊子、灭菌剪刀、废液缸、无血清干细胞培养基（常温复温）、DPBS、双抗、75%酒精（已过滤）、Ⅰ型胶原酶。
2.仪器设备准备及预热：生物安全柜、二氧化碳培养箱、离心机、电动移液器、倒置相差显微镜、摇床（37℃150r/min）。
3.将75%酒精喷到台面，用无尘布擦拭台面，包括侧面及玻璃。
4.将生物安全柜开紫外30min通风10min，样本喷酒精擦拭，放入生物安全柜中，实验中所需要的相关试剂及耗材等喷酒精擦拭放入生物安全柜中。
5.取无菌托盘，加入含1%青链霉素的DPBS，将胎盘组织放入其中，并取适量样本保存液留样送检支原体。
并洗涤组织两三次，洗去表面的血污，直至清洗的液体无血色。
6.清洗结束后，将胎盘放入无菌托盘中，然后使用无菌剪刀分离胎盘底部靠近母体一侧的蜕膜组织，再将蜕膜组织剪碎至1-3mm3的微小组织块，加DPBS定容离心，500g 5min。
7.离心结束后，去上清。
按照蜕膜组织与消化液体积比为2:5的比例加入消化酶，在37℃150r/min的条件下震荡消化至少一个小时，再按消化酶与0.05%的胰酶体积比为1:1的比例加入0.05%的胰酶，在37℃150r/min的条件下震荡消化15min。
8.用无血清干细胞培养基终止消化，吹打悬液20-30次，打散组织，混匀细胞，将消化的组织液通过100um细胞筛网过滤出组织和胎盘蜕膜间充质干细胞两部分，组织留在滤网上，下层则是细胞悬液，加DPBS定容混匀离心。
人胎盘间充质干细胞促进血管生成
人胎盘问充质干细胞促进血管生成
赵 基 栋 ，苗宗 宁 ，钱寒 光 ，彭 玮 ，司志 平
无锡市第三人 民医院骨科（ 修复重建科） ，江苏省无锡市 ２ １ ４ ０ ４ １
文章 亮 点 ： １ 在 组织 工程骨 修 复缺 损的 过程 中， 良好 的血 管化 能为骨 缺损 部位 微环 境 提供 大量 的成骨 细胞 、信 号分 赵 基栋 ，男， １ ９ ６ １ 年生， 浙 江省 宁 波市 人 ，汉 族 ， 子 以及 营养 供应 ， 同时 能带走 代谢 废物 与各 种 降解产物 ，有 助 于建 立骨 再生微 环境 。 ２ 采 用大 量生 物学 功 能 良好 的成 骨细 胞和 血管 内皮 细胞 一 同与支 架材 料复 合培 养 ， 是促进 骨组 织工 程血 管 化 的重要 方法 。 ３ 文 章 的独特 之处 在 于课题 组前 期 的实验 结 果表 明胎盘 来源 间充 质干 细胞 体外 可 以分化 为血 管 内皮 细 胞 的基 础上 ， 进 一 步探 讨胎盘 间充质 干细 胞 以及丝 素蛋 白， 羟基磷 灰石 复合 材料 在组 织工 程骨修 复 骨缺损 以及 促进 血管 再生 过程 中的 作用 医 科 大 学 毕
业 ， 副主 任 医师 ，主 要 从
事组织工程骨创伤修复整
形方 面 的研究 。 ｚ ｉ ｄ ６ ６ ＠ｈ ｏ ｔ ｍａ ｉ ｌ ． ｃ ｏ ｍ
通讯 作者 ：苗宗 宁 ，博士 ， 副主任 医师 ， 无锡 第三 人 民 医 院 ， 江 苏 省 无 锡 市
２１ ４ ０４ １
干细 胞 ；干 细胞 培养 与分 化 ；胎盘 间充 质干 细胞 ；丝 素蛋 白；羟 基磷 灰石 ；骨缺 损 ；血管 内皮 细胞 ；血 管生 成 ；支架 材料 ；桡 骨 中段 ；血管 再生 ；组 织工 程 ；干细 胞 图片文 章
人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离培养的新方法
