兽医生物制品学实验教学讲义
兽医生物制品学ppt课件
巢式PCR示意图
3.反向PCR(IPCR):
反向PCR用于扩增已 知序列两端的未知 DNA片段，因此一对 引物与常规PCR一样 与已知序列互补但是 方向却是相反的。 IPCR步骤主要包括酶 切、自身连接还化、 扩增和序列分析。
四、聚合酶链反应（PCR）
PCR技术是DNA体外扩增技术，以单链DNA为模 板，在DNA聚合酶的作用下引物沿5‘→3’方向不断延 伸，利用4种dNTP合成新的互补DNA链，然后在高 温下变性为单链，再在低温下使引物DNA片段与其复 性，并在DNA聚合酶的作用下开始新一轮DNA合成。 经如此反复循环（变性－退火－延伸）30~60次左右 就可在短时间内将目的DNA扩增数百万倍。PCR技术 为疾病诊断提供了简便、快速、特异、敏感的检测手 段，适于检测不宜分离培养或含量极微的样品中病原 体特定基因片段的有无，或分析不同样品中此片段的 异同。 为了检测RNA样品可以先进行反转录，然后进行 PCR扩增DNA，这就是RNA的反转录－聚合酶链反应 （RT－PCR）。PCR与酶切图谱分析和分子杂交技术
免疫标记法
抗杂交体标记法：在杂交过程中作为探针的核酸 与其互补的核酸能形成杂交体，杂交体本身具有 一定抗原性，因而可用抗杂交体的抗体并结合带 标记的第二抗体对杂交体进行检测 半抗原标记法：通过对已知核酸片段做一定的修 饰，在探针的某些部位连接半抗原，探针通互补 核酸片段 杂交后，与半抗原的特异性抗体结合， 再通过结合带标记的第二抗体对形成的杂交体进 行检测。
斑点杂交
1、原理及步骤：提取病毒、细菌、Cell DNA ↓ 点样品至膜、干燥、固定 ↓ 探针、DNA变性、杂交 ↓ 洗膜、放射自显影 2、应用： ↓ 1）混合样品DNA 结果分析
兽用生物制品基本知识演示文稿
• 3．预防前，应了解当地有无疫情，有疫情时不宜使用。
• 4．使用前，应仔细查阅使用说明书与瓶签是否相符；若不同，严禁使用并及时与厂 方联系。明确装量、稀释液、稀释度、每头剂量、使用方法及有关注意事项。应严 格遵守，以免影响效果，防止造成事故。
第三页，共27页。
疫苗是防制动物疫病的主要手段之 一
• 传染病的三个环节：传染源、传播途径、易感动物 • 控制传染病的措施
消灭传染源：扑杀处理 切断传播途径：隔离封锁、消毒 减少易感动物：用疫苗免疫接种
第四页，共27页。
• 疫苗的定义 • 疫苗的种类 • 疫苗的储存、运输 • 疫苗使用的一般注意事项
第八页，共27页。
• 灭活疫苗 • 优点—不能在动物体内繁殖，比较安全，不发生全
身性副作用，无毒力返祖现象。有利于制备多价或 多联疫苗。制品稳定，运输储存较为方便。 • 缺点—免疫剂量大，生产成本高，需多次免疫。免 疫后只能诱导机体产生体液免疫和免疫记忆。
第九页，共27页。
• 基因疫苗 • 不能在机体内增殖，但可被细胞吸纳，并在细胞内
第二十四页，共27页。
瓶塞上应固定一消毒过的 针头，上覆盖酒精棉球。
疫苗必须确保注入规定部 位，比如灭活疫苗规定肌 肉注射的，切不可注入脂 肪层或皮下。
注射部位剪毛后用70— 75%的酒精棉或碘酒擦净 消毒。
第二十五页，共27页。
当天开启的疫苗限当天用完，开启后超过24 小时不可再用。
严禁用“飞针”方式注射疫苗，这样容易造 成剂量不足，注射部位不准。
• 按疫苗的物理性状分为冻干制品、佐剂制品—油佐剂、铝胶佐 剂。
兽医生物制品学教学大纲
兽医生物制品学教学大纲第一章绪论内容提要：本章主要讲述兽医生物制品学的概念及在预防疾病上的应用，兽医生物制品的分类、命名原则；兽医生物制品发展的历史、成就及前景。
教学目标：掌握兽用生物制品的概念、分类、应用，了解兽用生物制品的命名原则、兽医生物制品发展的方向。
计划课时：4学时1.1兽医生物制品学的概念与应用1.1.1兽医生物制品学的概念兽医生物制品的概念；兽医生物制品学的概念1.1.2兽医生物制品的应用免疫预防；诊断；治疗1.2兽医生物制品的分类与命名原则1.2.1生物制品的分类1.2.2生物制品的命名原则1.3我国兽医生物制品的发展历史及前景1.3.1兽医生物制品的发展简史1.3.2兽医生物制品的发展前景第二章生物制品的免疫学理论内容提要：主要讲述抗原与抗体、免疫系统与免疫应答、免疫血清学技术教学目标：掌握抗原抗体的概念。
主要的微生物抗体，免疫球蛋白；理解免疫应答的机制；掌握体液免疫应答细胞免疫应答；熟悉免疫学诊断与检测的常用技术。
计划课时：16学时2.1抗原与抗体2.1.1抗原抗原的概念、构成免疫原的条件、抗原决定簇、抗原的交叉性、主要抗原微生物2.1.2抗体免疫球蛋白与抗体、Ig的分子结构、Ig的主要特性与免疫学功能2.2免疫系统与免疫应答2.2.1免疫系统免疫器官、免疫细胞、细胞因子2.2.2免疫应答免疫应答的基本过程、体液免疫应答、细胞免疫应答、免疫耐受、免疫应答的机制2.3免疫血清学技术2.3.1直接凝集实验2.3.2间接凝集实验2.3.3酶联免疫吸附试验2.3.4免疫荧光试验2.3.5病毒中和试验2.3.6补体结合试验第三章灭活剂、保护剂与免疫佐剂内容提要：介绍灭活剂、保护剂、免疫佐剂、新型免疫佐剂教学目标：掌握灭活剂、佐剂、保护剂的概念、影响灭活剂作用的因素，理解灭活剂、佐剂、保护剂在兽用生物制品生产中的作用。
