转录组高通量测序转录组数据分析差异表达基因分析 PPT
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5
几种转录组研究所用技术的比较
转录组所用技术 Microarray SAGE和MPSS RNA-seq
原理
信号 分辨率 分辨率 背景 成本 Βιβλιοθήκη Baidu始RNA用量
寡核苷酸杂交 Sanger测序 高通量测序
荧光信号 数个-上百个 高 高 高 多
数字化信号 单碱基 低 低 高 多
数字化信号 单碱基 高 低 相对较低 少
• 1.转录组 • 2.高通量测序 • 3.转录组数据分析 • 4.差异表达基因分析 • 5.趋势性上调和下调基因分析 • 6.基因集功能富集分析
1
1.1transcriptome
➢ 转录组（transcriptome）是指特定生物体在某种状态或某一生 理条件下，细胞内所有基因转录产物的总和，包括信使RNA 、核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA；狭义上指所有 mRNA的集合。
4
1.3转录组研究的技术
主要包括如下三种：
➢1）基于杂交技术的微阵列技术； ➢2）基于Sanger测序法的SAGE (serial analysis of gene expression) 和 MPSS(multiple parallel signature sequencing)； ➢3）基于新一代高通量测序技术的转录组测序。
1.4转录组测序
➢ （1）RNA聚合酶I和III负责种类稀少、功能重要的看家非编码 RNA基因的转录，包括rRNA，tRNA，snoRNA，snRNA等。由这 两类RNA聚合酶转录的非编码RNA属于看家RNA，在各种生理和 病理状态下都被高水平转录，转录产物占细胞内RNA总量的95% 以上，不是生命科学研究前沿领域的主要关注对象
➢ 缺点是需要大量的mRNA
8
大家有疑问的，可以询问和交流
可以互相讨论下，但要小声点
9
MPSS(多重性平行定序)：
➢ 对于功能基因组研究非常有效，能在短时间内捕获细胞或组织内 全部基因的表达特征；对于鉴定致病基因并揭示该基因在疾病中 的作用机制等发挥了重要作用。
➢ 可以侦测到极为罕见的基因表现
10
6
➢ DNA芯片技术：只适用于检测已知序列，却无法捕获新的mRNA。杂交 技术灵敏度有限，对于低丰度的mRNA，微阵列技术难以检测，也无法 捕获到目的基因mRNA表达水平的微小变化。
7
SAGE(基因表达系列分析)：
➢ 可以全面了解特定组织或细胞类型中基因群体表达状态，它的显 著特点是能够大量获取基因组范围基因表达的类别与丰度，该技 术成功地应用于特异组织或细胞的转录组研究和mRNA群体间差 异表达基因鉴定。
17
2.3三种常见的测序平台
18
Illumina Genome Analyzer
• 专利核心技术“DNA 簇”和“可逆性末端终结”，达成自动化样 本制备及基因组数百万个碱基大规模平行测序。具有高准确性， 高通量，高灵敏度，和低运行成本等突出优势，可以同时完成传 统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学（基因表达及 调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究。
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转录组高通量测序的优势？
• 高通量、更精确的数字信号、无需已知序列、能够在单核苷酸水 平对任意物种的整体转录活动进行检测，在分析转录本的结构和 表达水平的同时，还能够发现未知转录本和稀有转录本，精确的 识别可变剪接位点以及cSNP（编码序列单核苷酸多态性），提供 最全面的转录组信息。
13
转录组前沿研究简介
➢ 从RNA层次研究基因表达的情况，即为转录组学（ transcriptomics），是研究细胞表型和功能的一个重要手段。
2
1.2转录组研究的重要性
➢ 转录组是连接基因组遗传信息与生物功能的蛋白质组的纽带，转 录水平的调控是最重要也是目前研究最广泛的生物体调控方式。
➢ 转录组的研究比基因组的研究能给出更高效的有用信息。 ➢ 与基因组不同，转录组更有时间空间性。除了异常的mRNA降解
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(2)RNA 聚合酶II负责蛋白质编码基因和调控非编码RNA的转录，在 真核生物的不同生理和病理状态下表达量被严格调控，一直吸引着 各生命科学研究领域的重点关注，无比幸运的是，由RNA聚合酶II 生成的转录的末端均含有3’端多聚腺苷尾【3’poly（A）tail】。 转录组测序一般是对用多聚胸腺嘧啶（oligo-dT）进行亲和纯化的 RNA聚合酶II转录生成的成熟mRNA和ncRNA进行高通量测序。这 样的数据有效排除了看家非编码RNA的干扰，可以通过一次测序获 得一种细胞内几乎所有重要基因的表达参数。