人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离培养的新方法唐书生;孙逊沙;吴洁莹;陆琰;陈劲松;李发涛;唐婕;吴韶清【摘要】To establish an effective and easy method of isolating and cultivating human placental chorionic-derived mesenchymal stem cells (hpcMSCs).Human placental chorion were isolated by hand held electric homogenizer and enzyme digestion.The morphol-ogy of hpcMSCs was observed under the inverted microscope.The cell growth curve was measured by CCK-8 method.The third gen-eration of hpcMSCs were detected with flow cytometer,and incubated in osteogenesis and adipogenesis.Osteogenous potential was as-sessed by alizarin red staining.Adipogenic potential was evaluated by Oil red O staining.The adherent cells showed fibroblast-cell-like shape.CD73, CD105 and CD90 membrane antigens could be detected in the third generation of hpcMSCs,but CD34, CD45, CD14, CD19 and HLA-DR membrane antigens were not detected.Following induction, alizarin red staining and Oil red O staining produced a strong reaction in cells.The whole isolate and cultivation is an effective and easy method to obtain a largely amount of prima-ry hpcMSCs.It may represent a plentify stem cell source for the regenerative medicine.%建立一种简便、快捷的人胎盘绒毛膜间充质干细胞(human placental chorionic -derived mesenchy-mal stem cells, hpcMSCs)分离培养方法.用手持电动匀浆器处理人绒毛膜,经酶消化后接种培养,用倒置显微镜观察细胞形态,CCK-8测定细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞表面标记,成脂、成骨诱导分化试剂盒鉴定细胞的分化潜能.获得的人胎盘绒毛膜间充质干细胞为成纤维细胞样细胞,呈平行排列或漩涡状生长,高表达CD73、CD105、CD90,而CD34、CD45、CD14、CD19、HLA-DR呈阴性,生长曲线为" S"型,经成骨或成脂诱导后,茜素红染色或油红O染色呈阳性.符合国际细胞治疗学会认可的间充质干细胞标准.建立了人胎盘绒毛膜间充质干细胞的分离培养新方法,结合了组织块法和酶消化法的优点,为绒毛膜间充质干细胞的应用提供基础.【期刊名称】《生物医学工程研究》【年(卷),期】2018(037)002【总页数】4页(P229-232)【关键词】间充质干细胞;绒毛膜;细胞分离;细胞培养;方法【作者】唐书生;孙逊沙;吴洁莹;陆琰;陈劲松;李发涛;唐婕;吴韶清【作者单位】广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心,广州510623;中山大学附属广州市妇女儿童医疗中心,广州510623;中山大学附属第一医院,广州510080;广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心,广州510623;中山大学附属广州市妇女儿童医疗中心,广州510623;广