临床微生物检测的基因同源性分析
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临床微生物检测的基因同源性分析
医院感染的流行病学研究是临床微生物学工作者的重要课题， 在医 院感染监测的研究中， 一个很重要的问题就是如何确定感染途径和传播途径， 以 采取有效预防和控制措施， 从而防止医院感染或者暴发流行， 因此对微生物鉴定 和菌株同源性分析提出了更高的要求。
目前，传统的细菌鉴定和同源性分析技术已不能很好地满足医院感 染诊断和流行病学调查的需要，从型、亚型、株，甚至分子水平上去认识细菌变 得愈来愈重要了。近年来分子生物学的理论和技术在细菌感染诊断中的渗透和广 泛应用，使得细菌鉴定、耐药基因的检测、分子流行病学调查变得更加准确、简 洁和快速。细菌DNA同源性分析技术如脉冲场凝胶电泳、聚合酶链反应、DNA探针杂交以及序列分析等方法是目前在分子水平上分析细菌的主要手 段，它在鉴定细菌感染的爆发、 确定院内交叉感染、 感染病原菌之间的基因同源 性等方面有着重要的作用， 本文将对常用基因同源性分析方法的机理和过程做简 要综述。
a.核糖体序列高度保守,用大肠杆菌rRNA制备的探针
能对所有的细菌进行分型。
缺点：
a.分辨力中等。
b.流行病学上无关的菌株，有可能有相同的核糖体型图谱。
c.需要用到放射性同位素，成本很高。
d.实验步骤繁琐。
五、限制性内切核酸酶片段长度多态性
（Restriction Fragment Length Polymorphism RFLP）的核酸杂交分析
1、原理：
限制性内切核酸酶（REA）在特异的核酸识别序列切割DNA，DNA被 消化后，所得到的限制性片段的数目和大小是由酶的识别位点和DNA的组成共 同决定的。 在传统的限制性内切核酸酶分析中， 人们用含有相对多的限制性位点 的内切核酸酶消化细菌的DNA，这样就会得到成百上千条长度在0.5-50Kb范围 内的DNA片段。恒定的电场琼脂糖电泳， 可以根据分子质量的大小将这些DNA片段分开，然后通过EB染色并在紫外灯下观察其图谱。同一种的不同分离菌株 的DNA序列的变异可造成限制性位点数目和分布的变化， 所以可以导致其REA图谱出现差异。
b.REA图谱分析复杂。
c.分辨力不高。
三、染色体DNA的脉冲场凝胶电泳
（Pulsed-Field Gel Eelectrophoresis PFGE）
1、原理：
用识别位点相对多的酶进行REA的一个重要的局限性，是分析那些大 量的、重叠的、 分辨力较差的限制性酶切片段构成的图谱相当困难。如果用限制
性位点相对少的酶消化细菌的基因组， 那么就可以得到数量相当少但更大的限制 性片段，这样在电泳中， 穿过琼脂糖的电场作周期性的改变， 就可以产生一个有5-20条清晰的分辨较好的图谱。
2、实验流程：a.染色体DNA抽提；b.限制性内切酶消化DNA（主要是Hi ndIII）；
c.0.7%琼脂糖电泳；d.EB
染色、凝胶成像。
3、实验方法的评价：
优势：
a.实验流程简单。
b.所有的菌株都可以这个方法来分型。
缺点：
a.REA图谱包括成百上千条带，一些条带可能不能检测到，一 些条带可能会重叠。
2、 实验流程：a.碱性磷酸酶脱去E.coli rRNA末端磷酸；b.[y32P]ATP末端标 记上述E.coli rRNA；c.抽提DN
A,限制性内切酶消化DNA(主要是Hi ndIII)；d.凝胶电泳、转膜；e.用标好的rRNA探针进行souther印记、放射性自显影。
3、实验方法的评价：
优势：
1、原理：
DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此凡是可 以引起酶切位点变异的突变如点突变（新 产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间 的长度发生变化）等均可导致RFLP
的产生。
2、 实验流程：a.裂解细菌，抽提基因组DNA、pvull酶消化；b.凝胶电泳、转膜;
2、 实验流程：a.染色体DNA抽提；b.限制性内切酶消化DNA（主要是XbaI）;
c.凝胶电泳（脉冲场；d.EB染色、凝胶成像；e.软件分析。
3、实验方法的评价：
