利用SSR标记进行小麦品种鉴定和新品种保护研究

收稿日期:2007-05-16

作者简介:李汝玉(1966-),男,研究员,主要从事新品种保护测试研究。

山东农业科学Shandong Agr icultural Sciences 2007年 第6期

利用SSR 标记进行小麦品种鉴定和新品种保护研究

李汝玉,李 群,张文兰,张 晗,宋国安,王东建

(山东省农业科学院作物研究所,山东济南 250100)

摘 要:利用变性聚丙烯酰胺电泳结合银染技术,检测了8个SSR 位点在71份中国育成小麦品种(系)中的多态性,确定了各SSR 位点上等位基因的大小。在71份小麦品种(系)中,共检测到等位基因75个,每对引物检测到的等位基因个数最少为6个(gw m186),最多为15个(g wm174),平均9 4个。P IC 值最高为0 8739(gw m174),最低为0 6552(gw m186),平均为0 7968。利用少数几对高P IC 值的SSR 引物,能够将全部71份品种(系)区分开来,供试材料间至少有一对等位基因存在差异。对SSR 标记应用于小麦品种鉴定和品种保护的可行性进行了讨论。

关键词:小麦;SSR 标记;品种鉴定;新品种保护

中图分类号:S512 1+1;Q789 文献标识号:A 文章编号:1001-4942(2007)06-0014-04

Application of SSR Markers to Identification

and Protection of Wheat Variety

LI Ru yu,LI Q un,ZH ANG Wen lan,ZH ANG H an,SONG Guo an,WANG Dong jian

(Cr op Res ear ch I nstitute ,S hand ong A cademy of A gr icultur al S ciences ,J inan 250100,China)

Abstract In this study ,the diversity and size of allele at 8SSR loci am ong 71Chinese w inter w heat cultivars (lines)w ere determined using denaturing PAGE and silver staining 75alleles in total w ere detected,ranging from 6(g w m186)to 15(gw m174)per primer w ith the average of 9 4 The PIC values of the SSR loci varied from the lo w est o f 0 6552(gw m186)to the highest of 0 8739(gw m174)and averaged 0 7968 Genotypes of each variety consisting of allele sizes at 8SSR loci w ere established All the 71cultivars (lines)could be uniquely identified and distinguished from each other using the 8SSR markers,and there w ere at least one allele different fr om each other SSR markers ar e especially suitable for identifying w heat cultivars (lines)developed thro ug h conventional hy brid ization breeding m ethods

Key word Wheat;SSR Variety identification;New v ariety pro tection 我国于1999年开始实行植物新品种保护制度,是国际植物新品种保护联盟(U POV)成员国。根据 国际植物新品种保护公约 和我国 植物新品种保护条例 的要求,申请获得品种权的前提之一是必须具备特异性(Distinctness)、一致性(U nifo rmity)和稳定性(Stability)。其中最重要的是特异性,即申请品种必须明显不同于同一物种内所有已知品种。品种的特异性测试目前主要采用形态学鉴定方法,在作物田间生长不同阶段,通过对大量形态学性状进行调查统计,鉴别鉴定不

同品种。该方法存在下列不足:首先,鉴定周期长,费用高,一般需要两个生长季节;其次,形态学方法所调查性状大多属数量性状,由微效多基因控制,容易受环境影响;第三,由于现代育种中新品种多由数量有限的一些优良品种作亲本杂交育成,新品种遗传基础狭窄,品种之间的形态学差异越来越小,造成可供品种鉴定利用的形态性状不足,增加了品种鉴定的困难。

SSR 分子标记的一个重要潜在应用领域是品种鉴定和品种产权保护。在小麦方面,Plasch

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ke等[1]利用23个SSR可以将除一对姊妹系以外的40份小麦品种(主要为亲缘关系较近的欧洲小麦品种)区分开。H uang等[2]发现,利用24个SSR标记可以区分来自68个国家的998份六倍体小麦材料。关于利用SSR标记鉴定中国小麦品种的研究很少。高睦枪等[3]利用53对SSR引物对全国1999~2000年北方冬麦区及黄淮冬麦区观察谱中选出的48个新品种(系)进行了遗传差异研究,发现利用5个多态性高的SSR标记可以将48个小麦新品种(系)鉴定开。目前,国际上利用SSR标记进行品种鉴定和品种产权保护的工作正在进入实用阶段[4,5]。