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心,广州510623;中山大学附属广州市妇女儿童医疗中心,广州510623;广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心,广州510623;中山大学附属广州市妇女儿童医疗中心,广州510623;广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心,广州510623;中山大学附属广州市妇女儿童医疗中心,广州510623;广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心,广州510623;中山大学附属广州市妇女儿童医疗中心,广州510623;广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心,广州510623;中山大学附属广州市妇女儿童医疗中心,广州510623【正文语种】中文【中图分类】R3181 引言间充质干细胞是一种来源于中胚层，具有多向分化潜能的成纤维样贴壁细胞，是组织工程研究中一种重要的种子细胞和基因治疗的载体，已成为干细胞临床转化应用研究的热点[1-3]。
分离培养干细胞的方法分类
分离培养干细胞的方法分类
分离培养干细胞的方法主要可以分为以下几类：
1. 最常见的方法为机械分离法，利用组织或细胞的物理性质进行分离。
例如在骨髓中分离造血干细胞时，可以利用胶体或其他分离物质将骨髓细胞进行分层，然后将不同层次的细胞进行分离。
2. 免疫选择法，利用单克隆抗体的特异性结合，将目标细胞从混合细胞中分离出来。
例如在胎盘组织中分离胚胎干细胞时，可以利用特异性的单克隆抗体识别胚胎干细胞表面的记号分子，然后利用磁性微珠等手段将这些细胞分离出来。
3. 化学处理法，利用化学或药物物质的特性，直接或间接地影响目标细胞的生长与分裂。
例如在胚胎干细胞的培养中，可以利用衍生自自然化合物的小分子化合物，来调控细胞的生长与分裂。
4. 细胞团块培养法，利用干细胞的自我复制和自我更新的特点，在培养基中形成球状细胞团，然后分离出内部细胞团中的干细胞。
例如在胚胎干细胞的分离中，可以将早期发育阶段胚胎的内细胞团分离出来进行培养。
以上是几种干细胞分离与培养方法的分类和简要介绍。
脐带血血清分离培养人胎盘间充质干细胞
脐带血血清分离培养人胎盘间充质干细胞周心涛;赵黎丙;闵新文;陈娇;郎明健【期刊名称】《贵阳医学院学报》【年(卷),期】2015(40)4【摘要】目的：探讨脐带血清（UCBS）分离、培养人胎盘间充质干细胞（PMSCs）的增殖及分化能力。
方法：将 UCBS 处理后用于分离、培养 PMSCs 作为实验组，同体积 FBS 分离、培养 PMSCs 作为对照组，用相差显微镜观察实验组与对照组 PMSCs 的形态、流式细胞仪检测 PMSCs 表面标志、MTT 法检测PMSCs 的增殖能力。
结果：10％ UCBS 的培养液分离纯化的 PMSCs 成梭形、增殖能力强，具有分化为成骨细胞和脂肪细胞的能力，高表达CD29、CD44及CD105，低表达或不表达 CD34、CD45及 HLA-DR；与对照组相比，UCBS 组细胞增殖能力更强。
结论：脐带血清能分离、培养及扩增 PMSCs，培养的 PMSCs 的增殖能力及分化潜能好于 FBS。
%Objective:To investigate the proliferation and differentiation abilities of human placenta mesenchymal stem cells (PMSCs ) isolated and cultured in human umbilical cord blood serum (UCBS).Methods:PMSCs isolated and cultured in UCBS served as experiment group and