计划学时:6学时3.1灭活剂3.1.1灭火与灭活剂灭火与灭活剂的概念、灭火的类型、3.1.2常用的灭活剂的灭火机理与应用甲醛、烷化剂、苯酚、结晶紫、β-丙酰内酯3.1.3影响灭火作用的因素3.2保护剂3.2.1保护剂的组成及作用机理做成、作用机理3.2.2保护剂的种类3.2.3影响冻干保护剂效能的因素3.2.4常用的冻干保护剂不同微生物适用的保护剂、兽医生物制品常用的保护剂3.3免疫佐剂3.3.1佐剂的概念与作用机理3.3.2佐剂的分类3.3.3常规免疫佐剂铝盐类佐剂、油乳佐剂、蜂胶佐剂3.4新型免疫佐剂3.4.1细胞因子类佐剂概念与分类、作用特点、应用、重要的细胞因子3.4.2 CpGDNA概念及特点、免疫学活性、佐剂效应与应用前景3.4.3基因工程减毒素3.4.4其他新型免疫佐剂免疫刺激复合物、脂质体佐剂、MF59佐剂第四章兽医生物制品生产的基本技术内容提要：本章主要讲述菌（毒）种选育技术，细菌培养、病毒增值技术，疫苗制造流程，诊断、治疗制剂的制造技术以及冷冻真空干燥，干燥技术。
兽医生物制品学讲稿
1.抵抗感染指动物机体抵御病原微生物的感染和侵袭的能力，又称免疫防御。
2.自身稳定又称免疫稳定。机体免疫系统识别和清除自身衰老死亡的细胞，以维持机体的生理平衡。
3.免疫监视机体免疫系统识别和清除自身的变异细胞。
一 抗原
基本要求：
使学生掌握抗原及各类抗原的概念、抗原的基本条件、抗原的决定簇及兽医学中常见的重要天然抗原。主要内容
目前，冒内生产和使用的治疗用兽医生物制品有：抗毒素、抗病血清、免疫制剂。
（四）用于动物的保健
第二节 兽医生物制品的分类与命名原则
一、命名原则
（1）以明确、简练、科学为基本原则。
（2）不采用商品名或代号。
（3）一般采用“动物种名+病名+制品种类”的形式，如猪丹毒活疫苗。诊断制剂则在制品种类之前加诊断方法名称，布鲁氏菌病虎红平板凝集试验抗原。
1.识别自身与非自身正常动物机体能识别自身与非自身的大分子物质，识别的物质基础是存在于免疫细胞(T淋巴细胞、B淋巴细胞)膜表面的抗原受体，识别功能很精细
2.特异性机体的免疫应答和免疫力具有高度的特异性（针对性）。
3.免疫记忆机体受抗原刺激产生抗体和致敏淋巴细胞外，也形成了免疫记忆细胞，对再次接触的相同抗原物质可产生更快的免疫应答。
3.抗病血清 是含有高效价特异抗体的动物血清制剂。
4.微生物活性制剂 包括微生物酶制剂和微生态制剂。微生物酶制剂是用非病原微生物产生的酶而制成的制剂，应用价值较高的酶制剂有纤维素酶、β-半乳糖苷酶、α-淀粉酶等；微生态制剂是用非病原微生物本身制成，如用乳酸杆菌、双歧杆菌、蜡样芽胞杆菌制成的活菌制剂。
二、兽医生物制品学的应用
（一）免疫预防
防治动物疫病的主要手段之一，也是保障人兽健康的必要条件。许多国家借助生物制品控制或消灭了很多危害严重的动物传染性疾病。如牛瘟、猪瘟。
生物制品学教案2002级.doc
生物制品学理论课教案生物制品学理论课教案生物制品学理论课教案生物制品学理论课教案生物制品学理论课教案生物制品学理论课教案生物制品学理论课教案生物制品学理论课教案生物制品学理论课教案生物制品学理论课教案生物制品学理论课教案生物制品学理论课教案生物制品学理论课教案生物制品学理论课教案生物制品学理论课教案生物制品学理论课教案生物制品学理论课教案生物制品学理论课教案生物制品学理论课教案生物制品学理论课教案生物制品学理论课教案生物制品学理论课教案生物制品学理论课教案生物制品学理论课教案生物制品学理论课教案美文欣赏1、走过春的田野，趟过夏的激流，来到秋天就是安静祥和的世界。
秋天，虽没有玫瑰的芳香，却有秋菊的淡雅，没有繁花似锦，却有硕果累累。
秋天，没有夏日的激情，却有浪漫的温情，没有春的奔放，却有收获的喜悦。
清风落叶舞秋韵，枝头硕果醉秋容。
秋天是甘美的酒，秋天是壮丽的诗，秋天是动人的歌。
2、人的一生就是一个储蓄的过程，在奋斗的时候储存了希望；在耕耘的时候储存了一粒种子；在旅行的时候储存了风景；在微笑的时候储存了快乐。
聪明的人善于储蓄，在漫长而短暂的人生旅途中，学会储蓄每一个闪光的瞬间，然后用它们酿成一杯美好的回忆，在四季的变幻与交替之间，散发浓香，珍藏一生！3、春天来了，我要把心灵放回萦绕柔肠的远方。
让心灵长出北归大雁的翅膀，乘着吹动彩云的熏风，捧着湿润江南的霡霂，唱着荡漾晨舟的渔歌，沾着充盈夜窗的芬芳，回到久别的家乡。
我翻开解冻的泥土，挖出埋藏在这里的梦，让她沐浴灿烂的阳光，期待她慢慢长出枝蔓，结下向往已久的真爱的果实。
4、好好享受生活吧，每个人都是幸福的。
人生山一程，水一程，轻握一份懂得，将牵挂折叠，将幸福尽收，带着明媚，温暖前行，只要心是温润的，再遥远的路也会走的安然，回眸处，愿阳光时时明媚，愿生活处处晴好。
5、漂然月色，时光随风远逝，悄然又到雨季，花，依旧美；心，依旧静。
月的柔情，夜懂；心的清澈，雨懂；你的深情，我懂。
兽医生物制品的免疫学基础ppt课件
考评项目赋标准分，对照考评内容和 考评办 法对考 评项目 进行考 评，评 出各考 评项目 的考评 实际得 分，考 评类目 下各考 评项目 考疫应答是抗体与细胞的免疫应答和免疫 耐受性。动物机体应有自身监视和抵抗入侵 微生物的免疫系统。可以认为，细胞免疫应 答是免疫监视功能的反响，而抗体免疫应答 那么是预防功能的反响。然而，这样的区分 并不是绝对的，因为抗体的存在有助于移植 物的排斥，而细胞免疫应答也参与抗体防御 各种传染病。至于耐受性那么代表着兄一种 必不可少的保护机制，它能保护动物免遭免 疫应答不加选择的伤害作用。
考评项目赋标准分，对照考评内容和 考评办 法对考 评项目 进行考 评，评 出各考 评项目 的考评 实际得 分，考 评类目 下各考 评项目 考评实 际得分 之和为 该考评 类目的 考评实 际得分
第二章 兽医生物制品的免疫学根底
❖ 【知识目标】 ❖ 熟悉免疫学诊断与检测的常用技术; ❖ 理解免疫耐受及免疫应答的机制; ❖ 掌握体液免疫应答和细胞免疫应答; ❖ 了解动物早期(胚胎)免疫应答机理.
