兽医生物制品学实验教学讲义

兽医生物制品学实验教学讲义

实习一、弗氏佐剂的制备

目的及要求

掌握弗氏佐剂的制备方法及检验方法。

内容与方法

弗氏佐剂是目前最常用的油乳佐剂，根据佐剂中加入或不加入死结核杆菌可分为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂。在灭活疫菌苗的制备过程中常用油乳佐剂，即“弗氏不完全佐剂”。下面我们主要介绍弗氏不完全佐剂的制备方法。

一、材料和设备：

1、材料：7#白油、硬脂酸铝、司班——80、吐温——80、蒸馏水等。

2、设备：乳化泵、分析天平、离心机（4000r/min）、恒温培养箱、粘度计、高压灭菌

锅、量杯、量筒、烧杯、试管、吸管（出液口径2mm）等。

二、方法：

使用不同乳化剂和不同的配合比例及乳化方法，决定了制备乳剂的性状和稳定性。疫苗生产中主要有两种基本方法。

1、剂在水中法此法将乳化剂直接溶于水中，在激烈搅拌下将油加入，可直接生成O/W 乳剂。若欲得W/O型，可继续加入油，直到发生变型。该法通常用匀浆器或胶体磨，高速搅拌而得到较好的乳剂。

2、剂在油中法此法将乳化剂溶于油相，将油相直接加入水相中得O/W，如水相直接加入油相，得到W/O型，如欲得O/W，继续加入至变型。该法制成的乳剂，一般均匀颗粒直径在0.5um左右，比较稳定。

3、油乳剂配方免疫实验动物用的佐剂配方：7#白油85ml，司班——80 15ml混合后经除菌过滤而成为弗氏不完全佐剂（FIA）；如向其中加入0.5mg/ml死结核杆菌即为弗氏完全佐剂（FCA）。使用时，将含抗原的水相，与上述任一佐剂等量混合，用力振摇即可成为均匀的乳剂。疫苗生产用乳剂配方：7#白油90ml，司班——80 10ml，混合后加2ml的吐温——80和1.5g的硬脂酸铝，经高压灭菌后备用，使用前将配好的油佐剂与抗原水相1∶1混合，强力振摇，或通过胶体磨搅拌即可制成性状良好的乳剂疫苗。

大量生产乳剂疫苗时，可将94%白油与6%司班——80混合后加入2%的硬脂酸铝，经灭菌后为油相；抗原液加入2%的吐温——80为水相。乳化时，按容量计算，油相与水相1∶1配制，先缓速混合，再通过乳化泵或胶体磨充分乳化，可获得稳定的油包水乳剂苗。但这种配方制的乳剂苗一般较粘稠，而且必须充分掌握混入抗原时的速度，在慢速搅拌油相的同时，缓慢倾入水相混合，然后再高速通过胶体磨或乳化泵充分乳化，否则易于分层。如欲降低乳剂的粘稠度，可以增加油相的比例，例如以水与油之比达1∶2或1∶3，最高可达1∶4时，亦可获得良好的W/O乳剂疫苗。或者将粘稠的W/O乳剂疫苗，再加2%吐温——80生理盐水，通过搅拌或乳化泵乳化，可制成双向乳剂疫苗（水—油—水乳剂）也可直接制备双向乳剂苗（或称多型乳剂Multiple emulsion abjuvant）。双向乳剂苗的优点是：粘稠度低、在注射部位易分散、局部反应轻微及佐剂效应良好等。

三、油乳剂的检验：

油乳剂检验项目包括乳剂类型检查、黏度测定、稳定性测定、粒度大小及分布的检测等，生产实际中以黏度测定和稳定性测定为主。

1、乳剂类型的测定：测定方法有多种。①Robertson的染料法。用“SudanⅡ油溶性染料”和“亮蓝FCF”水溶性染料，分别加入两份乳剂中，轻轻摇动，若是整个乳剂染油溶性染料即外相为油（W/O），若整个乳剂染水溶性染料即外相为水（O/W）。②冲淡或滴于冷水表面。此法是根据乳状液是为其外相所冲淡，将两滴乳状液放在一玻片上，于一滴中加入水，另一滴加入油，轻轻搅拌，按照易与乳状液搀合的物质（油或水）来确定外相的性质。③电导法。因为多数的油皆是不良导体，而水则是良导体，用万用表（10K1/2W）把两级分开插入乳剂中，能导电者外相为水，为水包油乳剂；不能导电者外相为油，为油包水乳剂。