the same volume PMSCs isolated and cultured in FBS served as the control.PMSCs cell's morphology were ob-served under phase contrast microscope,flow cytometry were used to detected cell surface markers, MTT were used to test cell proliferationactivity.Results:PMSCs isolated and cultured in 10% UCBS were spindle shaped,having high reproductive activity and could be induced toosteoblasts and adipo-cytes,highly expressed CD29,CD44 and CD105,but lowly expressed or didn't express CD34,CD45 and HLA-DR.The proliferation of experiment group was stronger than that of control group.Conclu-sions:UCBS can be used to isolate and culture PMSCs,and the proliferation and differentiation abili-ties of PMSCs in UCBS are better than those in FBS.【总页数】4页(P373-376)【作者】周心涛;赵黎丙;闵新文;陈娇;郎明健【作者单位】湖北医药学院附属东风医院，湖北十堰 442000;湖北医药学院附属东风医院，湖北十堰 442000;湖北医药学院附属东风医院，湖北十堰 442000;湖北医药学院附属东风医院，湖北十堰 442000;湖北医药学院附属东风医院，湖北十堰 442000【正文语种】中文【中图分类】R329.24;R34-33【相关文献】1.人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离培养的新方法 [J], 唐书生;孙逊沙;吴洁莹;陆琰;陈劲松;李发涛;唐婕;吴韶清2.脐带血血清培养脐带血间充质干细胞对脐带血CD34+细胞的体外扩增作用 [J], 黄望香;旷文勇;李睿娟3.人脐带血清合用胎牛血清培养人脐血间充质干细胞 [J], 王爽;范振海;王钰莹;喻皇飞;刘祖林;胡锡阶;余丽梅4.脐带血清和成人自体血清体外培养人骨髓间充质干细胞的比较 [J], 旷文勇;周新伏;李睿娟;郑敏翠5.人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离培养方法研究 [J], 陈凤;卿玲;崔璐;王淼;王菲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
胎盘间充质干细胞的分离和培养 XX6.07.21
小时候，场队里面有片我一眼望不到边的荷塘。
妈妈经常带着我到荷塘边采莲叶摘莲蓬剥莲子，我边走边跳的跟着，嘴里连说带唱地念：“毕竟西湖六月中，风光不与四时同。
接天莲叶无穷碧，映日荷花别样红。
”妈妈教的杨万里的诗。
碧绿的荷塘里高低错落地盛开着粉白的粉红的荷花，有的羞答答地躲在莲叶下，有的则大方地在艳阳下舒展妙曼的身姿，把小蜜蜂忙得不停地在花瓣中花蕊里飞来飞去。
清风一阵阵地送着荷花的芬香，莲叶与荷花在低头细语，沙沙，沙沙。
只可惜，我听不懂它们说的话。
妈妈，荷花真香真美啊！嗯。
妈妈摘一朵给你。
不，妈妈，摘下了它，它会死的。
让它长在塘里，一大片一大片的，它才高兴才会香才会更美丽。
好吧，女儿，让它们美美的长着。
来，我们把莲子莲叶都拿回家里蒸饭和做莲子羹。