优势：
a.PFGE方法的分辨力ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ可重复性都很高，
b.PFGE方法是肠球菌,肠杆菌和葡萄球菌基因分型的
金标准。
缺点：
a.必须使所有的酶和缓冲液都能浸透凝胶块， 准备合适的DNA样品需要延长培育时间。近来也有报道葡萄球菌和肠球菌可以用相当短的 时间来进行PFGE分析。
c.过氧化物酶标记过的IS110探
针杂交、X-ray胶片显影；d.软件分析。
3、实验方法的评价：
优势：
a.能对所有携带与探针同源基因的菌株进行分型。
b.实验的重复性很高。
缺点：
a.样品用量大、纯度要求高。
b.探针设计的难度大。
c.RFLP分析技术步骤繁琐，工作量大，成本较高。
六、随机扩增多态性
DNA(Random Amplified Polymorphic DNA RAPD-PCR)
3、实验方法的评价：
优势：
a.步骤比较简单，对实验仪器要求不高。
b.在评价那些从局限的时间和地点（如一个医院中的急性爆 发）分离出来的菌株非常有效。
缺点：
a.实验结果的重复性不好。
b.分辨力不高。
二、染色体DNA的限制性内切核酸酶分析（Restriction Endonuclease Assay REA）
一、质粒分型(Plasmid profile assay)：
1、原理：
质粒是可移动的染色体外元件，可以自发丢失或者被宿主稳定地获 得，因此流行病学上相关的分离菌株有可能表现出不同的质粒图谱。 把质粒提取 出来，进行常规的琼脂糖电泳分析， 就可以知道分离菌株携带质粒的大小和数目。
2、实验过程：a.质粒抽提；b.0.8%琼脂糖电泳；c.EB染色、凝胶成像。
b.需要昂贵的专业设备。
四、核糖体分型(Ribotyping)
1、原理：
核糖体操纵子包括编码16SrRNA和25SrRNA以及一种或多种RNA的核 苷酸序列。核糖体序列高度保守，针对 大肠杆菌rRNA制备的探针，或者是克隆的核糖体操纵子，可与许多细菌的染 色体核糖体操纵子杂交，细菌的基因 组中通常有多个核糖体基因， 分别存在于不同长度的酶切片段中， 因此核糖体分 型可以得到类似指纹的结果，因此 是可以分型的。
医院感染的流行病学研究是临床微生物学工作者的重要课题， 在医 院感染监测的研究中， 一个很重要的问题就是如何确定感染途径和传播途径， 以 采取有效预防和控制措施， 从而防止医院感染或者暴发流行， 因此对微生物鉴定 和菌株同源性分析提出了更高的要求。
目前，传统的细菌鉴定和同源性分析技术已不能很好地满足医院感 染诊断和流行病学调查的需要，从型、亚型、株，甚至分子水平上去认识细菌变 得愈来愈重要了。近年来分子生物学的理论和技术在细菌感染诊断中的渗透和广 泛应用，使得细菌鉴定、耐药基因的检测、分子流行病学调查变得更加准确、简 洁和快速。细菌DNA同源性分析技术如脉冲场凝胶电泳、聚合酶链反应、DNA探针杂交以及序列分析等方法是目前在分子水平上分析细菌的主要手 段，它在鉴定细菌感染的爆发、 确定院内交叉感染、 感染病原菌之间的基因同源 性等方面有着重要的作用， 本文将对常用基因同源性分析方法的机理和过程做简 要综述。
a.核糖体序列高度保守,用大肠杆菌rRNA制备的探针
能对所有的细菌进行分型。
缺点：
a.分辨力中等。
b.流行病学上无关的菌株，有可能有相同的核糖体型图谱。
c.需要用到放射性同位素，成本很高。
d.实验步骤繁琐。
五、限制性内切核酸酶片段长度多态性
（Restriction Fragment Length Polymorphism RFLP）的核酸杂交分析
1、原理：
限制性内切核酸酶（REA）在特异的核酸识别序列切割DNA，DNA被 消化后，所得到的限制性片段的数目和大小是由酶的识别位点和DNA的组成共 同决定的。 在传统的限制性内切核酸酶分析中， 人们用含有相对多的限制性位点 的内切核酸酶消化细菌的DNA，这样就会得到成百上千条长度在0.5-50Kb范围 内的DNA片段。恒定的电场琼脂糖电泳， 可以根据分子质量的大小将这些DNA片段分开，然后通过EB染色并在紫外灯下观察其图谱。同一种的不同分离菌株 的DNA序列的变异可造成限制性位点数目和分布的变化， 所以可以导致其REA图谱出现差异。
