基因工程 整理

1.选择基因是指可使被转化的细胞获得其亲本细胞所不具备的新的遗传特性，从而使得人们能够使用特定的选择性培养基，将转化的新细胞从其亲本细胞群体中选择出来的一类特殊的基因。报告基因特指其编码产物能被快速检测，常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞、器官或组织的一类特殊的基因。

2.反式作用因子(trans-acting factor)：能直接或间接地识别或结合在靶核苷酸序列上，参与调控靶基因转录效率的蛋白质总称反式作用因子。其编码基因与其识别或结合的靶核苷酸序列不在同一个DNA分子上。顺式作用元件(cis-acting element):是指存在于基因旁侧序列中影响自身基因表达活性的DNA序列。如转录启动子和增强子等。它作为一种原位(in situ)顺序，其活性只影响与其自身处在同一个DNA分子上的基因。

3.组成性表达看家基因较少受环境因素影响，而是在个体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。这类基因表达视为基本的或组成性基因表达。

4.基因漂流指转基因生物中的目标基因，在生物的个体、种群甚至是物种间自发转移的过程。

5.穿梭质粒：由人工构建的具有两种不同复制起始点和选择记号，可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。考斯质粒是一类人工构建的含有λ-DNAcos序列和质粒复制子的特殊类型的载体

6.粘性末端：实际上是在限制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新接合起来。7 同裂酶：来源于不同物种但能识别相同DNA序列的限制性内切酶。同尾酶：来源和识别的靶序列均不相同，但都能形成相同的粘性末端的限制性内切酶。8.Star 活性Star activity：在极端非标准条件下，内切酶识别和切割序列的特异性降低，从原识别序列以外的其它位点切割DNA分子的现象。9..基因芯片：又称DNA芯片，是指将大量基因探针分子如寡核苷酸、基因组DNA或互补DNA固定于标记的样品进行杂交，通过杂交信号的强弱判断靶分子的数量，充分利用了分子杂交、分子克隆和聚合酶链式反应三大分子生物学技术。10.α-互补：虽然宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种互补现象叫α互补(α-complement)。11.鸟枪法：利用限制性内切酶消化供体细胞的全基因组DNA成小片段，在DAN连接酶的作用下，将其连接到载体上并转化受体细胞进行随机克隆的方法。12.DNA文库：将特定生物个体的全部DNA片段连接入载体DNA分子上，并导入受体细菌或细胞中，经扩增产生的包含该生物全部基因组序列的克隆群体。（人工构建）13.RACE：是通过简并PCR产物、差异显示片段或已知的序列表达标签(EST),利用通用引物和基因特异引物进行PCR反应,获得全长cDNA的3'端和5'端序列的有效方法。14.酵母单杂交也叫做相互作用陷阱(interaction trap)，是一种在酵母细胞中研究蛋白质间相互作用的分子生物学方法，同时可以通过筛选DNA文库获得与诱饵蛋白互作的靶蛋白编码序列的有效工具。

15.简并引物: 是指编码氨基酸的所有不同碱基可能性的不同寡核苷酸序列的混合物。16.包涵体在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露的水不溶性结构17.融合蛋白：将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架所表达出的蛋白质。18.PEST序列N末端含有Pro、Glu、Ser、Thr的真核生物蛋白质，在真核和原核细胞中的半衰期通常很短,尤其Pro-Glu-Ser-Thr序列，是胞内蛋白酶的超敏感区，称为PEST序列19.Ti质粒是在根瘤土壤杆菌细胞中存在的一种染色体外自主复制的可诱导根瘤形成的环形双链DNA分子。20.T-DNA整合在植物细胞细胞核基因组上的、决定植物形成冠瘿瘤的DNA区段；21.卸甲载体将Ti质粒上T-DNA中的致瘤基因全部去掉，使其丧失对植物的致瘤性,仅保留其两侧边界和准确转移所必需的25个碱基序列，故称这种载体为卸甲载体

1.简述基因研究发展的三个阶段及特点(1)基因的染色体遗传学阶段(细胞遗传学): 20世纪50年代之前，主要从细胞染色体水平上进行研究。(2)基因的分子生物学阶段(分子遗传学): 20世纪50年代之后，主要从DNA水平上进行研究。(3)基因工程学阶段(分子生物技术): 20世纪70年代，重组DNA技术的建立，使基因的研究进入了反向生物学研究阶段。

2. DNA复性在基因工程中的应用有哪些？显示不同生物体间的遗传相关性；检测特定的DNA；考查某些序列在特定生物体DNA中的拷贝数；确定特定碱基序列在DNA中的位置；分离克隆基因。

3.简述真核基因的成熟mRNA 的组成5'端的帽子结构,5'-UTR 编码区,3'-UTR,3'端poly(A)尾巴

4. 影响限制性核酸内切酶酶活性的因素1酶的纯度2DNA的纯度3DNA的甲基化程度4酶切消化反应的温度5DNA的分子结构6消化反应的缓冲液系统

5. T4连接酶、聚合酶I、Klenow片段的基本性质及主要用途。T4连接酶:基本性质：1修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键；2修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键；3连接多个平头双链DNA分子；用途：1一条DNA链的3’末端具有一个游离的羟基(-OH), 而在另一条DNA链的5’末端具有一个磷酸基团(-P)；2、连接反应中需要ATP或NAD+和Mg2+作为辅助因子和激活因子、3、被连接的两条DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部