2、黏度测定：不同黏度的佐剂有不同的测定装置，低黏度佐剂可用毛细管粘度计测定。黏度大的乳剂测定方法有堕球法和转筒法等。适于测乳剂苗用的是流出法，用Saybolt粘度计。此型粘度计基本结构是一个有套层的管子，上面有溢流的坑道，底下有流出的小孔，小孔长1.225cm，孔径0.1765cm，管中容纳60ml液体，在地心重力场中流入一个特别的小瓶所需时间，以秒计数表示之。

为了简便，可用1ml吸管，出口内径1.2mm，在室温下吸满1ml乳剂，垂直放出0.4ml 所需时间作为黏度单位，适宜于注射用乳剂的黏度以2——6s左右为宜，如超过10——15s，注射时就比较困难。

3、乳剂稳定性的测定：①加速老化法。高温37℃贮存10——30天不破乳，②离心加速分层法。可通过离心乳剂的方式测定。将乳剂放入试管中，以3000r/min离心15min，不分层的乳剂苗，保存1年以上无破乳现象。

4、粒度大小及分布的测定：用显微镜直接观察，或用光散射法和透射法或以测微尺测定之。以直径10um均匀颗粒的乳剂为较好。

四、对油乳剂苗安全性的评价：

1975年在WHO免疫学会上，一个科学工作小组对使用油乳剂苗进行了讨论，认为用矿物油佐剂会引起全身性病状，诱发各种自身免疫紊乱及促进变态反应。但缺乏充足资料加以证实，尤其缺乏佐剂成分的代谢过程和在动物体内长期毒性及病理学的研究。现有结果还不能说明他们的推论。实际在人们接种油苗后的长期观察过程中，尚未发现不良副作用，只有偶然发生局部无菌脓肿的例子。因而，学者们认为，动物抗体对外来物质总是要发生反应的，注入佐剂也不例外，只是应对反应时间的长短、有害或有利、反应的严重程度等加以分析。实际上减轻局部反应，还可通过选择更好的材料和最佳乳剂配方来实现。

如前所述，一些学者用精制花生油与化学纯试剂，研制成功“佐剂——65”。经实验证明，这种佐剂具有矿物油所没有的优点，注射“佐剂——65”两个月后，几乎能完全被代谢，从而可以减少过度刺激，排除了因长期贮留可能产生的有害作用，产生的抗体水平与矿物油佐剂相似。佐剂——65注射于豚鼠、小鼠及猴，没有发现短期（急性）和长期（慢性）毒性，在家兔体内也没有发现有致畸作用。虽然曾有人报告皮下注射佐剂——65及矿物油佐剂于小鼠，尤其对雄鼠，长期观察有增生赘生物（瘤），但大量病理学研究表明，这些物质都非致瘤原，而是由于一种已被充分认识的理化改变作用，常见于某些啮齿类动物，与人无关，因为注射蒸馏水，甚至反复穿刺小鼠皮肤，也会发生这种致赘生物作用。报告还说人体注射矿物油佐剂后18年，注射花生油佐剂10年，随访调查表明，对赘生物的发生并无增加，也没有其他临床上重大的不良反应。

此外，近年来在研究乳剂中还应注意一个问题，即制乳剂苗无论是用矿物油或用花生油，均不能含有脂酶和酯酶，因为，这些酶能使二缩甘露醇及花生油降解，从而释放出脂肪酸。脂肪酸是有毒性的，会引起注射部位的严重反应，导致形成硬结或脓肿。应特别注意在用花生油时，必须精制以除去花生蛋白，决不允许含有黄曲霉毒素。