• 单细胞转录组分析 • 转录组测序确定RNA结构 • 转录组测序在疾病中的应用
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2.高通量测序
➢ 测序技术的发展 ➢ 高通量测序技术（High-throughput sequencing）又称“第二代”测
序技术(“Next-generation” sequencing technology)，高通量测序 使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能 ，所以又被称为深度测序(deep sequencing)
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2.1高通量测序优势？
➢ 价格比第一代大幅度降低 ➢ 可扩展的高通量 ➢ 需要样品量少 ➢ 新颖的测序化学技术 ➢ 单个或配对末端支持
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2.2高通量测序技术的应用
➢ 重头测序(de novo sequencing) ➢ 重测序(resequencing) ➢ 全转录组测序(whole transcriptome resequencing) ➢ 小分子RNA测序(small RNA sequencing) ➢ 染色质免疫共沉淀测序(ChIP-seq)
Genome Analyzer IIx测序技术原理 1）文库制备：将基因组DNA打成几百个碱基（或更短）的小片段，
并在两个末端加上接头（adapter）。 2） 桥式PCR产生DNA簇
现象（如转录衰减）以外，转录组反映的是特定条件下活跃表达 的基因
3
➢ 转录组的研究可以提供什么条件下什么基因表达什么信息，从而 推断相应未知基因的功能，揭示特定调节基因的作用机制
➢ 对转录本的定量可以了解特定基因的活性和表达量，用于疾病的 诊断和治疗
➢ 通过对转录组的研究，也让个性化医疗的目标，从共性转移到个 性，成为可能
几种转录组研究所用技术的比较
转录组所用技术 Microarray SAGE和MPSS RNA-seq
原理
信号 分辨率 分辨率 背景 成本 Βιβλιοθήκη Baidu始RNA用量
寡核苷酸杂交 Sanger测序 高通量测序
荧光信号 数个-上百个 高 高 高 多
数字化信号 单碱基 低 低 高 多
数字化信号 单碱基 高 低 相对较低 少
• 1.转录组 • 2.高通量测序 • 3.转录组数据分析 • 4.差异表达基因分析 • 5.趋势性上调和下调基因分析 • 6.基因集功能富集分析
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1.1transcriptome
➢ 转录组（transcriptome）是指特定生物体在某种状态或某一生 理条件下，细胞内所有基因转录产物的总和，包括信使RNA 、核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA；狭义上指所有 mRNA的集合。
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1.3转录组研究的技术
主要包括如下三种：
➢1）基于杂交技术的微阵列技术； ➢2）基于Sanger测序法的SAGE (serial analysis of gene expression) 和 MPSS(multiple parallel signature sequencing)； ➢3）基于新一代高通量测序技术的转录组测序。
1.4转录组测序
➢ （1）RNA聚合酶I和III负责种类稀少、功能重要的看家非编码 RNA基因的转录，包括rRNA，tRNA，snoRNA，snRNA等。由这 两类RNA聚合酶转录的非编码RNA属于看家RNA，在各种生理和 病理状态下都被高水平转录，转录产物占细胞内RNA总量的95% 以上，不是生命科学研究前沿领域的主要关注对象
➢ 缺点是需要大量的mRNA
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大家有疑问的，可以询问和交流
可以互相讨论下，但要小声点
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MPSS(多重性平行定序)：
➢ 对于功能基因组研究非常有效，能在短时间内捕获细胞或组织内 全部基因的表达特征；对于鉴定致病基因并揭示该基因在疾病中 的作用机制等发挥了重要作用。
➢ 可以侦测到极为罕见的基因表现
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➢ DNA芯片技术：只适用于检测已知序列，却无法捕获新的mRNA。杂交 技术灵敏度有限，对于低丰度的mRNA，微阵列技术难以检测，也无法 捕获到目的基因mRNA表达水平的微小变化。