好，妈妈，莲子羹最好吃了胎盘间充质干细胞的分离，原代与继代培养及鉴定刘亭2016.7.21目录前言 (4)1分离制备PMSC组织的选取 (5)2脐带，胎盘MSC的分离与纯化 (7)2.1胎盘组织的获取，存储与清洗 (7)2-2 脐带，胎盘MSC的分离及纯化方法 (8)3 原代培养和继代培养 (12)3-1培养基 (12)3-2培养密度 (13)3-3培养条件 (13)3-4换液 (13)3-5 传代培养 (14)3-6细胞形态与生长速度 (14)3-7 MSC的冻存与复苏： (14)4细胞表面抗原检测 (15)5生长曲线 (15)6细胞周期 (15)7分化潜能 (15)参考文献 (15)附件1不同实验室从脐带血，脐带和胎盘等各组织中分离MSC的方法 (17)脐带血 (17)脐带 (18)羊膜 (19)绒毛膜 (20)蜕膜层 (20)胎盘 (21)整体灌注法 (22)附件2 背景知识 (22)附件3 PMSC实验所需试剂 (23)前言干细胞（Stem cell，SC）是一种能够自我更新且未分化并可分化成两个或两个以上其它品系的细胞。
在一定的条件下，干细胞能够分化成为多种成熟细胞类型。
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胎盘间充质干细胞得分离,原代与继代培养及鉴定刘亭2016、7。
21目录前言 (2)1分离制备PMSC组织得选取 (3)2脐带,胎盘MSC得分离与纯化 (5)2、1胎盘组织得获取,存储与清洗 (5)2—2 脐带,胎盘MSC得分离及纯化方法 (6)3 原代培养与继代培养 (10)3-1培养基 (10)3-2培养密度 (11)3—3培养条件 (11)3—4换液 (11)3-5 传代培养 (12)3-6细胞形态与生长速度 (12)3-7 MSC得冻存与复苏: (12)4细胞表面抗原检测 (13)5生长曲线 (13)6细胞周期 (13)7分化潜能 (13)参考文献 (13)附件1不同实验室从脐带血,脐带与胎盘等各组织中分离MSC得方法 (15)脐带血 (15)脐带 (15)羊膜 (17)绒毛膜 (17)蜕膜层 (18)胎盘 (18)整体灌注法 (20)附件2 背景知识 (20)附件3 PMSC实验所需试剂 (20)前言干细胞(Stem cell,SC)就是一种能够自我更新且未分化并可分化成两个或两个以上其它品系得细胞。
在一定得条件下,干细胞能够分化成为多种成熟细胞类型。
按照来源与分化潜能不同,干细胞可分为胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)与成体干细胞(Adult stem cell,ASC)两类。
胚胎干细胞来源于早期得胚泡与胚胎内层得细胞群,并且具有向3个胚层细胞分化得能力。
但就是胚胎干细胞应用时产生得免疫排斥、体内实验中引发肿瘤生成以及所涉及得伦理问题等影响并制约了临床应用。
成体干细胞形成于原肠胚形成后得胎儿与成体组织,早期研究认为,成体干细胞主要分化为其来源组织得细胞类型。
然而,近几年来得很多研究表明,成体干细胞具有能够分化成为除来源以外得其她胚层组织得能力。
间充质干细胞(Mesenchymal stem cell, MSC)又称为基质干细胞,就是属于成体干细胞得一种,最早从骨髓中分离而来、MSC就是由早期中胚层发育而来得非造血成体干细胞,该细胞在体外可以贴壁生长,并呈现梭状。
胞质丰富,细胞核呈圆形,1-3个核仁、在适当得条件下可以大量扩增,并转化为间充质祖细胞,进而分化成包括三个胚层得各种组织细胞,如脂肪、骨、软骨、内皮细胞、成纤维细胞等。
MSC具有低得免疫原性、能向肿瘤迁移、具有免疫调节与造血支持等功能,而且易于外源基因导入表达,就是基因治疗中重要得载体细胞。
此外,一些研究学者还发现,MSC具有类似免疫抑制剂作用,可抑制T淋巴细胞在混合淋巴细胞中得免疫反应,并同时抑制T细胞得异基因增殖反应、所以,MSC在治疗组织缺损、器官退行性疾病、肿瘤及免疫疾病具有相当广泛得应用前景。