考评项目赋标准分，对照考评内容和 考评办 法对考 评项目 进行考 评，评 出各考 评项目 的考评 实际得 分，考 评类目 下各考 评项目 考评实 际得分 之和为 该考评 类目的 考评实 际得分
四、免疫应答的机制
❖ 所以，可认为免疫系统包括以下的根本构成:捕捉与处 理抗原的系统(图1-3 );与抗原发生特异性反响的机 构—抗原敏感细胞:产生抗体及参与细胞免疫的细胞; 保持对信息的“一记忆〞并在将来的遭遇中与抗原发 生特异性反响的细胞;以及最终消灭抗原的细胞。捕捉、 处理与最终消灭抗原的细胞是巨噬细胞;无论是初次应 答开场时的抗原敏感细胞，还是发动再次应答的记忆 细胞之类的抗原敏感细胞。以及细胞免疫应答的效应 细胞，都是小淋巴细胞;而抗体生成细胞是浆细胞。
兽医生物制品学讲解第十讲
第十章 免疫血清制备技术 优良菌 / 毒种的生物学特征应十分典型
（形态、培养、生化和血清学等）
强毒 常用的菌 / 毒种有： 弱 毒
灭活毒
可单独使用，可共同使用，也可交互使用， 其目的是尽可能提高抗体效价。
第十章 免疫血清制备技术
按照制备方法的不同
免疫用抗原分为
第十章 免疫血清制备技术
（ 1 ）组织毒抗原
用健康、易感的本种动物人工感染增殖病原 ; 根据微生物增殖规律，采集含毒高的组织制成 活的或灭活的抗原液。
如血液、肝、脾、肺、肾、淋巴结和脑组织等
第十章 免疫血清制备技术
细菌和病毒等微生物
都可利用动物增殖！
第十章 免疫血清制备技术
例如：抗猪瘟血清抗原制备
① 给健康、敏感、 40~80kg 猪注射猪瘟强毒 1mL
2、第 1 次采血后 3~5d 可进行第 2 次采血 3、第 2 次采血后，经 3~5d 天可再次注射抗原，
如此循环进行。
第十章 免疫血清制备技术 ② 采血量
按动物每 kg 体重采取 10mL 左右
注意： 采血常在上午空腹时进行，前一晚上不喂
精料，而仅给草料和水，避免血中出现乳糜
第十章 免疫血清制备技术
② 也可于培养物内加入佐剂制成佐剂抗原。
第十章 免疫血清制备技术
3 、免疫程序
由于病原微生物的性质、免疫机制的不同， 各有其最佳的免疫程序。
第十章 免疫血清制备技术
1 、一般的免疫程序
（ 1 ）如以 强毒抗原 为抗原 基础免疫时以灭活疫苗为抗原， 然后以递增量强毒抗原进行高度免疫。
这种免疫程序通常可获得高效价的抗血清 如：抗气肿疽血清、抗猪牛出败血清等
通常是给适当动物以多次注射特定病原微生物 或其代谢产物等抗原物质，刺激动物发生免疫应 答，在血清中产生大量的特异性抗体。
《兽医生物制品学实验》教学大纲
F109-10714-0
大纲修订人：王先炜
大纲审定人：姜 平
546
动物医学院本科课程教学大纲
《兽医生物制品学实验》教学大纲
一、基本信息
课程名称 英文名称 总学时 实验项目数 预修课程
课程简介
兽医生物制品学实验
课程编号
Experiment Technique of Veterinary Biologics
课程类型
36
学分
12 验证性实验个数
综合性实验个数
12
兽医微生物学、兽医免疫学
合计
学时
3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 36
四、实验内容及教学要求
实验一 细菌种子繁殖和规模化培养 本实验教学要求：了解细菌规模化培养的基本原理和基本操作方法；掌握细菌种子繁殖的基本过程和方法。 本实验重点、难点：一级、二级细菌种子的制备和细菌规模化培养。 实验二 鸡胚孵化和新城疫病毒增殖
545
动物医学院本科课程教学大纲
本实验教学要求：掌握鸡胚孵化的基本方法，鸡胚尿囊腔途径和绒毛尿囊膜途径接种病毒及其收获方法。 本实验重点、难点：鸡胚尿囊腔途径和绒毛尿囊膜途径接种病毒及其收获方法。 实验三 细胞培养 本实验教学要求：进一步认识和体会影响细胞培养的主要因素；学习和掌握鸡胚成纤维细胞的培养方法和细胞传 代培养的方法 本实验重点、难点：鸡胚成纤维细胞的制备和培养。 实验四 免疫佐剂的制备 本实验教学要求：掌握适用于不同灭活疫苗的白油佐剂的制备方法；了解用铝粉加烧碱合成法制备氢氧化铝胶的 方法。 本实验重点、难点：白油佐剂和弗氏佐剂的配制 实验五 生物制品的无菌检验、纯粹检验和活菌技数 本实验教学要求：学习和掌握生物制品无菌检验、纯粹检验和活菌计数的方法。 本实验重点、难点：生物制品无菌检验、纯粹检验和活菌计数。 实验六 病毒半数致死量和感染量测定 本实验教学要求：学习和掌握细胞半数感染量（TCID50）的测定方法，了解病毒鸡胚半数致死量（EID50）的测定 方法。 本实验重点、难点：生物制品无菌检验、纯粹检验和活菌计数。 实验七 生物制品的外源病毒检验 本实验教学要求：掌握禽类病毒活疫苗中外源性病毒的检测方法 本实验重点、难点：新城疫病毒活疫苗中外源性病毒的检测 实验八 冻干制品的物理性状检验及真空度和剩余水分的测定 本实验教学要求：学习冻干生物制品质量检验的内容和要求；认识冻干制品的物理性状；掌握冻干制品真空度和 剩余水分检测的原理和方法。 本实验重点、难点：冻干制品剩余水分和真空度的测定。 