MDA测定
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2
硫代巴比妥酸
丙二醛
3,5,5´-三甲基恶唑2,4-二酮 （三甲川）
仪器设备
1. 2. 3. 4. 5. 6. 分光光度计； 分光光度计； 研钵； 研钵； 剪刀； 剪刀； 恒温水浴； 恒温水浴； 试管： 试管：20 mL×4 × 离心机。 离心机。
试剂
1. 5 %三氯醋酸； 三氯醋酸； 三氯醋酸 2. 0.5 %硫代巴比妥酸（用5 %三氯醋酸 硫代巴比Fra Baidu bibliotek酸（ 硫代巴比妥酸 三氯醋酸 溶解定容）； 溶解定容）； 3. 0.05 mol · L–1磷酸缓冲液， 磷酸缓冲液， 磷酸缓冲液 pH 7.8。 。
原理
丙二醛在高温及酸性环境下可与2 丙二醛在高温及酸性环境下可与2-硫代巴比妥酸 TBA）反应产生红棕色的产物3,5,5´ （TBA）反应产生红棕色的产物3,5,5´-三甲基恶 唑2,4-二酮（三甲川），该物质在532 nm处有一 2,4-二酮（三甲川），该物质在532 nm处有一 ），该物质在 吸收高峰，并且在660nm处有较小光吸收 处有较小光吸收。 吸收高峰，并且在660nm处有较小光吸收。根据 nm的消光值可计算出溶液中丙二醛的含量 的消光值可计算出溶液中丙二醛的含量。 其532 nm的消光值可计算出溶液中丙二醛的含量。 可溶性糖对此反应有干扰， nm处有一 醛、可溶性糖对此反应有干扰，在450 nm处有一 吸收峰，可用双组分分光光度法加以排除。 吸收峰，可用双组分分光光度法加以排除。
植物生理学实验课件
丙二醛（MDA）含量的测定 丙二醛（MDA）
丙二醛是膜脂过氧化最重要的产 物之一。 物之一。植物在逆境下遭受伤害与活 性氧积累诱发的膜质过氧化作用密切 相关。 相关。
原理
• 植物在逆境下遭受伤害（或衰老）与活性 植物在逆境下遭受伤害（或衰老） 氧积累诱发的膜脂过氧化作用密切相关， 氧积累诱发的膜脂过氧化作用密切相关， 膜脂过氧化的产物有二烯轭合物、 膜脂过氧化的产物有二烯轭合物、脂类过 氧化物、丙二醛、乙烷等。 氧化物、丙二醛、乙烷等。其中丙二醛 （MDA：Malondialdehyde）是膜脂 ： ） 过氧化最重要的产物之一， 过氧化最重要的产物之一，因此可通过测 了解膜脂过氧化的程度， 定MDA了解膜脂过氧化的程度，以间接测 了解膜脂过氧化的程度 定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。 定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。
材料
• 正常生长的以及经逆境处理的小麦、玉米 正常生长的以及经逆境处理的小麦、 或其他植物的叶片。 或其他植物的叶片。
方法与步骤
1．取小麦植株上不同叶位的叶片3~5片，洗净擦干，剪成 ．取小麦植株上不同叶位的叶片 片 洗净擦干， 0.5 cm长的小段，混匀。 长的小段， 长的小段 混匀。 2．称取叶片切段 ．称取叶片切段0.3 g，放入冰浴的研钵中，加入少许石 ，放入冰浴的研钵中， 英砂和2 磷酸缓冲液， 英砂和 mL 0.05 mol · L-1磷酸缓冲液，研磨成匀浆。 磷酸缓冲液 研磨成匀浆。 将匀浆转移到试管中，再用3 将匀浆转移到试管中，再用 mL 0.05 mol · L-1磷酸 磷酸 缓冲液，分三次冲洗研钵，合并提取液。 缓冲液，分三次冲洗研钵，合并提取液。 3．在提取液中加入 mL 0.5 %硫代巴比妥酸溶液，摇匀。 硫代巴比妥酸溶液， ．在提取液中加入5 硫代巴比妥酸溶液 摇匀。 4．将试管放入沸水浴中煮沸 ，（自试管内溶液中 ．将试管放入沸水浴中煮沸10 min，（自试管内溶液中 ，（ 出现小气泡开始计时）。到时间后， ）。到时间后 出现小气泡开始计时）。到时间后，立即将试管取出并放 入冷水浴中。 入冷水浴中。 5．待试管内溶液冷却后，3000×g离心 离心15 min，取上清 ．待试管内溶液冷却后， × 离心 ， 液并量其体积。以0.5 %硫代巴比妥酸溶液为空白测 液并量其体积。 硫代巴比妥酸溶液为空白测 532 nm、600 nm和450 nm处的消光值。 处的消光值。 、 和 处的消光值
