组织化学技术培训教程

一、组织化学发展简史
组织化学是在组织学和化学的基础上发 展起来的，它的历史相当悠久。早在十九世 纪，人们把显微镜与化学技术结合起来，开 始观察组织中的化学反应。如法国植物学家 F.V.Raspail（1826）介绍了植物花和果受精过 程中的碘淀粉反应；M. Perls（1867）用普鲁 士蓝显示出铁；A.N.F. Millon(1844)叙述了蛋 白质反应； R. Fürnrohr（1850）论述了纤维 素的氯锌碘法；
1950年A. H. Coons等人提出了荧光抗体 法，从而把免疫学引入组织化学实验中 ，后来P. K. Nakane，S. Avrameas 和 L. A. Sternberger等人以辣根过氧化物 酶为标记物对酶进行观察，创立了酶标 抗体法，从而为组织化学开辟了新途径 。
随着分子生物学的发展，1969年人 们把分子杂交技术应用到组织切片和细 胞标本上，开始探索原位杂交技术，经 过30年不断应用、完善和发展，特别是 探针制备与标记物两大关键技术的突破 ，目前原位杂交技术已广泛应用于遗传 学、病毒学、神经内分泌学、病理学、 免疫学和发育生物学等各个领域，显示 出巨大的应用潜力。
组织化学技术教程
第一章 绪论
组织化学（histochemistry）是运 用物理学、化学、免疫学、分子生物学 等原理与技术，对组织与细胞的化学成 分、化学反应及其变化规律进行定性、 定位和定量研究的科学，是介于这些学 科之间的一门边缘科学。组织化学自出 现以来，已取得了长足的发展。这与相 关学科的发展是分不开的，其中细胞生 物学、生物化学以及分子生物学是组织 化学形成和发展的基础。
第二章 组织化学基本理论
组织化学是运用物理和化学的原理、技术研究 组织与细胞内的化学成分及其反应，对这些化学成 分进行定性、定位及其定量并研究其变化规律的科 学。它是介于组织学、细胞学与生物化学之间的一 门边缘科学。人们对生物组织的研究沿着两条主要 途径发展：一条途径是对显微镜下可分辨的越来越 细小的形态结构进行描述；另一条途径是着力分离 和描述具有重要生物学意义的物质，如核酸、蛋白 质、脂类及碳水化合物等。由此进一步了解生命活 动的本质规律。两条途径的研究结果互相处近，互 相补充，并在细胞、亚细胞乃至分子水平上统一起 来，就形成了现代组织化学。
3．反应物须有显色性和定量的可能性，即必须 是有色的沉淀或结晶，沉淀颗粒细小连续、 色深、不溶，并能保留在原位上。颜色深度 要与物质含量或酶的活性具有一定的比例关 系。
4．反应物要有稳定Байду номын сангаас和重复性，以利于观察研 究和验证。
5．反应物有灵敏性和特异性,以利于对比观察 。
6．反应产物有对照，否则难以判断其结果的可 靠性。
此间，金属盐法，硫化钴法，偶氮色素法 ，偶氮色素四唑盐法（tetrazolium salts method）以及磷酸化酶组织化学证明法等 相继问世。特别是H. Scheldon和D. Brandes等人把电镜与酶组织化学结合起来 ，以金属沉淀法观察了酸性磷酸酶和硷性 磷酸酶，奠定了电镜酶组织化学（ electron microscope enzyme histochemistry）基础。后来A. M. Seligman(1967)提出锇黑化法（ Osmification method）进一步阐述了电镜 组织化学的基本原理和反应过程。
二、组织化学技术的基本要求
1．尽可能地保持组织和细胞生前的形态结 构、化学成分和酶的活性。为此必须选择适 当的固定液和恰当的处理方法，如冷冻干燥 、冰冻替代、恒冷箱切片、振动切片等。 2．化学反应要求在细胞或组织内进行，须 有定位的准确性。为此必须控制反应的时间 和条件，使反应的产物不移位，不弥散。
Klebs(1868)和H. Stuve1872)用愈创木酯 酊同脓作用产生蓝色证明组织中有过氧化 物酶的存在；P.Ehrlich(1885) 发现了细 胞色素氧化酶；R. Heidenhain(1868) 指 出动质（ergastoplasm）—核糖核酸是一 种嗜硷性物质，可被醋酸沉淀；F. Miescher(1873)利用甲绿对核染色质的选 择性亲和力，分离出核染色质。
组织化学源于组织学、细胞学和生 物化学；但也有别于这些学科。组织化 学与组织学不同：组织学的着眼点是组 织与细胞的形态结构，组织学技术的要 求是尽可能保持组织和细胞的微细结构 。而组织化学的着眼点是组织与细胞内 化学成分的组成，组织化学技术的基础 是已知的化学反应。
组织化学与生物化学也有区别：虽然 二者都着眼于组织与细胞内的化学组成成分 及其含量，但生物化学研究常将组织破坏、 制成匀浆、然后进行化学成分的测定，其化 学反应主要在试管内进行故其定位性能差； 而组织化学技术则要求尽可能在原位显示化 学成分，故其定位、定位性能好。
自A. Bencke(1862)将苯氨染料用于 组织学领域，许多研究者在组织中应用 了染色反应，相继各种蛋白质被染色出 来。到19世纪末，胶原蛋白染色，脂肪 的苏丹Ⅲ染色以及组织中金属盐类的显 色等技术方法得到发展。但是由于化学 知识的贫乏和显微镜技术的停滞在一定 时期限制了组织化学的发展。
20世纪30年代，随着生物化学的发展和 电子显微镜技术的应用，组织化学迎来 了复兴时代。自从E. Takamatsu（高松 英雄）和G. Gomori 1939年同时证明了 硷性磷酸酶的组织化学方法，以后的30 年间，酶组织化学得到了飞速发展，高 松证明了磷酰胺酶、ATP酶；Gomori设计 了酸性磷酸酶、脂酶、酯酶等组织化学 证明法。
现代组织化学已经渗透和应用于生 命科学的许多学科，经过近几十年的发 展，产生了许多分支，如核酸与核蛋白 、蛋白质与氨基酸、脂类与脂蛋白、碳 水化合物与粘蛋白及粘多糖、无机物组 织化学、酶组织化学电镜组织化学、荧 光组织化学、免疫组织化学、同工酶组 织化学、定量组织化学、原位杂交组织 化学和放射自显影技术等。总之，现代 组织化学的概念已经远远超过了原有范 围，无论从理论、内容、技术手段、研 究范围都比过去更广泛、更深入。