实验九 灭活疫苗的物理性状检验及甲醛和柳硫汞含量的测定 本实验教学要求：以油乳剂灭活疫苗为例，认识灭活疫苗特有的物理性状；掌握灭活疫苗的甲醛和柳硫汞含量测 定的原理和方法。 本实验重点、难点：灭活疫苗的甲醛和柳硫汞含量测定方法 实验十 兔病毒性出血症组织灭活疫苗的制备和检验 本实验教学要求：了解并掌握兔病毒性出血症组织灭活疫苗的制备方法，了解兔病毒性出血症组织灭活疫苗的检 验方法。 本实验重点、难点：兔病毒性出血症组织灭活疫苗的制备方法 实验十一 鸡新城疫病毒 HA 抗原的制备 本实验教学要求：熟练掌握 NDV 鸡胚培养和 HA 抗原的制备方法。 本实验重点、难点：鸡新城疫病毒 HA 抗原的制备方法。 实验十二 鸡传染性法氏囊病 AGP 抗原的制备和检验 本实验教学要求：了解鸡传染性法氏囊病 AGP 抗原的制备原理、方法和应用，掌握鸡传染性法氏囊病 AGP 抗原 的检验方法。 本实验重点、难点：鸡传染性法氏囊病 AGP 抗原的制备、检验。
兽医生物制品学第七章实验动物动物实验的基本技术方法
兽医生物制品学第七章实验动物动物实验的基本技术方法实验动物是科学研究的重要工具之一，通过对实验动物进行研究，可以更好地了解生物的生理机制、疾病发生的原因以及药物的药理学效应等。
本文将介绍实验动物的选择、养殖与饲养、动物实验的基本技术方法等内容。
一、实验动物的选择1.实验目的：选择实验动物需要基于实验目的进行考量。
不同的实验目的需要选择不同的实验动物，如进行肝脏研究可以选择小鼠或大鼠，进行心脏研究可以选择猪或狗等。
2.实验动物的易得性：一般情况下，实验室常用的实验动物包括小鼠、大鼠、猪、狗等，这些实验动物易于获取和养殖。
3.实验动物的生物学特性：选择实验动物需要了解其生物学特性，包括体型、寿命、生殖周期、生殖特性等。
这些特性决定了实验动物的适用范围和实验方法的选择。
二、实验动物的养殖与饲养1.动物房环境：实验动物的养殖环境要严格控制，包括温度、湿度、光照、噪音等。
保持良好的动物房环境有助于提高实验数据的可靠性。
2.饲料与饮水：实验动物的饲养需要提供适宜的饲料和饮水。
饲料的成分和营养水平要符合实验需要，饮水要保持清洁。
3.疾病防控：实验动物养殖过程中需要进行疾病防控。
定期对实验动物进行健康检查，控制传染病的传播，保持实验动物群体的健康状态。
1.动物实验设计：在进行动物实验之前，必须先进行实验设计。
实验设计需要明确实验目的、实验组的设置、观察指标、样本大小等，以便获得可靠的实验结果。
2.动物体内投药：在进行动物实验时，常常需要将药物或其他物质直接注射到动物体内。
注射方法包括静脉注射、皮下注射、腹腔注射等，需要根据实验需要选择适当的注射方法。
3.取样与检测：根据实验设计的要求，定期从实验动物身上采集样本进行检测。
常见的样本包括血液、组织、排泄物等，可以通过血液生化分析、组织切片、PCR等方法对样本进行分析与检测。
4.动物实验操作：动物实验操作包括给药、观察行为、测量生理指标等。
在进行操作时，需要编制操作规范，以保证实验数据的可靠性。
兽医生物制品学课件
利用微生物、寄生虫及其代谢产物， 或者含有特异性抗体的血清制成的，供诊 断动物传染病及寄生虫或检查动物免疫状 态以及鉴定病原微生物的生物制品。 诊断抗原：变态反应性抗原:纯蛋白衍生物 结核菌素（PPD）、布氏杆菌水解素。 血清反应性抗原 ：布氏、炭疽、鸡白痢等。
3.诊断血清：
多用抗原免疫羊、兔或其他动物制成
二、生物制品生产的申报与审批 1、实验室实验 2、田间实验 3、中间实验 4、区域实验 5、申报
6、审批 7、新制品试生产 8、申请转为正式生产 9、经兽药评审委员会再评价后，建设列 入规程的，发给正式生产批准文号
第四节 我国兽医生物制品事业的概况与成 就 ★ 1951 年 ， 成 立 了 兽 医 生 物 制 品 监 察 所 （1982年改名中国兽药监察所）。 ★猪瘟兔化弱毒苗属世界领先地位， ★马传贫弱毒苗、牛瘟疫苗、鸭瘟疫苗、 小鹅瘟疫苗、仔猪副伤寒苗属国际水平。 ★与发达国家相比仍有许多不足。
二、生物制品菌毒种的一般要求
1、来源（历史）清楚 ，资料完整 由中监所或中监所委托分管的单位负责 供应 2、生物学特性比较典型 菌、毒种的形态特征，培养特性， 对动物的病原性特点，引起细胞病变的 特征 生物化学、免疫学及血清学特性
3、血清型相符 与疫苗使用区的流行病原相符 4、遗传性状稳定
（1）灭活苗（死苗）
一般灭活苗：菌、毒种经大量培养后， 灭活而成。 脏器灭活苗:利用病、死动物的含病原微 生物脏器制成 自家灭活苗：从病、死动物分离培养病原 体大量培养制成的灭活苗
（2）活苗(弱毒苗)
主要指弱毒活疫苗，人工诱变获得的弱毒 株或筛选的天然弱毒株或者失去毒力的无 毒株所制成的 同源疫苗（homologous vaccines）用所要 预防的病原体制成。 异源疫苗(heterogenous vaccines)：火鸡疱 疹病毒疫苗、鸽痘病毒、麻疹苗
兽医生物制品的免疫学基础ppt课件
第二章 兽医生物制品的免疫学基础
❖ 【知识目标】 ❖ 熟悉免疫学诊断与检测的常用技术; ❖ 理解免疫耐受及免疫应答的机制; ❖ 掌握体液免疫应答和细胞免疫应答; ❖ 了解动物早期(胚胎)免疫应答机理.