思考题
• 不同植物在同一逆境下，丙二醛含量变化 不同植物在同一逆境下， 不同，说明了什么？ 不同，说明了什么？
注意事项
• 1．可溶性糖与TBA显色反应的产物在 ．可溶性糖与 显色反应的产物在532 nm 显色反应的产物在 也有吸收（最大吸收在450 nm），当植物处于 ），当植物处于 也有吸收（最大吸收在 ）， 干旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高， 干旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高， 必要时要排除可溶性糖的干扰。 必要时要排除可溶性糖的干扰。 • 2．低浓度的铁离子能增强 ．低浓度的铁离子能增强MDA与TBA的显色反 与 的显色反 应，当植物组织中铁离子浓度过低时应补充 Fe3+（最终浓度为 （最终浓度为0.5 nmol · L-1） • 3．如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间， ．如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间， 最好使用低温离心机离心。 最好使用低温离心机离心。
计算结果
V MDA( mmol⋅ g FW) = 6.452×( D532 −D600 ) −0.559×D450 × t V ×W s
-1
• 式中，Vt：提取液总体积（mL）； 式中， 提取液总体积（ ）； • Vs：测定用提取液体积（ml）； 测定用提取液体积（ ）； • FW：样品鲜重（g）。 ：样品鲜重（ ）。
硫代巴比妥酸
丙二醛
3,5,5´-三甲基恶唑2,4-二酮 （三甲川）
仪器设备
1. 2. 3. 4. 5. 6. 分光光度计； 分光光度计； 研钵； 研钵； 剪刀； 剪刀； 恒温水浴； 恒温水浴； 试管： 试管：20 mL×4 × 离心机。 离心机。
试剂
1. 5 %三氯醋酸； 三氯醋酸； 三氯醋酸 2. 0.5 %硫代巴比妥酸（用5 %三氯醋酸 硫代巴比Fra Baidu bibliotek酸（ 硫代巴比妥酸 三氯醋酸 溶解定容）； 溶解定容）； 3. 0.05 mol · L–1磷酸缓冲液， 磷酸缓冲液， 磷酸缓冲液 pH 7.8。 。
原理
丙二醛在高温及酸性环境下可与2 丙二醛在高温及酸性环境下可与2-硫代巴比妥酸 TBA）反应产生红棕色的产物3,5,5´ （TBA）反应产生红棕色的产物3,5,5´-三甲基恶 唑2,4-二酮（三甲川），该物质在532 nm处有一 2,4-二酮（三甲川），该物质在532 nm处有一 ），该物质在 吸收高峰，并且在660nm处有较小光吸收 处有较小光吸收。 吸收高峰，并且在660nm处有较小光吸收。根据 nm的消光值可计算出溶液中丙二醛的含量 的消光值可计算出溶液中丙二醛的含量。 其532 nm的消光值可计算出溶液中丙二醛的含量。 可溶性糖对此反应有干扰， nm处有一 醛、可溶性糖对此反应有干扰，在450 nm处有一 吸收峰，可用双组分分光光度法加以排除。 吸收峰，可用双组分分光光度法加以排除。
植物生理学实验课件
丙二醛（MDA）含量的测定 丙二醛（MDA）
丙二醛是膜脂过氧化最重要的产 物之一。 物之一。植物在逆境下遭受伤害与活 性氧积累诱发的膜质过氧化作用密切 相关。 相关。
原理