近年来MSC已逐步成为干细胞研究得热点(张慧娟等,2014)、目前所报道得间充质干细胞主要来源于骨髓,采用密度梯度离心法获得。
虽然分离方法简便,但供者取骨髓需要经历一个比较痛苦得手术,并在取材过程中及取材后会有很高得感染机会;由于人体骨髓中间充质干细胞得含量极其稀少,每105-106个单个核细胞中大约只有1个;而且随着年龄得增加,骨髓中间充质干细胞得数量、增殖与分化能力均显著下降,使其在研究与应用尤其就是临床应用中受到限制。
其她组织中,如动员得外周血、乳牙、脐带、脐血也存在间充质干细胞,然而,从这些组织中获得得细胞数量较为有限。
以上因素,都限制了间充质干细胞在组织工程与临床中得运用。
目前胎盘或脐带属于临床废弃物,容易获得,并且无污染,取材研究与应用基本无伦理学争议,研究表明胎盘或脐带含有丰富得MSC。
有研究表明PMSC比骨髓间充质干细胞更容易分离培养,细胞活性更好,还可诱导分化成脂肪,成骨等多种细胞。
并且这些胎盘源得间充质干细胞(placenta—derived mesenchymal stem cells,PMSCs)具有极低得免疫原性,大多数患者对于胎盘或脐带间充质干细胞具有天然得免疫耐受,因此,人胎盘间充质干细胞在研究相关疾病得动物模型中,即便就是人—动物模型间得异种间移植,由于存在天然得免疫耐受,对实验研究得结果影响甚小,这对于很多疾病研究得模型建立具有很好得作用。
目前MSC主要临床应用于抑制移植物抗宿主反应。
动物模型研究结果表明PMSC对子宫内膜损伤(刘芳,2013),大鼠肝组织损伤(宫黎明等,2011),APP+转基因鼠阿尔茨海默病(郭亚男等,2009)均有疗效,也可以用于构建组织工程皮肤(徐彪等,2013)。
所以,综合充分利用胎盘与脐带作为间充质干细胞新来源,优化分离纯化以及传代培养条件,加快细胞繁殖速度,降低培养成本以高效率获取大量得PMSC对于得各种疾病实验研究及医院各个科室得临床应用,都具有重要意义。
1分离制备PMSC组织得选取胎盘起源于胚胎发育期胚外中胚层,人足月娩出得胎盘由羊膜层、绒毛膜层与蜕膜层组成。
从脐带血(于海微等,2009;管英华等,2011),脐带(徐燕等,2009;韩之波等,2012;管英华等,2011;李艳琪等,2014;赵琳等,2016),整个胎盘(陆琰等,2009;沙文琼等,2010;刘洋等,2015;赖平等,2016),胎盘得羊膜层(宫黎明等,2011;徐彪等,2013;张慧娟等,2014;丛姗等,2015),绒毛膜层(洪艳等,2014;韩之波等,2012)与蜕膜层(韩之波等,2013)分离培养MSC均有报道。
目前大多数研究者取胎盘小叶(包括绒毛层与绒毛滋养层)进行分离(洪艳等,2014)、胎盘得细胞成分较复杂,既有滋养细胞,也有间质细胞、血管内皮细胞与Hofbauer细胞(沙文琼等,2010)。
由胎盘组织分离制备MSC时不可避免会有其它细胞得干扰(苗宗宁等,2009),其中以数量最多得血细胞干扰为主。
分离MSC选取组织时需要考虑哪个部位得组织可能含有最多得MSC,并且尽可能降低其它种类细胞得干扰,以获得纯度高,活力强得MSC。
对于人脐带血来源得MSC(human umbilical cord blood MSC, hUCB—MSC)得存在及能否稳定传代扩增,曾有一定争议,后来得实验结果证实脐带血中存在MSC,并表明脐带血来源MSC与骨髓来源MSC具有相同得生物学特性及功能特征(于海微等,2009)。
但就是脐带血中也存在多能成体干/祖细胞,分离间充质干细胞得过程以丢失造血干细胞为代价,而且个体差异大(徐燕等,2009)。
脐带包括一条静脉与两条动脉,周围就是Wharton's Jelly,外层由羊膜来源得上皮包裹,从发育角度来说,脐带就是干细胞形成及所经通路(管英华等,2011)、不同研究机构均从人脐带组织中分离到MSC(human umbilical cord MSC, hUC—MSC)。