(一)常见动物免疫系统的个体发生
❖ 1.犊牛
❖ 犊牛的免疫系统在胚胎早期即已形成。虽然母牛的妊娠期是 280 d，但胎儿的胸腺在受胎后40 d即可出现。骨髓和脾脏 在55 d时出现，淋巴结在60 d可以见到，但peyer氏淋巴集 结要到75 d才出现。因为淋巴集结的发生较晚，说明它们可 能不是一级淋巴样组织，所以不能将它们看作是相当于禽类 的法氏囊器官。在胎犊45日龄时可见到外周血液淋巴细胞， 59 d可见到带IgM的细胞，135 d时可见到IgG的细胞出现。 血清抗体的检出最早时间，依赖于所用方法的灵敏程度。所 以应用极其敏感的病毒中和试验，一定能最旱检出针对病毒 的免疫应答。
考评项目赋标准分，对照考评内容和 考评办 法对考 评项目 进行考 评，评 出各考 评项目 的考评 实际得 分，考 评类目 下各考 评项目 考评实 际得分 之和为 该考评 类目的 考评实 际得分
二、细胞免疫应答
❖ 如果将皮肤移植物从一个供体移植给与供体无关 的另一个同类受体动物，该移植物大约只能存活 10d左右。
考评项目赋标准分，对照考评内容和 考评办 法对考 评项目 进行考 评，评 出各考 评项目 的考评 实际得 分，考 评类目 下各考 评项目 考评实 际得分 之和为 该考评 类目的 考评实 际得分
第二章兽医生物制品的免疫学基础
兽医生物制品学ppt课件
二、核酸图谱分析
核酸图谱分析包括核酸电泳图谱、核酸酶 切图谱、寡核苷酸指纹图谱等。 适用于这些诊断技术的试剂，主要是核酸 提取、酶切、电泳等生化和分子生物学试 剂，商品化程度已很高。
（一）核酸电泳图谱分析
核酸电泳图谱是指分离纯化的核酸，由于分子量的差 异而在电泳中迁移速率不同，形成不同的带型。通过带型 异同度的分析可确定生物体间的遗传关系。质粒图谱分析 和RNA图谱分析都是电泳图谱分析。 1．质粒图谱分析 质粒是细菌细胞内能自主复制的染色 体外的DNA，它是耐药性、毒力因子等特殊遗传特性的 载体。多数细菌往往含有大小和数量不等的质粒，具有相 对稳定性，因此质粒图谱分析是细菌分型和流行病学的重 要工具，具有诊断价值。 该法简便、特异、快速、可靠，缺点是对一些无质粒 或质粒不稳定的菌株，以及质粒分子量相同而核苷酸序列 不同的菌株无分辨能力。
一
二：基因探针的标记方法
1.放射性探针的标记法 缺口平移标记法：在适当浓度的DNaseⅠ作用下， 在双链DNA上随机造成3’-OH端缺口，而大肠杆 菌DNA聚合酶Ⅰ有修补缺口的能力，其具有 5’→3’外切酶活性，在缺口处按5’→3’方向切除单 核苷酸；同时有5’→3’的聚合酶活性，在缺口处3’ 端加入底物中的单核苷酸，因而可从切口的5’除 去核苷酸并与3’端核苷酸的加入同时进行，以互 补的DNA单链为模板合成新的DNA，这时在反 应液中加入一种或多种标记的核苷酸（P-32,H3）,从而形成高放射性的DNA探针
（一）核酸探针制备技术
基因探针的获取 二 1. cDNA探针：通过提取纯度较高的相应的 mRNA,反转录成相应的cDNA，再利内切酶不完全水解，从而得到许多片段， 选取长度在15-20kb的片段重组到噬菌体中， 经过体外包装，再转录到大肠杆菌，在固体培 养基上可得到许多噬菌斑，然后用菌斑原位杂 交筛选含有目的的基因作为探针。 3. 寡核苷酸探针：人工合成低于50个核苷酸的任 意序列的寡核苷酸片段作为探针
兽医生物制品学实验教学讲义
兽医生物制品学实验教学讲义实习一、弗氏佐剂的制备目的及要求掌握弗氏佐剂的制备方法及检验方法。
内容与方法弗氏佐剂是目前最常用的油乳佐剂，根据佐剂中加入或不加入死结核杆菌可分为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂。
在灭活疫菌苗的制备过程中常用油乳佐剂，即“弗氏不完全佐剂”。
下面我们主要介绍弗氏不完全佐剂的制备方法。
一、材料和设备：1、材料：7#白油、硬脂酸铝、司班——80、吐温——80、蒸馏水等。
2、设备：乳化泵、分析天平、离心机（4000r/min）、恒温培养箱、粘度计、高压灭菌锅、量杯、量筒、烧杯、试管、吸管（出液口径2mm）等。
二、方法：使用不同乳化剂和不同的配合比例及乳化方法，决定了制备乳剂的性状和稳定性。
疫苗生产中主要有两种基本方法。
1、剂在水中法此法将乳化剂直接溶于水中，在激烈搅拌下将油加入，可直接生成O/W 乳剂。
若欲得W/O型，可继续加入油，直到发生变型。
该法通常用匀浆器或胶体磨，高速搅拌而得到较好的乳剂。
2、剂在油中法此法将乳化剂溶于油相，将油相直接加入水相中得O/W，如水相直接加入油相，得到W/O型，如欲得O/W，继续加入至变型。
该法制成的乳剂，一般均匀颗粒直径在0.5um左右，比较稳定。
3、油乳剂配方免疫实验动物用的佐剂配方：7#白油85ml，司班——80 15ml混合后经除菌过滤而成为弗氏不完全佐剂（FIA）；如向其中加入0.5mg/ml死结核杆菌即为弗氏完全佐剂（FCA）。
使用时，将含抗原的水相，与上述任一佐剂等量混合，用力振摇即可成为均匀的乳剂。
疫苗生产用乳剂配方：7#白油90ml，司班——80 10ml，混合后加2ml的吐温——80和1.5g的硬脂酸铝，经高压灭菌后备用，使用前将配好的油佐剂与抗原水相1∶1混合，强力振摇，或通过胶体磨搅拌即可制成性状良好的乳剂疫苗。