• 植物在逆境下遭受伤害（或衰老）与活性 植物在逆境下遭受伤害（或衰老） 氧积累诱发的膜脂过氧化作用密切相关， 氧积累诱发的膜脂过氧化作用密切相关， 膜脂过氧化的产物有二烯轭合物、 膜脂过氧化的产物有二烯轭合物、脂类过 氧化物、丙二醛、乙烷等。 氧化物、丙二醛、乙烷等。其中丙二醛 （MDA：Malondialdehyde）是膜脂 ： ） 过氧化最重要的产物之一， 过氧化最重要的产物之一，因此可通过测 了解膜脂过氧化的程度， 定MDA了解膜脂过氧化的程度，以间接测 了解膜脂过氧化的程度 定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。 定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。
材料
• 正常生长的以及经逆境处理的小麦、玉米 正常生长的以及经逆境处理的小麦、 或其他植物的叶片。 或其他植物的叶片。
方法与步骤
1．取小麦植株上不同叶位的叶片3~5片，洗净擦干，剪成 ．取小麦植株上不同叶位的叶片 片 洗净擦干， 0.5 cm长的小段，混匀。 长的小段， 长的小段 混匀。 2．称取叶片切段 ．称取叶片切段0.3 g，放入冰浴的研钵中，加入少许石 ，放入冰浴的研钵中， 英砂和2 磷酸缓冲液， 英砂和 mL 0.05 mol · L-1磷酸缓冲液，研磨成匀浆。 磷酸缓冲液 研磨成匀浆。 将匀浆转移到试管中，再用3 将匀浆转移到试管中，再用 mL 0.05 mol · L-1磷酸 磷酸 缓冲液，分三次冲洗研钵，合并提取液。 缓冲液，分三次冲洗研钵，合并提取液。 3．在提取液中加入 mL 0.5 %硫代巴比妥酸溶液，摇匀。 硫代巴比妥酸溶液， ．在提取液中加入5 硫代巴比妥酸溶液 摇匀。 4．将试管放入沸水浴中煮沸 ，（自试管内溶液中 ．将试管放入沸水浴中煮沸10 min，（自试管内溶液中 ，（ 出现小气泡开始计时）。到时间后， ）。到时间后 出现小气泡开始计时）。到时间后，立即将试管取出并放 入冷水浴中。 入冷水浴中。 5．待试管内溶液冷却后，3000×g离心 离心15 min，取上清 ．待试管内溶液冷却后， × 离心 ， 液并量其体积。以0.5 %硫代巴比妥酸溶液为空白测 液并量其体积。 硫代巴比妥酸溶液为空白测 532 nm、600 nm和450 nm处的消光值。 处的消光值。 、 和 处的消光值
思考题
• 不同植物在同一逆境下，丙二醛含量变化 不同植物在同一逆境下， 不同，说明了什么？ 不同，说明了什么？
注意事项
• 1．可溶性糖与TBA显色反应的产物在 ．可溶性糖与 显色反应的产物在532 nm 显色反应的产物在 也有吸收（最大吸收在450 nm），当植物处于 ），当植物处于 也有吸收（最大吸收在 ）， 干旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高， 干旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高， 必要时要排除可溶性糖的干扰。 必要时要排除可溶性糖的干扰。 • 2．低浓度的铁离子能增强 ．低浓度的铁离子能增强MDA与TBA的显色反 与 的显色反 应，当植物组织中铁离子浓度过低时应补充 Fe3+（最终浓度为 （最终浓度为0.5 nmol · L-1） • 3．如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间， ．如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间， 最好使用低温离心机离心。 最好使用低温离心机离心。
计算结果
V MDA( mmol⋅ g FW) = 6.452×( D532 −D600 ) −0.559×D450 × t V ×W s
-1
• 式中，Vt：提取液总体积（mL）； 式中， 提取液总体积（ ）； • Vs：测定用提取液体积（ml）； 测定用提取液体积（ ）； • FW：样品鲜重（g）。 ：样品鲜重（ ）。