为便于品种间的比较,要求测试数据易于保存、处理和交流。利用SSR标记多态性高的特点,确定品种在一组SSR位点上的等位基因大小,建立一类作物所有已知品种的SSR基因型数据库。通过比较申请品种和已知品种在这些位点上的基因型的差异,即能够鉴定申请品种的特异性。目前国内尚未有这方面的研究报道。

本研究的主要目的是对一批中国育成小麦品种(系)中SSR标记的多态性进行研究,对SSR 分子标记技术应用于中国小麦品种鉴定和品种权保护的可行性作出评价。

1 材料与方法

1 1 小麦品种(系)

共选用我国育成小麦品种(系)71份,主要为我国20世纪50年代至90年代间选育出的品种,其中大部分品种为不同时期生产上的主栽品种。从地域上看,主要来自黄淮冬麦区,以山东省选育的品种(系)为主,部分来自北方冬麦区。所有供试材料由山东省农业科学院作物研究所小麦种质资源库提供。供试材料详见表1。

1 2 引物

根据有关文献[1,6]选择了gw m46、g wm174、gw m186、gw m325、gw m577、gw m099、g w m437和gw m443共8对多态性强的小麦SSR位点引物,由宝生物工程(大连)公司按提供的引物序列合成。

1 3 SSR位点等位基因大小计算

DNA提取、PCR扩增、变性胶电泳、银染和SSR位点等位基因大小计算等同李汝玉等[7]的方法。

1 4 多态性信息量的计算

按照Anderson等[8]的方法。同一SSR引物扩增出几个片段且位点个数不明的情况,仍作为一个位点计算PIC值,无效等位基因(null allele)作为一个等位基因计算PIC值。

1 5 品种间SSR基因型的比较

利用微软Access2000软件,以参试品种为记录,以各SSR位点的等位基因大小为字段构建一个数据库表,对字段进行排序。

2 结果与分析

2 1 等位基因大小估算结果和不同SSR位点的多态性

本研究利用8对引物对71份小麦品种(系)进行了扩增,依据拟合的分子量标准DNA多项式曲线方程[14],对供试材料8个SSR位点上的扩增片段(等位基因)大小进行了估算。结果列于表1。

gw m46、g w m099、g w m186、gw m325和gw m443对所有品种均能扩增,估算了这些位点上71份品种(系)的等位基因大小。g wm437、gw m577分别有26个和18个品种无预期大小扩增产物,重复实验仍无法扩增,视为 无效等位基因(null allele) ;g w m174有9个品种扩增产物极弱,无法确定片段大小。部分引物(g w m46、gw m099、g w m186、gw m437)同时扩增出两个大小不同的等位基因。gw m174同时扩增出三个等位基因,本研究只估算了其中最小的一个。在gw m174和gw m443两个位点上,分别只对63份和60份品种进行了等位基因大小估算。

在71份品种(系)中,利用8对引物共检测到等位基因75个(gw m174按1个位点计算),每对引物扩增出的等位基因的个数最少为6个(gw m186),最多为15个(g w m174),平均每对引物为9 4个(表2)。

为衡量不同引物的品种鉴别力,计算了8对引物的PIC值,结果如表2所示。在本研究的8对引物中,以gw m174的PIC值最高,为0 8739;其次为gw m437,为0 8419;最低的为g wm186, PIC值为0 6552。8对引物的平均PIC值为0 7968。

2 2 品种鉴定

利用微软Access2000软件,以8个SSR位点的等位基因大小为字段,71个小麦品种(系)为记录建立了一张数据库表。对数据库表中的字段,即71份品种(系)在8个位点上的等位基因大小进行了升序排列(排序结果略)。结果表明,71

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