大量生产乳剂疫苗时，可将94%白油与6%司班——80混合后加入2%的硬脂酸铝，经灭菌后为油相；抗原液加入2%的吐温——80为水相。
兽医生物制品学第三章灭活剂保护剂和免疫佐剂
三、影响灭活作用的因素
1、灭活剂特异性：石炭酸对真菌和病毒效果差，甲醛 最常用。 2、微生物种类和特性 3、灭活剂浓度（一定要适合） 4、灭活温度（具体不同病原体或毒素，其灭活时间和 温度不一致） 5、灭活时间 6、灭活PH值 7、有机物存在
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第二节 保护剂（稳定剂）
保护剂：又称稳定剂（stabilizer） ，是指一类能防止生 物活性物质在冷冻真空干燥时受到破坏的物质。（指对疫 苗生产、血清制备等） 保护剂用途（不同用途加不同保护剂, 主要针对活的微生 物或细胞）
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一些常用的冷冻干燥保护剂
分类
保护剂
复合物 糖类 盐类 醇类 酸类 聚合物
脱脂乳、明胶、蛋白质、蛋白胨、糊精、血清、甲基纤维素等 蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖等 乳酸钙、谷氨酸钠、氯化钠、氯化钾、醋酸铵、硫代硫酸钠等 山梨醇、甘油、甘露醇、肌醇、木糖醇等 柠檬酸、酒石酸、氨基酸等 葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等
佐剂（旧概念）：当一种物质先于抗原或与抗原混合或同 时注射于动物体内，能非特异性地改变或增强机体对该抗 原的特异性免疫应答,发挥其辅佐作用的物质.
以前作为佐剂使用时没有免疫原性，但现在有所改变，如 IL-2是佐剂和IL-8一类细胞因子佐剂却不一样, 具有免疫调 节和免疫增强作用,单独使用时却具有免疫原性。
毒素（TT）等；脂磷壁酸（LTA）；维生素B12等。
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氢氧化铝胶 (铝胶）
合成方法: （1）用铝粉加烧碱合成法
2Al(OH)3+12H2O+3H2SO4→Al2(SO4)3·18H2O A12(SO4)3·18H2O+6NaOH→2Al(OH)3+2Na2SO4+18H2O
兽医生物制品电子教案
第一章绪论第一节兽用生物制品的概念与命名原则一、兽用生物制品与兽用生物制品技术（一）兽用生物制品的概念兽用生物制品：是根据免疫学原理，利用微生物、寄生虫及其代谢产物或免疫应答产物制备的一类物质。
这类物质专供相应疾病的诊断、预防和治疗之用。
狭义上讲，兽用生物制品主要指疫苗、免疫抗血清及诊断制剂；广义上讲，兽用生物制品还应包括各种血液制剂、抗生素、非特异性免疫制剂等。
由此可见，兽用生物制品的含义和内容也将随着科学技术的发展而成为兽用保健制品。
（二）兽用生物制品技术概念与内容兽用生物制品技术：兽用生物制品技术是在动物微生物、免疫学、动物传染病的基础上，采用生物学、生物化学及生物工程等技术和方法，研究和制备兽用生物制品，用以解决动物疫病防治的一门新兴应用技术。
主要内容包括两个方面：1是兽用生物制品的生物学，即研究病原微生物及宿主的关系。
2是研究兽用生物制品的工艺学、制造、保藏、使用方面的内容。
二、兽用生物制品的命名原则农业部规定的《兽医新生物制品管理办法》有10条原则1、命名原则：明确，简练，科学。
2、不用商品名和代号。
3、一般制品为：动物名称+病名+制品名称，如猪瘟兔化弱毒疫苗。
4、共患病不列出动物名：如破伤风类毒素或抗毒素。
5、疫苗名称要规范，主动免疫的菌苗，疫苗统称为疫苗。
6、分活疫苗和死疫苗。
7、同一类不同毒株的疫苗，全称后面加括号注明，如猪丹毒活疫苗（GC42）--是哈尔滨兽研所通过豚鼠370代选育后，再通过雏鸡42代选育成的弱毒疫苗。
猪丹毒活疫苗（G4T10）是江苏兽研所，将370代的菌，再通过培养基里加锥黄素，50代选育的。
8、联苗：动物名称+若干病名+X联苗，如猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联疫苗。
简称猪三联。
9、多价苗：动物名+病名+若干血清型+X价疫苗，如仔猪黄白痢K88，K99，P987三价弱毒疫苗。
10、生物制品制造方法不注明，属企业秘密。
第二节兽用生物制品的分类及应用一、兽用生物制品的分类兽用生物制品种类繁多，只有进行分类，才便于学习和实践中使用和区别，常规的分类有两种，1是按性质和用途分类；2是按物理和制造进行分类，下面先讲第一种分类方法。
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兽医生物制品学实验教学讲义实习一、弗氏佐剂的制备目的及要求掌握弗氏佐剂的制备方法及检验方法。
内容与方法弗氏佐剂是目前最常用的油乳佐剂，根据佐剂中加入或不加入死结核杆菌可分为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂。