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SAGE(基因表达系列分析)：
➢ 可以全面了解特定组织或细胞类型中基因群体表达状态，它的显 著特点是能够大量获取基因组范围基因表达的类别与丰度，该技 术成功地应用于特异组织或细胞的转录组研究和mRNA群体间差 异表达基因鉴定。
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2.3三种常见的测序平台
18
Illumina Genome Analyzer
• 专利核心技术“DNA 簇”和“可逆性末端终结”，达成自动化样 本制备及基因组数百万个碱基大规模平行测序。具有高准确性， 高通量，高灵敏度，和低运行成本等突出优势，可以同时完成传 统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学（基因表达及 调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究。
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转录组高通量测序的优势？
• 高通量、更精确的数字信号、无需已知序列、能够在单核苷酸水 平对任意物种的整体转录活动进行检测，在分析转录本的结构和 表达水平的同时，还能够发现未知转录本和稀有转录本，精确的 识别可变剪接位点以及cSNP（编码序列单核苷酸多态性），提供 最全面的转录组信息。
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转录组前沿研究简介
➢ 从RNA层次研究基因表达的情况，即为转录组学（ transcriptomics），是研究细胞表型和功能的一个重要手段。
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1.2转录组研究的重要性
➢ 转录组是连接基因组遗传信息与生物功能的蛋白质组的纽带，转 录水平的调控是最重要也是目前研究最广泛的生物体调控方式。
➢ 转录组的研究比基因组的研究能给出更高效的有用信息。 ➢ 与基因组不同，转录组更有时间空间性。除了异常的mRNA降解
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(2)RNA 聚合酶II负责蛋白质编码基因和调控非编码RNA的转录，在 真核生物的不同生理和病理状态下表达量被严格调控，一直吸引着 各生命科学研究领域的重点关注，无比幸运的是，由RNA聚合酶II 生成的转录的末端均含有3’端多聚腺苷尾【3’poly（A）tail】。 转录组测序一般是对用多聚胸腺嘧啶（oligo-dT）进行亲和纯化的 RNA聚合酶II转录生成的成熟mRNA和ncRNA进行高通量测序。这 样的数据有效排除了看家非编码RNA的干扰，可以通过一次测序获 得一种细胞内几乎所有重要基因的表达参数。
• 单细胞转录组分析 • 转录组测序确定RNA结构 • 转录组测序在疾病中的应用
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2.高通量测序
➢ 测序技术的发展 ➢ 高通量测序技术（High-throughput sequencing）又称“第二代”测
序技术(“Next-generation” sequencing technology)，高通量测序 使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能 ，所以又被称为深度测序(deep sequencing)
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2.1高通量测序优势？
➢ 价格比第一代大幅度降低 ➢ 可扩展的高通量 ➢ 需要样品量少 ➢ 新颖的测序化学技术 ➢ 单个或配对末端支持
16
2.2高通量测序技术的应用
➢ 重头测序(de novo sequencing) ➢ 重测序(resequencing) ➢ 全转录组测序(whole transcriptome resequencing) ➢ 小分子RNA测序(small RNA sequencing) ➢ 染色质免疫共沉淀测序(ChIP-seq)
Genome Analyzer IIx测序技术原理 1）文库制备：将基因组DNA打成几百个碱基（或更短）的小片段，
并在两个末端加上接头（adapter）。 2） 桥式PCR产生DNA簇
现象（如转录衰减）以外，转录组反映的是特定条件下活跃表达 的基因
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➢ 转录组的研究可以提供什么条件下什么基因表达什么信息，从而 推断相应未知基因的功能，揭示特定调节基因的作用机制
➢ 对转录本的定量可以了解特定基因的活性和表达量，用于疾病的 诊断和治疗
➢ 通过对转录组的研究，也让个性化医疗的目标，从共性转移到个 性，成为可能