b.REA图谱分析复杂。
c.分辨力不高。
三、染色体DNA的脉冲场凝胶电泳
（Pulsed-Field Gel Eelectrophoresis PFGE）
1、原理：
用识别位点相对多的酶进行REA的一个重要的局限性，是分析那些大 量的、重叠的、 分辨力较差的限制性酶切片段构成的图谱相当困难。如果用限制
性位点相对少的酶消化细菌的基因组， 那么就可以得到数量相当少但更大的限制 性片段，这样在电泳中， 穿过琼脂糖的电场作周期性的改变， 就可以产生一个有5-20条清晰的分辨较好的图谱。
2、实验流程：a.染色体DNA抽提；b.限制性内切酶消化DNA（主要是Hi ndIII）；
c.0.7%琼脂糖电泳；d.EB
染色、凝胶成像。
3、实验方法的评价：
优势：
a.实验流程简单。
b.所有的菌株都可以这个方法来分型。
缺点：
a.REA图谱包括成百上千条带，一些条带可能不能检测到，一 些条带可能会重叠。
2、 实验流程：a.碱性磷酸酶脱去E.coli rRNA末端磷酸；b.[y32P]ATP末端标 记上述E.coli rRNA；c.抽提DN
A,限制性内切酶消化DNA(主要是Hi ndIII)；d.凝胶电泳、转膜；e.用标好的rRNA探针进行souther印记、放射性自显影。
3、实验方法的评价：
优势：
1、原理：
DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此凡是可 以引起酶切位点变异的突变如点突变（新 产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间 的长度发生变化）等均可导致RFLP
的产生。
2、 实验流程：a.裂解细菌，抽提基因组DNA、pvull酶消化；b.凝胶电泳、转膜;
2、 实验流程：a.染色体DNA抽提；b.限制性内切酶消化DNA（主要是XbaI）;
c.凝胶电泳（脉冲场；d.EB染色、凝胶成像；e.软件分析。
3、实验方法的评价：
优势：
a.PFGE方法的分辨力ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ可重复性都很高，
b.PFGE方法是肠球菌,肠杆菌和葡萄球菌基因分型的
金标准。
缺点：
a.必须使所有的酶和缓冲液都能浸透凝胶块， 准备合适的DNA样品需要延长培育时间。近来也有报道葡萄球菌和肠球菌可以用相当短的 时间来进行PFGE分析。
c.过氧化物酶标记过的IS110探
针杂交、X-ray胶片显影；d.软件分析。
3、实验方法的评价：
优势：
a.能对所有携带与探针同源基因的菌株进行分型。
b.实验的重复性很高。
缺点：
a.样品用量大、纯度要求高。
b.探针设计的难度大。
c.RFLP分析技术步骤繁琐，工作量大，成本较高。
六、随机扩增多态性
DNA(Random Amplified Polymorphic DNA RAPD-PCR)
3、实验方法的评价：
优势：
a.步骤比较简单，对实验仪器要求不高。
b.在评价那些从局限的时间和地点（如一个医院中的急性爆 发）分离出来的菌株非常有效。
缺点：
a.实验结果的重复性不好。
b.分辨力不高。
二、染色体DNA的限制性内切核酸酶分析（Restriction Endonuclease Assay REA）
一、质粒分型(Plasmid profile assay)：
1、原理：
质粒是可移动的染色体外元件，可以自发丢失或者被宿主稳定地获 得，因此流行病学上相关的分离菌株有可能表现出不同的质粒图谱。 把质粒提取 出来，进行常规的琼脂糖电泳分析， 就可以知道分离菌株携带质粒的大小和数目。
2、实验过程：a.质粒抽提；b.0.8%琼脂糖电泳；c.EB染色、凝胶成像。
b.需要昂贵的专业设备。
四、核糖体分型(Ribotyping)
1、原理：
核糖体操纵子包括编码16SrRNA和25SrRNA以及一种或多种RNA的核 苷酸序列。核糖体序列高度保守，针对 大肠杆菌rRNA制备的探针，或者是克隆的核糖体操纵子，可与许多细菌的染 色体核糖体操纵子杂交，细菌的基因 组中通常有多个核糖体基因， 分别存在于不同长度的酶切片段中， 因此核糖体分 型可以得到类似指纹的结果，因此 是可以分型的。