已有研究表明人脐带得结缔组织就是间充质干细胞丰富得组织来源(徐燕等,2009),故制备hUC-MSC一般剥离脐带动静脉与外层上皮、管英华等(2011)比较了脐血与脐带两种来源得MSC原代培养过程,结果表明脐血中细胞成分复杂,原代培养多见成纤维样与大圆形破骨样两种形态得贴壁细胞,随着换液与传代破骨样细胞逐渐减少与消失,剩下形态较为单一得呈漩涡样得细胞集落; 脐带来源培养得贴壁细胞不会随换液丢失,且细胞形态以成纤维样细胞为主,种类单一。
hUC—MSCs比hUCB—MSCs原代培养得时间短,培养成功率明显增高。
羊膜就是胎膜最内层,胎盘包裹胎儿面得一层薄而半透明得膜,由胚胎羊膜囊壁发育而成,在胎盘面与绒毛膜相贴,由人羊膜间充质细胞与人羊膜上皮细胞组成,其表面没有神经、血管、肌肉与淋巴等组织。
人羊膜间充质细胞来源于原条期得胚胎中胚层,而人羊膜上皮细胞来源于胚胎外胚层、越来越多得研究已证实,人羊膜间充质细胞与人羊膜上皮细胞都具有干细胞得特征。
其中人胎盘羊膜来源得间充质干细胞(human amnion—derived mesenchymal cells, hAD—MSCs)不但表达成体干细胞特性中得间充质干细胞特性也表达部分胚胎干细胞特性,相关研究表明人羊膜间充质干细胞表达胚胎干细胞全能型标志转录因子基因OCT4、SOX2与NANOG(张惠娟等,2014)以及SSEA—3、SSEA—4、Oct—4等胚性标志(宫黎明等,2011),近年来发现hAD-MSCs在体外诱导培养条件下,可分化成来自3个胚层得所有细胞(宫黎明等,2011)。
有研究比较人羊膜间充质干细胞与骨髓间充质干细胞得增殖能力,发现培养人羊膜间充质干细胞得细胞数量在各时间点均明显高于骨髓间充质干细胞(徐彪等,2013)。
洪艳等(2014)分别从绒毛膜与绒毛滋养层分离并培养MSC,发现在分离过程中,从绒毛膜与绒毛滋养层得到得细胞量都很多,绒毛滋养层得细胞量甚至会超越绒毛膜得细胞量。
但就是在接种后培养时,由于绒毛滋养层血细胞较多,血细胞难以处理,影响间充质干细胞得贴壁,无法贴壁就无法继续生长,由此导致后期细胞生长慢,收获细胞少。
韩之波等(2013)得研究表明来自母体得底蜕膜组织也可以分离制备MSC。
苗宗宁等(2009)将胎盘组织分为3 组,分别就是中央带组即脐带附着处,边缘带组即距脐带附着点最远处与中间带组即两者之间中点处、分别全层连续切片,以抗CD166、抗CD44、抗CD29 分别做免疫荧光与免疫组织化学染色,显微镜下观察阳性细胞表达及分布分布区域,结果表明中间层得阳性细胞数量与表达水平强于绒毛板层与底板层;同为中间层,中央带较中间带及边缘带表达更强。
由此推测,在接近血管丰富得脐带附着部得胎盘中间层取材易于获得较丰富得PMSCs。
2脐带,胎盘MSC得分离与纯化2。
1胎盘组织得获取,存储与清洗母血检测HBV、HCV、HIV、CMV、EBV、梅毒均为阴性、产妇无传染性疾病,胎儿无先天性疾病。
临床足月正常剖宫产后胎盘,大小及质量在正常范围内,胎盘脐带附着点均在胎盘中央稍偏位。
经与产妇及其家属签署知情同意书,实验方案经并经医院伦理委员会批准。
在产房无菌条件下获取脐带,胎盘。
文献报道中取组织后有如下处理方法:立即浸入胎盘储存袋(加拿大LABPLAS公司得无菌采样袋,含99%低糖DMEM,1%双抗即青链霉素得组织保护液),在48 h内转移至实验室。
脐带静置于４℃冰箱12h, 观察保存脐带得PBS液, 若无浑浊说明无感染。
脐带采集后在6 h内进行处理,切除双侧带夹痕及淤血得部分。
无菌采集健康足月剖宫产羊膜,冰盒中2 h内运达实验室进入试验流程。
无菌采集健康足月剖宫产胎盘,并立即进入分离提取程序。
文献报道中组织块得用量及获得:胎盘组织约50 g3～5个胎盘小叶剪取胎儿侧得绒毛膜层组织10 mL眼科手术剪将组织剪碎(细碎小块;1mm3大小;呈肉糜状,以能用吸管吸取为标准;约3mm;5 mm3大小得碎块)组织绞碎分离机(近似肉糜)文献中得组织浸泡液/清洗液:＃生理盐水# D—Hank’s平衡液# 磷酸缓冲液(PBS)＃杜氏磷酸缓冲液(D—PBS)＃含肝素得PBS# 含有双抗生素得PBS (0。