分，DNA连接酶并不能连接两条单链DNA分子或环化的单链DNA分子。4、实际上，DNA连接酶只能连接并封闭双螺旋DNA分子所出现的缺口(Nick)，即封闭双链DNA上两个相邻核苷酸之间所断裂的磷酸二酯键。聚合酶I 基本性质：5’—3’的聚合酶活性；5’—3’的核酸外切酶活性；3’—5’的核酸外切酶活性用途：缺口平移法制备核酸分子杂交探针；cDNA第二链的置换合成；3’突出末端的DNA分子的末端标记；Klenow片段基本性质：5’—3’的聚合酶活性；3’—5’的核酸外切酶活性；5’—3’的核酸外切酶活性失去；主要用途：补平由核酸内切酶产生的5‘粘性末端；标记DNA片段的末端；cDNA克隆中第二链的合成；DNA序列测定

6. 核酸酶及核酸修饰酶的种类及基本性质核酸酶1、单链核酸外切酶：核酸外切酶VII(ExoVII)：大肠杆菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+2、双链核酸外切酶：核酸外切酶III(ExoIII)：大肠杆菌的核酸外切酶III特异性地从3‘端外酶切3、双链核酸外切酶：l核酸外切酶(lExo)：l核酸外切酶特异性地从5‘端外酶切4、单链核酸内切酶：S1核酸酶：内切单链DNA或RNA；内切带缺口或缺刻的双链DNA或RNA 5、单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶核酸修饰酶1、末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）：不需要模板的DNA聚合酶，在3′端随机掺入dNTPs；可在平端添加同聚尾：效率较低；可在5′突出的3′OH端添加同聚尾：效率较低2、碱性磷酸单酯酶3、T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）：T4-PNP的基本特性：在DNA、RNA的5‘-OH上加磷,用于探针的末端同位素标记

7. 简述质粒的基本特性。（1）自主复制（2）不相容性（3）转移性（4）编码性状

8. 简述考斯质粒的特点。（1）能像λ-DNA那样进行体外包装,并高效转染受体细胞；（2）能像质粒那样在受体细胞中自主复制；（3）重组操作简便,筛选容易；（4）装载量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范围；（5）不能体内包装,不裂解受体细胞。

9. 试阐述λ-DNA载体上常用的选择标记及原理。1lacZ蓝白斑选择标记：原理：lacZ基因编码b-半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal 生成蓝色化合物；当外源基因插入到lacZ基因中，基因失活，不能合成蓝色化合物；而空载体λ-DNA则产生蓝色透明斑。2、选择标记cI：透明斑；原理：cI 基因编码一种阻止λ-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物，含有完整标记基因的λ-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源DNA插入到标记基因中，基因失活，λ-重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑；援例：野生型的λ噬菌体不能在P2噬菌体溶源性的细菌中繁殖(Spi+)，这种生长抑制表型受λ-DNA上的red和gam两个基因控制。若将外源DNA取代red和gam，重组噬菌体便拥有Spi-表型，能在P2噬菌体溶源性的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明斑。

10.简述提高重组率的方法有哪些？1、提高外源DNA片段与载体的分子比：5:1-10:1 2、载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团3、加装同聚尾末端

11. 简述常用的转化子筛选方法。1、抗药性筛选法：将外源DNA片段插在EcoRI位点：非重组子呈Apr、Tcr；重组子呈Apr、Tcr。将外源DNA片段插在BamHI位点：非重组子呈Apr、Tcr；非重组子呈Apr、Tcr。2、营养缺陷型筛选法：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子。3、显色筛选法：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ’基因（蓝色反应）、链霉菌质粒pIJ702携带的melC基因（黑色反应）等。

12. 鸟枪法克隆目的基因的有哪些局限性？1、工作量较大，需要了解目的基因的背景知识

2、不能获得的最小长度的目的基因

3、不能除去真核生物目的基因的内含子结构

13. 简述cDNA法克隆目的基因的局限性。1、并非所有的mRNA分子都具有polyA结构

2、细菌或原核生物的mRNA半衰期很短

3、mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难

4、仅限于克隆蛋白质编码基因

14. 基因文库的质量标准是什么？1、重组克隆的总数不宜过大以减轻筛选工作的压力；

2、载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆；

3、克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序；

4、克隆片段易于从载体分子上完整卸下；

5、重组克隆能稳定保存、扩增、筛选；

6、具有较高的完备性。

15. 何为图位克隆？请简述其操作的基本程序。图位克隆是在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，使用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库，分离克隆目的基因的一种方法。基本程序：1、先将目的基因定位到染色体上，在目的基因的两侧确定与目的基因紧密连锁和共分离的分子标记；2、利用这些分子标记作探针从基因组文库中筛选出相应的克隆；3、通过染色体步移等技术构建复盖目的基因的克隆重叠群，从重叠群中将候选基因分离出来；4、最后再通过遗传互补试验鉴定出目的基因。