在灭活疫菌苗的制备过程中常用油乳佐剂，即“弗氏不完全佐剂”。
下面我们主要介绍弗氏不完全佐剂的制备方法。
一、材料和设备：1、材料：7#白油、硬脂酸铝、司班——80、吐温——80、蒸馏水等。
2、设备：乳化泵、分析天平、离心机（4000r/min）、恒温培养箱、粘度计、高压灭菌锅、量杯、量筒、烧杯、试管、吸管（出液口径2mm）等。
二、方法：使用不同乳化剂和不同的配合比例及乳化方法，决定了制备乳剂的性状和稳定性。
疫苗生产中主要有两种基本方法。
1、剂在水中法此法将乳化剂直接溶于水中，在激烈搅拌下将油加入，可直接生成O/W 乳剂。
若欲得W/O型，可继续加入油，直到发生变型。
该法通常用匀浆器或胶体磨，高速搅拌而得到较好的乳剂。
2、剂在油中法此法将乳化剂溶于油相，将油相直接加入水相中得O/W，如水相直接加入油相，得到W/O型，如欲得O/W，继续加入至变型。
该法制成的乳剂，一般均匀颗粒直径在0.5um左右，比较稳定。
3、油乳剂配方免疫实验动物用的佐剂配方：7#白油85ml，司班——80 15ml混合后经除菌过滤而成为弗氏不完全佐剂（FIA）；如向其中加入0.5mg/ml死结核杆菌即为弗氏完全佐剂（FCA）。
使用时，将含抗原的水相，与上述任一佐剂等量混合，用力振摇即可成为均匀的乳剂。
疫苗生产用乳剂配方：7#白油90ml，司班——80 10ml，混合后加2ml的吐温——80和1.5g的硬脂酸铝，经高压灭菌后备用，使用前将配好的油佐剂与抗原水相1∶1混合，强力振摇，或通过胶体磨搅拌即可制成性状良好的乳剂疫苗。
大量生产乳剂疫苗时，可将94%白油与6%司班——80混合后加入2%的硬脂酸铝，经灭菌后为油相；抗原液加入2%的吐温——80为水相。
乳化时，按容量计算，油相与水相1∶1配制，先缓速混合，再通过乳化泵或胶体磨充分乳化，可获得稳定的油包水乳剂苗。
但这种配方制的乳剂苗一般较粘稠，而且必须充分掌握混入抗原时的速度，在慢速搅拌油相的同时，缓慢倾入水相混合，然后再高速通过胶体磨或乳化泵充分乳化，否则易于分层。
如欲降低乳剂的粘稠度，可以增加油相的比例，例如以水与油之比达1∶2或1∶3，最高可达1∶4时，亦可获得良好的W/O乳剂疫苗。
或者将粘稠的W/O乳剂疫苗，再加2%吐温——80生理盐水，通过搅拌或乳化泵乳化，可制成双向乳剂疫苗（水—油—水乳剂）也可直接制备双向乳剂苗（或称多型乳剂Multiple emulsion abjuvant）。
双向乳剂苗的优点是：粘稠度低、在注射部位易分散、局部反应轻微及佐剂效应良好等。
三、油乳剂的检验：油乳剂检验项目包括乳剂类型检查、黏度测定、稳定性测定、粒度大小及分布的检测等，生产实际中以黏度测定和稳定性测定为主。
1、乳剂类型的测定：测定方法有多种。
①Robertson的染料法。
用“SudanⅡ油溶性染料”和“亮蓝FCF”水溶性染料，分别加入两份乳剂中，轻轻摇动，若是整个乳剂染油溶性染料即外相为油（W/O），若整个乳剂染水溶性染料即外相为水（O/W）。
②冲淡或滴于冷水表面。
此法是根据乳状液是为其外相所冲淡，将两滴乳状液放在一玻片上，于一滴中加入水，另一滴加入油，轻轻搅拌，按照易与乳状液搀合的物质（油或水）来确定外相的性质。
③电导法。
因为多数的油皆是不良导体，而水则是良导体，用万用表（10K1/2W）把两级分开插入乳剂中，能导电者外相为水，为水包油乳剂；不能导电者外相为油，为油包水乳剂。
2、黏度测定：不同黏度的佐剂有不同的测定装置，低黏度佐剂可用毛细管粘度计测定。
黏度大的乳剂测定方法有堕球法和转筒法等。
适于测乳剂苗用的是流出法，用Saybolt粘度计。
此型粘度计基本结构是一个有套层的管子，上面有溢流的坑道，底下有流出的小孔，小孔长1.225cm，孔径0.1765cm，管中容纳60ml液体，在地心重力场中流入一个特别的小瓶所需时间，以秒计数表示之。
为了简便，可用1ml吸管，出口内径1.2mm，在室温下吸满1ml乳剂，垂直放出0.4ml 所需时间作为黏度单位，适宜于注射用乳剂的黏度以2——6s左右为宜，如超过10——15s，注射时就比较困难。
3、乳剂稳定性的测定：①加速老化法。
高温37℃贮存10——30天不破乳，②离心加速分层法。
可通过离心乳剂的方式测定。
将乳剂放入试管中，以3000r/min离心15min，不分层的乳剂苗，保存1年以上无破乳现象。
4、粒度大小及分布的测定：用显微镜直接观察，或用光散射法和透射法或以测微尺测定之。
以直径10um均匀颗粒的乳剂为较好。
四、对油乳剂苗安全性的评价：1975年在WHO免疫学会上，一个科学工作小组对使用油乳剂苗进行了讨论，认为用矿物油佐剂会引起全身性病状，诱发各种自身免疫紊乱及促进变态反应。
但缺乏充足资料加以证实，尤其缺乏佐剂成分的代谢过程和在动物体内长期毒性及病理学的研究。
现有结果还不能说明他们的推论。
实际在人们接种油苗后的长期观察过程中，尚未发现不良副作用，只有偶然发生局部无菌脓肿的例子。
因而，学者们认为，动物抗体对外来物质总是要发生反应的，注入佐剂也不例外，只是应对反应时间的长短、有害或有利、反应的严重程度等加以分析。
实际上减轻局部反应，还可通过选择更好的材料和最佳乳剂配方来实现。
如前所述，一些学者用精制花生油与化学纯试剂，研制成功“佐剂——65”。
经实验证明，这种佐剂具有矿物油所没有的优点，注射“佐剂——65”两个月后，几乎能完全被代谢，从而可以减少过度刺激，排除了因长期贮留可能产生的有害作用，产生的抗体水平与矿物油佐剂相似。
佐剂——65注射于豚鼠、小鼠及猴，没有发现短期（急性）和长期（慢性）毒性，在家兔体内也没有发现有致畸作用。
虽然曾有人报告皮下注射佐剂——65及矿物油佐剂于小鼠，尤其对雄鼠，长期观察有增生赘生物（瘤），但大量病理学研究表明，这些物质都非致瘤原，而是由于一种已被充分认识的理化改变作用，常见于某些啮齿类动物，与人无关，因为注射蒸馏水，甚至反复穿刺小鼠皮肤，也会发生这种致赘生物作用。
报告还说人体注射矿物油佐剂后18年，注射花生油佐剂10年，随访调查表明，对赘生物的发生并无增加，也没有其他临床上重大的不良反应。
此外，近年来在研究乳剂中还应注意一个问题，即制乳剂苗无论是用矿物油或用花生油，均不能含有脂酶和酯酶，因为，这些酶能使二缩甘露醇及花生油降解，从而释放出脂肪酸。
脂肪酸是有毒性的，会引起注射部位的严重反应，导致形成硬结或脓肿。
应特别注意在用花生油时，必须精制以除去花生蛋白，决不允许含有黄曲霉毒素。
矿物油佐剂的缺点是：①矿物油在组织中因不能代谢而长期存在，造成局部组织损伤；②有污染致癌性多芳香烃化合物的危险，限制了弗氏佐剂只应用于实验动物及一些兽用疫苗。
对乳化佐剂，即水——油——水（W/O/W）乳剂，是将水油剂疫苗再乳化到一种生物学安全的去污剂中（Tween ——80）。
双乳化佐剂与一次乳化佐剂具有同等抗原性而易于吸收，更为稳定，粘性较小，只是在注射部位引起小硬结。
应用甘油、卵磷脂佐剂，由于这种佐剂成分是机体的正常代谢物质，且比佐剂——65更易于乳化，安全有效。
因此，使用花生油、甘油、卵磷脂佐剂对组织无反应性。
一种好的乳剂苗，应该是W/O或O/W型，黏度较低，颗粒大小均匀，稳定性良好，呈乳白色。
作业：试述油乳剂的检验方法。
实习二、仔猪大肠杆菌灭活疫苗的制备目的及要求掌握大肠杆菌灭活疫苗的制备方法；学会对灭活疫苗的检验方法。
内容与方法一、菌种的选择致病性强大的菌种，常常是在疾病流行时自患病动物体内分离的，一般具有良好的抗原性。
当从患病动物分离到病原后，首先须进行纯粹性检验，证明分离物确实不杂有其他微生物，而后进行致病性测定。
如果这种病原能感染实验动物，则应首先在实验动物体上检测其致病力及抗原性，是为初选。
初选入选者在用原宿主动物测试。
在测定病原的致病力时，常常以能致死一半实验动物所需的细菌数来表示，即所谓半数致死量（LD50）。
进行测定时，应当同时设有只接种无菌培养基或生理盐水的阴性对照动物，同时还应设有接种已知致病力的同种微生物的阳性对照动物。
设立阴性对照的目的是为了要阐明所用实验动物是否正常健康，饲养管理是否得当。
设立阳性对照的目的是要阐明被接种动物对接种物的敏感性，以免因实验条件不完善而得到错误的结论。
如果阴性对照发病或死亡，实验不能成立。
如果阳性对照不病不死，说明所用的实验动物不适宜，或存在其他意外干扰因素。
在测定时，将培养物连续递进十倍稀释，将不同稀释度的培养物定量接种一定数量的动物，按被接种动物在规定日期内发病或死亡数计算LD50，以判断接种物的致病力，数字愈小说明致病力愈强。
LD50的计算方法，细菌或病毒培养物进行不同稀释后，各接种小鼠5只，每只接10-7组的积累死亡数=0+2+4+5=11。
而高稀释度的积累生存数是几个低稀释度组的生存数迭加而成。
表中10-10组的积累生存数=0+1+3+5=9。
接种10-8稀释液死亡率为86%，接种10-9稀释液时死亡率为33%，可以想到50%的死亡终点应在10-8——10-9之间，只要将此终点与10-8间的距离比算出即可得到。
所以先计算出此距离比而后计算出LD50的对数，即可求出LD50值，下面是常用的Reed-Muench计算方法。
高于50%死亡率的死亡率-50%距离比=高于50%死亡率的死亡率-低于50%死亡率的死亡率86%-50%=86%-33%LD50值的对数之负数=死亡率高于50%的稀释度的对数之负数+距离比×（稀释系数之间的距离）=8+0.68×1即㏒LD50=-8.68即每0.1ml中含有108.7个LD50，或每1ml中含有109.7个LD50，也就是LD50=10-9.7ml。
通常以对数表示时，仅用小数点后一位数，如本例中LD50=10-9.7，不用LD50=10-9.68。
计算LD50终点时也可以应用Karber氏方法，同样得到准确的结果。
连续稀释系数各稀释度组死亡率之和LD50值的对数=1/2×之间的距离+最低稀释系数之对数-100+86+33 100 =1/2×1+（-7）- =-6.5-2.19=-8.69100即每0.1ml中含有108.7个LD50，或每1ml中含有109.7个LD50，也就是LD50=--10-9.7ml。
在测定时如果不是用10倍系列稀释，则稀释系数之间的距离也必须随之改变，乘以倍数的㏒10的系数。
在2倍系列稀释时这个字为0.301，在5倍系列稀释时为0.699。